重组蛋白质分离纯化

在结构生物学研究中，重组蛋白表达纯化至关重要！ ——更多更快更纯
2014-7-22
2014-7-22
凝胶过滤
疏水层系
离子交换
亲和层系
反相层析
检测方法： A280nm紫外吸收值； 考马斯亮蓝； SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
2014-7-22
A280检测原理：蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构， 在紫外280nm波长处有最大吸收峰，其光吸收值与蛋白质浓度成正比，故可以 用280nm波长吸收值大小来测定蛋白质含量 考马斯亮蓝检测原理：每个分子含有两个SO3H 基团，偏酸性，与蛋白质的碱 性基团结合。 考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质 结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收 值与蛋白质含量成正比。 考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可 以用来对电泳条带染色。
——重组蛋白质的分离纯化
2014-7-22
选择要研究的蛋白 克隆表达目的蛋白 分离纯化重组目的蛋白 测定蛋白溶解性稳定性
大量纯化表达目的蛋白
核磁 晶体 冷冻电镜 …
通过各种结构生物学方法解析目 的蛋白结构
蛋白功能研究 结构与功能的关系
药物开发
2014-7-22
蛋白浓度：10-15 mg/ml 蛋白纯度：>95% 蛋白构象均一：单体，二体，多聚体 蛋白具有活性
2014-7-22
不论经过多少步纯化，最后都要根据SDS-PAGE来检测蛋 白的纯度！！！
2014-7-22
Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有His（组氨酸）标签的碱性蛋白 蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸(碱性氨基酸)。在蛋白上样 后，带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里，其他的杂蛋白流 出。Ni-NTA纯化介质是Ni离子金属螯合介质。 His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点 是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶 性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。
SDS-PAGE原理：聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量的交联剂N， Nˊ-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素）和加速剂（N， N， NˊNˊ-四甲基乙二胺）的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶。 凝胶对样品分子筛效应：电场中，颗粒小、呈球形的样品分子泳动速度快；颗 粒大、形状不规则的分子通过凝胶空洞时受到的阻力大，泳动慢。
组氨酸
咪唑
富集作用强！
2014-7-22
2014-7-22
蛋白质在溶液中有两性电离现象。假设某一溶液中含有一种蛋白质。当pI=pH时该蛋白质极性基团解离 的正负离子数相等，净电荷为0，此时的该溶液的是pH值是该蛋白质的PI值。某一蛋白质的pI大小是特 定的,与该蛋白质结构有关，而与环境pH无关。 在某一pH溶液中当pH>pI时该蛋白质带负电荷。反之pH<pI时该蛋白质带正电荷。pH=pI时该蛋白质不带 电荷
蛋白带负电，ห้องสมุดไป่ตู้离子交换柱；蛋白带正电，阳离子交换柱
低盐上样，高盐洗脱 离子交换具有浓缩效应
2014-7-22
净化或充分稀释的样品
捕获阶段
中度纯化 精细纯化
亲和层系
离子交换
亲和层系
↓
↓
离子交换
凝胶过滤
凝胶过滤
凝胶过滤
2014-7-22
更 多 ， 更 快 ， 更 纯 蛋 白 纯 化 一 般 采 用 三 步 纯 化 策 略 蛋 白 纯 化 需 要 尝 试 不 同 的 方 法 组 合 方 案 蛋 白 纯 化 对 于 结 构 生 物 学 至 关 重 要