尿蛋白SDS实验报告

尿蛋白SDS-PAGE分析

一、实验目的与要求

1.掌握SDS-PAGE分析蛋白质组分的原理与实验操作技术

2.熟悉肾病患者尿蛋白组分的特征

3.了解实验设计对照组和空白组的意义

4.了解临床实验样品的获取应符合医学伦理学规范

二、实验原理

1.SDS-PAGE 原理

*十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE-

聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程是以过硫酸铵（APS）为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂的氧化还原作用

*丙烯酰胺

丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关

中等毒性，操作注意安全（口罩手套通风等）

*甲叉双丙烯酰胺

丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺聚合成带有酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个长链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶

*过硫酸铵APS

强氧化剂，单体聚合引发剂

提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺聚合所需的自由基

新鲜配制

*TEMED

通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合

加入TEMED聚合立刻开始，迅速混合凝胶液并灌胶

易燃有腐蚀性，注意操作安全

SDS-PAGE常用于蛋白质分子量测定、蛋白质纯度分析、蛋白质浓度检测、western blot的第一步、蛋白质修饰及免疫沉淀蛋白鉴定ect 。

本次实验利用垂直板SDS-PAGE分析肾病患者的尿蛋白样品。

2. 尿液蛋白与肾脏疾病

尿液蛋白检测为肾病临床诊断重要指标

正常尿液蛋白质<150mg

血浆蛋白质60%尿蛋白非血浆蛋白质40%

尿液蛋白形成主要通过肾小球滤过、肾小管重吸收及肾小管、尿道排泄三大机制完成

包含血浆蛋白质、肾组织蛋白质、尿路蛋白质

血浆蛋白质主要经肾小球滤过及近曲小管重吸收后逸出产生

肾组织蛋白质主要为肾小管细胞分泌或小管细胞破坏后释放漏入尿液所致

尿路蛋白质主要为膀胱、尿道、副腺等分泌或漏至尿液所致

分为选择性和非选择性

选择性蛋白尿指肾小球仍保留一定的分子筛选功能，尿中主要为一些中小分子蛋白如白蛋白、转铁蛋白，没有或极少大分子蛋白

非选择性蛋白尿指肾小球分子筛选功能严重破坏，血浆中不论分子大小能从肾小球滤过膜通过，尿中大中小分子蛋白均有，且有相当大量的大分子蛋白质如IgG、IgA、IgM

*尿蛋白质组分---肾小球滤过膜损伤程度

（1）肾小球性蛋白尿

血液中蛋白由肾小球不正常滤过

白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白G、A、M ect

（2）肾小管性蛋白尿

反映肾小管损伤程度

低分子蛋白，通过肾小球过滤并在肾近曲小管全部或者大部分重吸收

α1-微球蛋白、β2-微球蛋白、视黄醇结合蛋白、th糖蛋白etc

（3）混合性蛋白尿

肾小球和肾小管同时受损

大小蛋白分子同时出现

三、实验所用仪器与试剂

仪器：SDS-PAGE垂直电泳系统、水浴锅、凝胶成像分析仪、脱色摇床

试剂：蛋白质marker，尿蛋白样品（肾病患者，正常人对照），30%丙烯酰胺，浓缩胶缓冲液1mol/L Tris-Cl, ph6.8，分离胶缓冲液1.5mol/L Tris-Cl, ph8.9，10% SDS，10% APS 现配，TEMED 最后加入，电泳缓冲液5x储备液，凝胶上样缓冲液：溴酚蓝，染色液：考马斯亮蓝甲醇，冰醋酸，脱色液：冰醋酸甲醇

四、实验步骤

1.样品制备。尿蛋白样品（浓度1-1.5mg/ml）+样品缓冲液，100度3min

2.电泳槽准备。防止漏水

3.配制分离胶并灌入

4.配制5%浓缩胶并灌入

5.分别灌入分离胶和浓缩胶，插入样品梳

6.加样

7.电泳：浓缩胶电泳电压80-120v，分离胶150-180v

8.卸板，凝胶入染色液

9.染色：摇床室温3-4h

10.洗板

11.脱色：4-8h，条带清晰

12.凝胶成像仪观察记录结果

13.结果分析：

结合肾病患者临床资料对sds-page结果分析

五、实验结果

1.最终所得电泳条带如下左图：

2.结果分析

a)由图可见，所得条带中部略粗，且发现本班其他小组都存在此种情况，可能原因是样品中的白蛋白含量过高而导致条带中部膨大；

b）本次实验结果条带不够整齐，有歪斜的情况，原因是在拔样品梳时，左右手用力不均导致样品槽偏移

c）样品一的电泳条带结果显示，该患者的尿液中蛋白质分子量在白蛋白和肾小球性蛋白所占比例比较多，染色结果比较深；肾小管性蛋白较少，染色浅，根据查阅资料该患者可能患有慢性肾功能衰竭病。

d）样品二的电泳条带结果显示，该患者的尿液中蛋白质分子量在白蛋白所占比例比较多，染色结果深；而在肾小球性蛋白和肾小管性蛋白的比例较少，染色浅，根据查阅资料该患者可能患有肾病综合症。