肠道杆菌的分离鉴定
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
the inoculated agar plate 4. Invert the plates and incubate at 37oC over night (18-24 h)
实验步骤：
• 标记：皿底注明细菌、时间、纸片代号 • 涂菌：用棉签蘸取含菌培养物，于平板表面均匀
涂布 • 摆放药物纸片：用镊子将不同药物纸片等距离摆
双糖培养基分上下两层。上层为固体含有铁和乳糖，下层含 有葡萄糖的半固体培养基，上下层均含酚红指示剂。接种细菌 后通过以下几点鉴别细菌： 1）是否分解乳糖和葡萄糖：糖分解后产酸使酚红变黄，或糖 分解产酸产气使酚红既变黄又见气体（可使培养基断裂后出现 气泡）产生； 2）是否产生H2S：如果产生H2S ，能与铁生成黑色沉底； 3）是否有动力：在半固体中有动力的细菌，可使穿刺接种线 模糊，无动力的细菌，穿刺接种线保持清晰。
初步鉴 定
接种显 色培养 基
增菌
进一步 鉴定
接种选择 培养基
接种双糖和 尿素培养基
（CB平板、SS平 板、EMB平板）
药敏 试验
粪便标本肠道致病菌鉴别流程
标本
鉴别培养基
（SS培养基）
生化反应 （双糖管）
血清学鉴定
SS 平板挑取可疑菌落2个 (无色,透明,小菌落)
接种双糖管
培养,观察
二、粪便标本接种
注意： ① 诊断血清应多放一些，防止观察中干涸 ② 细菌与血清混合时，动作要轻，防止迸溅
• Main purposes: – As a guide for treatment – As an epidemiological tool
Disk diffusion method
AM
AM
S
SMX
S
SMX
Sa
TH
1. Streak the swab on the agar plate
2. Leave 5-10 min to dry the surface of agar 3. Place the appropriate drug-impregnated disk on surface of
动力
+
H2S产生
-
尿素利用 -
伤寒沙 门氏菌
+ + +/-
甲型副伤 寒沙门氏 菌
-
⊕
+
乙型副 伤寒沙 门氏菌
-
⊕
+
+/-
Βιβλιοθήκη Baidu
++++
-
-
痢疾志贺 变形
氏菌
杆菌
-
-
+
⊕
-
+
-
++
-
+
Urea
Ammonia Phenol red
Red color
五、IMViC 试验
① Indol Test（吲哚试验）寇氏试剂（对二甲基氨基苯甲醛）
300
≤13
14~16
≥17
≤28
－
≥29
≤12
13~14
≥15
≤12
13~14
≥15
≤11
12~14
≥15
≤13
14~22
≥23
≤15
16~20
≥21
≤12
13~16
≥17
七、肠道杆菌血清学鉴定
原理：细菌作为颗粒性抗原在相应抗体作用下可形成肉 眼可见的凝集颗粒。
可疑菌落 -阴性
可疑菌落 +阳性
。 • V-P试验：加6%a-萘酚0.6ml，混匀后再滴加40%KOH
0.2ml，充分振摇5-10min，静置一段时间，观察结果。 • 枸橼酸盐利用试验：阳性由绿色变为蓝色。
六、抗生素敏感性试验—纸片扩散法
Antibiotic susceptibility test-disk diffusion test
枸橼酸 磷酸二氢氨
溴麝香草酚兰
产气肠杆菌代谢 碱
绿色 深蓝色
IMViC试验 ：四种生化反应试验的统称。
吲哚试验
甲基红试验 V-P试验 枸橼酸盐利用试验
鉴别大肠埃希氏菌 和产气肠杆菌
E.coli E.a
I
M
V
C
蛋白胨水 （蓝色盖） E.coli
蛋白胨水 （蓝色盖） E.a
葡磷胨水 （绿色盖） E.coli
标本
