双水相萃取实验

一、双水相系统的相图绘制

1.实验目的

了解制作双水相系统的相图的方法，加深对相图的认识。

2.实验原理

相图是研究两水相萃取的基础，双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。图1是典型的高聚物-高聚物-水双水相体系的直角坐标相图，两种聚合物A、B以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成、度的两相，上相组成用T点表示，下相组成用B点表示，由图1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。结线上方是两相区，下方为单相区，若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B，T、B量的多少服从相图的杠杆定律。即T和B相质量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。又由于两相密度相差很小，故上下相体积之比也近似等于系线上MB与MT线段长度之比。

图1 A-B-水双水相体系相图

O aqueous two-phase system Figure 1 The phase diagram of the A-B-H

2

3.实验器材和试剂

（1）器材：电子台秤，漩涡混合器，大试管，滴定管，密度计，温度计。（2）试剂：聚乙二醇，硫酸铵，硫酸镁。

4.操作方法

（1）溶液的配制

配制40%的盐（硫酸铵或硫酸镁）溶液

配制40%的聚乙二醇溶液，液体聚乙二醇可用纯溶液。

（2）相图的制作

精确称取一定质量（0.7000g 左右）PEG 溶液于大试管中，按表1所列第1列数据，加入0.5mL 去离子水，用滴定管缓慢滴加已配好的40%的盐溶液，并不断在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内液体出现浑浊为止。记录盐溶液的加量(g)。然后，按表格所列第2列数据加入水，溶液澄清，继续向试管中滴加盐溶液并不断混匀，直至再次达到浑浊，如此反复操作。计算每次达到浑浊时，PEG 和盐在系统总量中的质量分数，将实验数据填入表中，以PEG 的质量分数为纵坐标，某种盐的质量分数为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。

表1相图制作表

编

号 水

/g (NH 4)2SO 4溶液加量/g 纯(NH 4)2SO 4累计量/g 溶液累计总量/g (NH 4)2SO 4质量分

数/% PEG 质量分数/% 1 0.5 3.1315 0.895 4.3786 20.4 4.79 2 0.3 2.1792 1.5186 5.9511 21.85 3.02 3 0.3 2.0456 2.1 9.2867 22.65 2.26 4 0.3 3.1372 3.0 12.6738 23.68 1.65 5 0.5 6.0769 4.7 19.3276 24.52 1.08 6 0.5 6.1909 6.5 26.0138 25.02 0.8 7 0.5

6.8585

8.5

33.4596

25.32

0.62

根据以上数据以(NH 4)2SO 4质量分数为横坐标，以PEG 质量分数为纵坐标即可做出相图。

二、双水相系统比例的选择

根据相图，选择五个成相比例。

三、蛋白酶酶活标准曲线的绘制—— Folin 酚法或紫外分光光度法

PEG4000与MgSO4双水相图

y = 0.0995x 2 - 5.3887x + 73.334

2012345

6

20

21

22

2324

25

26

MgSO4%

P E G 4000%

紫外分光光度法测蛋白酶酶活

1．原理

蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。

2．试剂和溶液

2.1三氯乙酸c=0.4mol/L：称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2.2氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L

2.3盐酸溶液c（HCl）＝1 mol/L及0.1 mol/L

1mol/L HCl:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。

0.1mol/L HCl：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。

2.4缓冲溶液

a.磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶

称取磷酸氢二钠（Na

2HPO

4

·12H

2

O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH

2

PO

4

·12H

2

O）0.5g，

加水溶解并定容至1000mL。

b.乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶

甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。

c.硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶

甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。

上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。

2.5 10g/L酪素溶液

称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，