细胞化学染色

临床意义
Normal
粒系 原始粒细胞-/+-++,多呈颗粒状或小块，也可弥散状， 细胞越成熟，其阳性反应越强
单核系 原幼单核细胞-/+-++,常呈弥散状，也可呈颗粒状，细胞越成熟，其阳
淋系、巨核系，红系
阴性
急粒白血病
原幼细胞多+
Abnormal
急单白血病 急淋、M7
原幼细胞多+/- 或 原幼细胞 -
染色方法
1958年WASHBURN复方联苯胺法 1965年KAPLOW二盐酸联苯胺法 1985年血液学国际标准化委员会(ICSH) 二氨基联苯胺法（DAB染色法） 过氧化酶氨基-甲基卡巴唑染色法 二盐酸联苯胺法
中文名称:联苯胺 英文名称:BENZIDINE 中文别名:对二氨基联苯；4,4‘-二氨基联苯 分子式:C12H12N2 分子量:184.2371
干 4、复染：E液20min
积分计算
据兰色颗粒所占胞浆面积、颗粒大小、多少及染色强度来判断。 阴性为胞浆内无兰色颗粒。 正常值：正常人积分一般为40－100分
级别
+ ++ +++ ++++
兰色颗粒占 颗粒大小 胞浆面积 （％）
<50
小
50-80
小-中等
80-100 100
中等-大 中等和大
颗粒多少 染色强度 积分
4.异常细胞MPO的变化 ①分化差的原始粒细胞及原始单核细胞MPO可为
阴性，如M2，并不是所有原始细胞均阳性。M5a， 原始单核细胞常阴性。 ②MDS：原始细胞POX常阴性，发育异常的下阶 段粒细胞POX可为阴性。 ③MDS转白，CML转白，HAL，原始粒细胞POX 可为阴性，但不能诊断为M0，因为原始粒细胞不 像幼稚淋巴细胞，且可能为发育异常，并不是分化 差。 ④反之，如果典型原始粒细胞POX阴性，应考虑到 是否为MDS转化而来。
诊断
诊断 （1）诊断的意义？
诊断的准确率 POX 99% （2）怎样才能真正的体现细胞化学的价值？
临床+形态+细胞化学 临床+形态+细胞化学+免疫分型
辅助
什么时候是辅助？ 不典型白血病
POX染色
淋系的POX肯定是阴性的。 大概有1%的髓系白血病POX是阴性的。 如何诊断髓系白血病？ CML急变，MDS转白，M0，少见的POX阴性的髓系白
急性白血病类型鉴别：
急性粒细胞白血病：阳性率常≥3%，呈现弥散 状，颗粒状或块状阳性；
急性单核细胞白血病：呈弱阳性（弥散状）或 阴性；
急性淋巴细胞、巨核细胞性白血病：阴性。
急性白血病MPO反应强弱顺序： M3>M2>M6(粒)，M4，M1>M5>HAL
2.嗜天青颗粒（紫红色，非特异性颗粒，阿氏颗粒）：
碱性染料亚甲蓝或天青与细胞中的酸性成分核染 色质，碱性蛋白结合，使其呈蓝色
酸性染料伊红与细胞中的碱性成分血红蛋白，嗜 酸性颗粒结合，使其呈红色。
粒系及单核系阳性；
淋系阴性：成熟淋巴细胞，原幼稚淋巴细胞，淋 巴瘤细胞；
巨核系阴性： 颗粒及产板巨，血小板均为阴性。
浆细胞内的紫红色颗粒，类柴束样棒状小体为免 疫球蛋白聚集而成，亦为阴性。
铁染色
【标本要求】 骨髓片1张
【试验试剂】
固定剂 甲醛
A液
亚铁氰化钾
B液
盐酸
C液
核固红
【试验原理】 酸性
含铁物质＋亚铁氰化钾
亚铁氰化铁（兰绿色）
操作步骤