SS培养基
②
①
P
N ③
Name time 小辫法
④ 分区划线法
注意：每划完一个区进行下一区之前取菌环要灭菌
粪便标本接种： 标本：1）病人粪便（阳性标本）； 2）正常人粪便（阴性） 培养基：SS平板 操作：将SS平板上分两个区，分别接种病人和正 常人标本。 要求：使用正确的画线方法，必须培养出单个菌落以备后续实
肠道杆菌的分离鉴定
Isolation and Identification of Enterobacteria
1
➢肠道杆菌分离鉴定程序简介 ➢粪便标本接种 ➢可疑菌落形态学检查 ➢接种可疑菌落至双塘培养基 ➢抗生素敏感性试验，IMViC试验 ➢肠道血清学鉴定
一、肠道杆菌分离鉴定程序简介
标本采集
脓血便直接 涂片镜检
葡磷胨水 （绿色盖） E.a
葡磷胨水 （绿色盖） E.coli
葡磷胨水 （绿色盖） E.a
枸橼酸盐水 （红色盖） 磷酸二氢氨
E.coli 枸橼酸盐水 （红色盖） 磷酸二氢氨
E.a
大肠杆菌（++--） 产气杆菌（--++）
注意： ① 拿试管时不要只拿盖子 ② 避免交叉污染
IMViC实验结果
• 吲哚试验：滴加寇氏试剂2-3滴，静置观察。 • 甲基红试验：滴加甲基红试剂2-3滴，轻轻摇动观察结果
双糖-铁培养基
Lactose Agar 1.5% Sodium thiosulfate (硫代硫酸钠，产生H2S源) Ferrous sulfate (硫酸亚铁，产生H2S指示剂) Phenol red (酚红，pH指示剂) Glucose Phenol red Agar 0.3%
实验材料（菌种）：可疑单个菌落；
药物 AM
参考菌 株
E.coli
耐药 ≤13
中介
敏感
14-16 ≥17
S SMX
S.a
≤28
E.coli ≤11
S.a
≤3
-
≥29
12-14 ≥15
14-22 ≥23
细菌对药物敏感性参照表（举例）
抗微生物药 药名缩写
质控菌株
纸片含药
抑菌环直径（mm）
量（μg） 耐药（R） 中介（I） 敏感（S）
大肠埃希氏菌
验使用；两种标本不可跨区接种。
病人标本 正常人标本
划线方法
要求形成的菌落形态
三、可疑菌落的形态学检查
粪便标本接种结果观察： 病原菌:菌落较小,无色（淡黄色）,透明（半 透明） 非致病菌:菌落较大,红色
四、双糖试验（接种可疑菌落至双糖培养基）
实验目的：通过双糖实验了解肠杆菌科的初步建立方法。 实验原理：
色氨酸酶
蛋白胨
吲哚
玫瑰吲哚
② Methyl red test（甲基红实验）
葡萄糖 分解
丙酮酸
甲酸、乙酸等，pH 下降，甲基红变红
③葡萄V糖og分e解a-P丙ro酮s酸ka脱u羧er乙te酰s甲t 基（甲V醇-P碱test二）乙酰胍基
红色化合物
④ Citrate utilization test （枸橼酸盐利用实验）
放在琼脂表面 • 培养18-24h后，观察结果 • 注意：镊子每次摆放药物纸片后都需进行灭菌。
抗生素敏感试验接种
AM
S
SMX
Th 090408 XXY
注意： ① 涂布均匀 ② 纸片摆放距离均等 ③ 平皿正放
抗生素敏感试验结果
用直尺量取抑菌环的直径，对照药物敏感性参照表， 即可判断该细菌对某抗生素的敏感性。
实验步骤：用接种针取可疑菌落（上节课SS培养 基中生长的单个菌落）接种至双糖培养基。
穿刺接种法接种：接种针从培养基中心刺入双糖培 养基下层约占下层2/3处，将针原处返回，提至斜 面再换线。
实验结果：37℃培养18-24h后观察结果。
双糖-铁试验结果及尿素利用实验结果
项目
大肠埃 希氏菌
乳糖利用 ⊕
葡萄糖利用 ⊕
氨苄西林
AM
ATCC25922 金黄色葡萄球菌
10
ATCC25923
大肠埃希氏菌
庆大霉素
GM
ATCC25922 金黄色葡萄球菌
10
ATCC25923
链霉素
S
大肠埃希氏菌 ATCC25922
