嗜热芽孢杆菌对美拉德反应的作用初探

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第六期
酿
酒
2010
美拉德模式反应培养基：甘氨酸 0.5%，NaCl 0.3%，葡萄 糖 1%，蒸馏水 100mL，pH 6.5，115℃灭菌 30min；
麸皮固体培养基（发酵培养基）：麸皮 9.9g，葡萄糖 0.1g， 加水 7mL，搅拌均匀后，115℃灭菌 30min；
麸皮浸出汁的制备：小麦麸皮 100g，高温淀粉酶 1500 I- U，加水 500mL，于 100℃蒸煮 10min。待冷却后，加入碱性蛋 白酶 50000IU，于 55℃保持 30min。过滤取上清液，pH6.2。 121℃灭菌 20min，使用前加葡萄糖至终浓度为 10g/L。 1.2 方法 1.2.1 美拉德模式反应
第六期
曹敬华，等：嗜热芽孢杆菌对美拉德反应的作用初探
2010
德反应的发生。 2.3 外界条件对 BG05 促进美拉德反应的影响因素 2.3.1 发酵温度
OD 值
0.6
0.5
0.4
0.3
A
0.2
0.1 ●
0
35℃
● ●
●
45℃
35℃- 55℃ 55℃ 温度 /℃
游离氨基酸含量 mg/100g
25
20
摘 要: 从白云边高温大曲中筛选到一株嗜热芽孢杆菌 BG05，通过美拉德模式反应和除菌灭酶实验发现，
BG05 对美拉德反应有一定的促进作用，存在某种酶能够催化美拉德反应的进行。以麸皮为固体发酵培养基，
研究外界条件对 BG05 促进美拉德反应的影响因素，结果表明：55℃高温发酵、8d 的发酵时间、初始 pH7.0、料
用 250mL 三角瓶装 80mL 美拉德模式反应培养基，将实 验菌 BG05 以 5%的接种量接种到美拉德模式反应培养基中， 以未接菌的培养基为 CK。按照 30℃、40℃、50℃连续升温培 养（培养箱转速为 150r/min），前 2 个温度梯度下各培养 24h， 培养温度提高到 50℃时，以未接菌的空白培养基为对照，每 8h 测定 420nm 下的吸光值。以时间为横坐标，OD 值为纵坐 标，绘制标准曲线，研究 BG05 催化美拉德反应产褐变的能 力。 1.2.2 除菌灭酶
CAO Jing- hua1, FANG Shang- ling1，CHEN Mao- bin1,ZHANG Ming- chun2,XIANG Wei2
(1.Key Laboratory of Fermentation Engineering (Ministry of Education), College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan Hubei 430068, China;2. HubeiBaiyunbian Co.Ltd. , Songzi, Hubei 434200, China)
云边酒典型风味物质提供一定的基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株
嗜热芽孢杆菌 BG05，实验室保藏。 1.1.2 培养基
LB 培养基：蛋白胨 1%，NaCl 1%，酵母浸膏 0.5%，蒸馏 水 100mL，pH7.5，121℃灭菌 20min；
牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl5g， 琼脂 20g，自来水 1000mL，pH7.2~7.4，121℃灭菌 20min；
第 37 卷 第 6 期 2 0 1 0 年 11 月
文章编号:1002- 8110（2010）06- 0055- 04
酿酒 LIQUOR MAKING
Vol.37.№.6 Nov.，2010
嗜热芽孢杆菌对美拉德反应的作用初探 *
曹敬华 1，方尚玲 1，陈茂彬 1**，张明春 2，向 苇 2
（1.发酵工程省部共建教育部重点实验室，湖北工业大学生物工程学院，湖北 武汉 430068； 2.湖北白云边股份有限公司，湖北 松滋 434200）
从图 3B 可以看出，不同温度条件下发酵物的游离氨基 酸含量差别不大，55℃下为最高。美拉德反应与温度关系密 切，其反应速度随温度升高而加快，因此高温是促进美拉德反 应的一个重要环境因素。 2.3.2 发酵时间