工作液配制： A液1ml＋B液1ml，马上染，防止HCL挥发。
1、固定：30秒 2、染色：工作液37℃水浴60min，水洗晾干 3、复染：E液20min
判断方法：幼红细胞内出现兰绿色的圆形小珠，需与染料沉渣鉴 别。
Ⅰ型：1个 Ⅱ型：2～5个 Ⅲ型：6～9个 Ⅳ型： ≥10个 环形铁粒幼红细胞：铁颗粒围绕核周排列超过6个以上。
环形铁粒幼红细胞
临床意义
【临床意义】 1、鉴别缺铁性与非缺铁性贫血：IDA细胞外铁消失，铁粒幼
MDS、白血原病始细胞阴性，部分下阶段粒细胞阴性
AML-M5a
AML-M5b血涂片
POX判定技巧
1、根据中性分叶核粒细胞是否阳性，判定染色是否成 功。
2、原始细胞一般POX强度弱，+-++，若+++-+++为早 幼及以下阶段细胞。
3、部分白血病患者原始细胞POX染色强，早幼粒细胞 与POX强的原始的区别：据瑞氏染色的原始细胞数判定。
很少
微弱-中等 1分
少等-中等 中等-强
2分
中等-多
强
3分
很多(密集、 很强
4分
甚至覆于核 上
临床意义
1、鉴别CML与类白血病反应：慢性粒细胞性白血病（慢性 期）时，NAP活性显著降低或为阴性，常为“0”
2、鉴别PNH和AA：前者活性降低，后者升高。 3、鉴别细菌感染与病毒感染：前者升高，后者轻度升高或
判断方法：M3为+++-++++，其余为+-++。
怎样鉴别强的原始粒细胞及早幼粒细胞？
首先观察骨髓涂片，看平均每个视野原始及早 幼粒细胞的数量，若骨髓涂片早幼粒细胞不多， 说明原始粒细胞POX强。若早幼粒细胞比较多， 只能估计减去一些POX较强的早幼粒细胞。
临床意义
1.发育规律： 淋系、巨核系、红系、浆系阴性，嗜碱，组碱均阴性。 粒系及单核系，原始粒细胞，原始及幼稚单核细胞可为阴 性，细胞越成熟阳性程度越强。 嗜酸性粒细胞强阳性。 吞噬细胞可为阳性（单核巨噬系统来源，吞噬凋亡的中性 粒细胞）。 组织细胞阴性
【试验原理】
碱性磷酸酶
磷酸萘酚AS-BI 萘酚AS-BI + FBB
萘酚AS-BI 蓝色沉淀。
工作液配置
工作液配制： 1、B液50ul+C液50ul混匀，变黄，静置
2min+2ml蒸馏水+D液50ul，淡黄色。 2、固定：血涂片3min，骨髓5min，水洗晾干 3、染色：滴加工作液37℃水浴30min，水洗晾
复染
核着色效果较好：苏木精 浆着色较好：核固红，甲基绿
髓过氧化物酶
血细胞所含过氧化物酶主要为髓过氧化物酶(MPO) ， 是 一类糖蛋白 ，相对分子质量约为 150000 ，是人类中性粒 细胞含量最多的蛋白质 ，约占细胞干重的 3%~5%。
主要存在于线粒体和溶酶体（嗜天青颗粒）中，是一种与 生物氧化有关的溶酶体酶，主要功能是破坏生物氧化过程 中有巨毒的过氧化物， 使其放出氧，参加细胞内氧化还 原过程。
POX诊断准确率99%+形态 临床脾不大
颗粒与POX的关系
1.有颗粒POX就一定阳性吗？ 2.没有颗粒POX就一定阴性吗？ 如果原始粒细胞出现颗粒POX一定阳性吗？ 不一定 如果幼稚淋巴细胞出现颗粒POX一定阴性吗？ 一定
颗粒与POX的关系
1.有颗粒POX就一定阳性吗？ 2.没有颗粒POX就一定阴性吗？