10
金黄色葡萄球菌
红霉素
E
ATCC25923 肺炎链球菌
15
ATCC49619
磺胺甲基异 噁唑
SMX
金黄色葡萄球菌 ATCC25923
实验步骤：
• 标记：皿底注明细菌、时间、纸片代号 • 涂菌：用棉签蘸取含菌培养物，于平板表面均匀
涂布 • 摆放药物纸片：用镊子将不同药物纸片等距离摆
双糖培养基分上下两层。上层为固体含有铁和乳糖，下层含 有葡萄糖的半固体培养基，上下层均含酚红指示剂。接种细菌 后通过以下几点鉴别细菌： 1）是否分解乳糖和葡萄糖：糖分解后产酸使酚红变黄，或糖 分解产酸产气使酚红既变黄又见气体（可使培养基断裂后出现 气泡）产生； 2）是否产生H2S：如果产生H2S ，能与铁生成黑色沉底； 3）是否有动力：在半固体中有动力的细菌，可使穿刺接种线 模糊，无动力的细菌，穿刺接种线保持清晰。
初步鉴 定
接种显 色培养 基
增菌
进一步 鉴定
接种选择 培养基
接种双糖和 尿素培养基
（CB平板、SS平 板、EMB平板）
药敏 试验
粪便标本肠道致病菌鉴别流程
标本
鉴别培养基
（SS培养基）
生化反应 （双糖管）
血清学鉴定
SS 平板挑取可疑菌落2个 (无色,透明,小菌落)
接种双糖管
培养,观察
二、粪便标本接种
注意： ① 诊断血清应多放一些，防止观察中干涸 ② 细菌与血清混合时，动作要轻，防止迸溅
• Main purposes: – As a guide for treatment – As an epidemiological tool
Disk diffusion method
AM
AM
S
SMX
S
SMX
Sa
TH
1. Streak the swab on the agar plate
2. Leave 5-10 min to dry the surface of agar 3. Place the appropriate drug-impregnated disk on surface of
动力
+
H2S产生
-
尿素利用 -
伤寒沙 门氏菌
+ + +/-
甲型副伤 寒沙门氏 菌
-
⊕
+
乙型副 伤寒沙 门氏菌
-
⊕
+
+/-
Βιβλιοθήκη Baidu
++++
-
-
痢疾志贺 变形
氏菌
杆菌
-
-
+
⊕
-
+
-
++
-
+
Urea
Ammonia Phenol red
Red color
五、IMViC 试验
① Indol Test（吲哚试验）寇氏试剂（对二甲基氨基苯甲醛）
300
≤13
14~16
≥17
≤28
－
≥29
≤12
13~14
≥15
≤12
13~14
≥15
≤11
12~14
≥15
≤13
14~22
≥23
≤15
16~20
≥21
≤12
13~16
≥17
七、肠道杆菌血清学鉴定
原理：细菌作为颗粒性抗原在相应抗体作用下可形成肉 眼可见的凝集颗粒。
可疑菌落 -阴性
可疑菌落 +阳性
。 • V-P试验：加6%a-萘酚0.6ml，混匀后再滴加40%KOH
0.2ml，充分振摇5-10min，静置一段时间，观察结果。 • 枸橼酸盐利用试验：阳性由绿色变为蓝色。
六、抗生素敏感性试验—纸片扩散法
Antibiotic susceptibility test-disk diffusion test
枸橼酸 磷酸二氢氨
溴麝香草酚兰
产气肠杆菌代谢 碱
绿色 深蓝色
IMViC试验 ：四种生化反应试验的统称。
吲哚试验
甲基红试验 V-P试验 枸橼酸盐利用试验
鉴别大肠埃希氏菌 和产气肠杆菌
E.coli E.a
I
M
V
C
蛋白胨水 （蓝色盖） E.coli
蛋白胨水 （蓝色盖） E.a
葡磷胨水 （绿色盖） E.coli
标本
SS培养基
②
①
P
N ③
Name time 小辫法
④ 分区划线法
注意：每划完一个区进行下一区之前取菌环要灭菌