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其 OD 值达到 0.222，因此可以判断在这段时间内发生了一定 程度的美拉德反应，最终生成类黑精（Melanoidin），类黑精是 引起食品非酶褐变的主要物质[5]，其美拉德反应产物的增多导 致 OD 值增大。而 CK 随着时间的推移其吸光度只有很小幅 度的上升，可能是 50℃高温培养环境下产生了一定程度的褐 变，其曲线基本上是一条平行于 X 轴的直线。因此，可以初步 判断 BG05 对美拉德反应有一定的促进作用。
美拉德反应（Maillard Reaction）是氨基化合物和还原糖 生物尤其是嗜热菌的发酵及其代谢的酶类影响着美拉德反应 化合物之间发生的反应，它是法国著名科学家 L.C.Maillard 的发生，最终带给白云边酒特有的风格。为研究白酒酿造中微 于 1912 年发现的，广泛存在于食品加工和食品长期贮藏过程 生物在美拉德反应中起着何种作用及与风味物质的形成有何 中，是食品香味产生的主要来源之一[1]。中国白酒传统酿造工 关系，本实验从高温大曲中筛选到一株嗜热芽孢杆菌 BG05， 艺是为美拉德反应提供相应条件的经典之作，例如大曲培养 通过研究其与美拉德反应之间的关系，为今后进一步研究白
需要高温、微氧、高湿等环境以及酱香和浓酱兼香白酒酿造过 程中的高温堆积工艺，均为美拉德反应提供了相应条件，因而 美拉德反应与中国白酒的酿造生产密切相关，美拉德反应的 产物能为白酒带来香气突出、酒体醇厚、口味细腻、留香持久 等特点。在白云边独特的浓酱兼香型白酒生产过程中，多种微
* 基金项目：湖北省自然科学基金项目（2008CDB063）和湖北工业大 学博士启动基金（BSQ D0910）。 收稿日期：2010- 08- 04 作者简介：曹敬华（1986－），男，湖北天门人，硕士研究生，研究方向： 工业微生物。 ** 通讯作者：陈茂彬，博士，教授
10000
5000
0 CK
除菌液 样品
灭酶液
图 2 发酵液游离氨基酸含量
菌株在 55℃下高温发酵，细胞分泌出的蛋白酶水解培养 体系中的蛋白质，为酱香物质的形成提供游离氨基酸。通过测 定发酵液中游离氨基酸含量，结果见图 2。除菌液中氨基酸含 量最高，其值达到 21320mg/L，灭酶液中游离氨基酸含量为 12140mg/L，除菌液和灭酶液的游离氨基酸含量均高于 CK，游 离氨基酸含量测定结果与感官评价结果比较一致，验证了前 面提到的发酵液经除菌灭酶处理后发生了某种变化这一论 断，香味浓郁的除菌液中游离氨基酸含量高于灭酶液和 CK。 因此可以说，除菌液和灭酶液均有一定程度的美拉德反应发 生，而除菌液的游离氨基酸含量高于灭酶液这一现象说明，将 发酵液的菌体过滤之后，发酵液中余下的某种酶促进了美拉
取实验菌 BG05 发酵 4d 的培养液，一部分经 0.22μm 微 孔滤膜过滤除菌后 55℃，150r/min 继续发酵 2d，另一部分经 高温灭菌灭酶(121℃，20min)后 55℃，150r/min 继续发酵 2d。 以正常发酵 6d 的作为对照，进行感官评价，发酵液中的游离 氨基酸含量的测定按参考文献[2]，考察除菌灭酶对美拉德反应 的影响。 1.2.3 外界条件对美拉德反应的影响因素
OD 值
0.25
0.2 ◆
◆
0.15
◆
◆ CK
◆
0.1
0.05◆ ■
◆ ■
◆ ■
◆ ■
◆◆ ■■
Biblioteka Baidu
◆ ■
◆ ■
■ BG05
■ ■■■
0
0
20
40
60
80
100
时间 /h
图 1 BG05 和枯草芽孢杆菌的美拉德模式反应比较 2.2 除菌灭酶
表 1 感官评价结果
CK
除菌液
灭酶液
原料麸皮味
香味浓郁
略带甜味
除菌灭酶实验中各样品的感官评价结果见表 1，可以看
出，除菌液（过滤掉菌体）和灭酶液（将酶灭活）的培养基气味
与 CK 相比均有较大差别，特别是除菌液香味明显，灭酶液则
略带甜味，而对照 CK 则是原料味，因此我们认为经过除菌灭
酶处理，培养液必定发生了某种变化，从而造成除菌液香味优
于灭酶液这样的结果。