粪便标本接种： 标本：1）病人粪便（阳性标本）； 2）正常人粪便（阴性） 培养基：SS平板 操作：将SS平板上分两个区，分别接种病人和正 常人标本。 要求：使用正确的画线方法，必须培养出单个菌落以备后续实
肠道杆菌的分离鉴定
Isolation and Identification of Enterobacteria
1
➢肠道杆菌分离鉴定程序简介 ➢粪便标本接种 ➢可疑菌落形态学检查 ➢接种可疑菌落至双塘培养基 ➢抗生素敏感性试验，IMViC试验 ➢肠道血清学鉴定
一、肠道杆菌分离鉴定程序简介
标本采集
脓血便直接 涂片镜检
葡磷胨水 （绿色盖） E.a
葡磷胨水 （绿色盖） E.coli
葡磷胨水 （绿色盖） E.a
枸橼酸盐水 （红色盖） 磷酸二氢氨
E.coli 枸橼酸盐水 （红色盖） 磷酸二氢氨
E.a
大肠杆菌（++--） 产气杆菌（--++）
注意： ① 拿试管时不要只拿盖子 ② 避免交叉污染
IMViC实验结果
• 吲哚试验：滴加寇氏试剂2-3滴，静置观察。 • 甲基红试验：滴加甲基红试剂2-3滴，轻轻摇动观察结果
双糖-铁培养基
Lactose Agar 1.5% Sodium thiosulfate (硫代硫酸钠，产生H2S源) Ferrous sulfate (硫酸亚铁，产生H2S指示剂) Phenol red (酚红，pH指示剂) Glucose Phenol red Agar 0.3%
实验材料（菌种）：可疑单个菌落；
药物 AM
参考菌 株
E.coli
耐药 ≤13
中介
敏感
14-16 ≥17
S SMX
S.a
≤28
E.coli ≤11
S.a
≤3
-
≥29
12-14 ≥15
14-22 ≥23
细菌对药物敏感性参照表（举例）
抗微生物药 药名缩写
质控菌株
纸片含药
抑菌环直径（mm）
量（μg） 耐药（R） 中介（I） 敏感（S）
大肠埃希氏菌
验使用；两种标本不可跨区接种。
病人标本 正常人标本
划线方法
要求形成的菌落形态
三、可疑菌落的形态学检查
粪便标本接种结果观察： 病原菌:菌落较小,无色（淡黄色）,透明（半 透明） 非致病菌:菌落较大,红色
四、双糖试验（接种可疑菌落至双糖培养基）
实验目的：通过双糖实验了解肠杆菌科的初步建立方法。 实验原理：
色氨酸酶
蛋白胨
吲哚
玫瑰吲哚
② Methyl red test（甲基红实验）
葡萄糖 分解
丙酮酸
甲酸、乙酸等，pH 下降，甲基红变红
③葡萄V糖og分e解a-P丙ro酮s酸ka脱u羧er乙te酰s甲t 基（甲V醇-P碱test二）乙酰胍基
红色化合物
④ Citrate utilization test （枸橼酸盐利用实验）
放在琼脂表面 • 培养18-24h后，观察结果 • 注意：镊子每次摆放药物纸片后都需进行灭菌。
抗生素敏感试验接种
AM
S
SMX
Th 090408 XXY
注意： ① 涂布均匀 ② 纸片摆放距离均等 ③ 平皿正放
抗生素敏感试验结果
用直尺量取抑菌环的直径，对照药物敏感性参照表， 即可判断该细菌对某抗生素的敏感性。
实验步骤：用接种针取可疑菌落（上节课SS培养 基中生长的单个菌落）接种至双糖培养基。
穿刺接种法接种：接种针从培养基中心刺入双糖培 养基下层约占下层2/3处，将针原处返回，提至斜 面再换线。
实验结果：37℃培养18-24h后观察结果。
双糖-铁试验结果及尿素利用实验结果
项目
大肠埃 希氏菌
乳糖利用 ⊕
葡萄糖利用 ⊕
氨苄西林
AM
ATCC25922 金黄色葡萄球菌
10
ATCC25923
大肠埃希氏菌
庆大霉素
GM
ATCC25922 金黄色葡萄球菌
10
ATCC25923
链霉素
S
大肠埃希氏菌 ATCC25922
10
金黄色葡萄球菌
红霉素
E
ATCC25923 肺炎链球菌
15
ATCC49619
磺胺甲基异 噁唑
SMX
金黄色葡萄球菌 ATCC25923