25000
氨基酸含量 /mg·L-1
20000
15000
液比 1:0.7、接种量 10%的外界条件能够更好的促进美拉德反应的进行，Fe3+ 对美拉德反应的发生有较明显的
促进作用。
关键词：嗜热芽孢杆菌；美拉德反应；促进；影响因素
中图分类号：Q 93.3;T S201.2
文献标识码：A
Study on Maillard Reaction by a Strain of Thermophilic Bacillus
按参考文献[4]，用茚三酮显色法测量。 2 结果与分析 2.1 美拉德模式反应
从图 1 可以看出，经 30℃和 40℃培养 2d 后，实验菌 BG05 和未接菌的 CK 的 OD 值仅为 0.05 左右。进入 50℃培 养后，随着时间的推移，BG05 的吸光度逐渐的增加。从接种开 始培养至 25h 左右为一个诱发期，在此阶段 OD 值缓慢的上 升。25h 之后 OD 值随培养时间的延长迅速增加，培养至 88h
●
15
B
10
5
0 35℃
●
●
●
45℃ 35℃- 55℃ 55℃ 温度 /℃
图 3 不同温度下的褐变度（A）及游离氨基酸含量（B）
在 35℃、45℃、35→55℃（35、45、55 各 2d）和 55℃条件下 实验菌 BG05 的褐变度及游离氨基酸含量变化见图 3。由图 3A 可知，随着温度的升高，褐变度逐渐增加，55℃条件下褐变 度明显高于 35℃和 45℃。
Abstract: The strain of thermophilic Bacillus named BG05 which isolated form the Baiyunbian high- temperature Daqu. The study on the mode of Maillard Reaction and the broth which was dealt with sterilization by membrane filtration and inactivation of enzyme showed that BG05 has certain promoter action to Maillard Reaction. There must be existence of some enzymes that catalyze the Maillard Reaction. Using wheat bran as solid culture medium, the influencing factors of extermal conditions on the strain of thermophilic Bacillus to promote Maillard Reaction was studied. The results indicated that the optimal fermentation conditions were as follows: fermentation temperature 55℃ , fermentation time 8d, initial pH7.0, liquid ratio 1:0.7, inoculation level 10% .Fe3+ can promote Maillard Reaction visibly than the other metal ions. Key words:Thermophilic Bacillus; Maillard Reaction; promotion; influencing factors
以麸皮固体培养基为基础，分别设置不同的温度、发酵时 间、初始 pH、料液比、接种量和金属离子进行发酵，最后测定 发酵物的褐变度及游离氨基酸含量。 1.2.4 褐变度测定[3]
每瓶发酵完成后的曲料中加入无水乙醇共 30mL，分两次 浸提曲料，共浸提 2h 后过滤去渣。取粗浸提液用酒精测乙醇 含量，添加适量蒸馏水，使乙醇含量为 60%之后，5000r/min 离 心 10min，弃去沉淀物，取上清浸提液比色测定。本试验以曲 料乙醇浸提液在 490nm 波长处的光密度值作为曲料的褐变 度。 1.2.5 游离氨基酸的测定