POX染色阴性
此病人虽临床，形态，POX染色均支持ALL，但是免疫分型为HAL 说明这种犯错不可避免
POX阴性 淋巴瘤骨髓侵犯
原始粒细胞胞浆中有颗粒POX不一定是阳性 形态是基本
碱性磷酸酶染色NAP
【标本要求】 外周血涂片或骨髓片
【试验试剂】 A液：固定剂，柠檬酸钠、 B液：偶氮溶液，FBB盐 C液：亚硝酸钠 D液：磷酸萘酚AS-BI E液：中性红
细胞外铁
观察：骨髓小粒及散在的吞噬细胞。
正常人：一般为“+-++”。
判定方法 ： 阴性：无铁粒可见 +：弥散状，有少数铁粒或偶见到铁小珠 ++：有铁粒小珠和少数小块 +++：有很多的铁粒小珠和少数铁小块 ++++：有很多的铁粒、小珠、小块、大块
细胞内铁
正常人：铁粒幼红细胞≥15％，以Ⅰ、Ⅱ型为主，无环形铁粒幼 红细胞。
3.免疫分型、免疫组化cMPO及细胞化学染色 MPO的同异
同：均是测定细胞胞浆内是否含有髓过氧化物 酶
异：方法不同，前两者是抗原抗体反应，后者 是测定是否存在髓过氧化物酶活性。
因此，大多数情况下两者是一致的。
但如M0，可流式及免疫组化时cMPO阳性， 但是细胞化学染色阴性，即存在髓过氧化物酶， 但是没有酶活性。
2.形态：
原始粒细胞
（1）染色质较平，且间隙均匀，清晰
（2）胞浆较多部分细胞胞浆中有颗粒
（3）寻找早幼粒细胞，看染色质，与核膜
淋系：
（1）核膜厚，染色质呈融合状
（2）胞浆量少，手镜状，可以出现颗粒，但是出现颗粒的细

胞少而大
（3）小缺缺（切迹）
（4）分布（葡萄状）
髓过氧化物酶染色
【标本要求】
骨髓片,4℃保存2周
复方联苯胺染液
联苯胺
0.3g
95％乙醇
99ml
36％亚硝基铁氰化钠 1ml
试剂保存：10月或更久
过氧化氢溶液
30％过氧化氢 1滴
蒸馏水
50mlwenku.baidu.com
此溶液需新鲜配制
MPO【试验原理】
粒细胞及一部分单核细胞胞浆内含髓过氧化物酶，此酶能 将过氧化氢中的氧释放出来，而把联苯胺氧化成氧化联苯 胺，后者与亚硝基铁氰化钠结合形成棕色颗粒，沉着于细 胞质中。
粒细胞 单核细胞
H2O2
MPO
[O]
氧化联苯胺
+
亚硝基 铁氰化钠
棕色颗粒
操作步骤
1、复方联苯胺染液：3～8滴 盖满玻片
1 Min 勿冲洗
2、过氧化氢溶液：（2倍）的3～8滴
8 Min 小水流冲,勿冲骨髓
3、复染： A液：B液＝1：2 （30min，据细胞数而定）
阳性率及阳性强度判断
1、计数100个肿瘤细胞，算出阳性率。 M1，M2：原始粒细胞， M3：早幼粒细胞 M4：原始粒细胞及原始幼稚单核细胞。 M5：原始及幼稚单核细胞。M6：原始粒细胞 M7：原始单核细胞。ALL：原始幼稚淋巴细胞 淋巴瘤：淋巴瘤细胞
不升高。 4、辅助PV与ET诊断:PV与ET活性明显增高，继发者一般不
增高或仅轻度增高。CNL NAP积分明显增高。IMF亦显著 增高。
NAP临床意义
CML（慢性期）： 或0分 类白血病反应：正常
PNH：活性 AA：活性
NAP积分
CNL： 明显 IMF：显著 PV与ET：明显
细菌感染：活性 病毒感染：活性轻度 或N
注意事项
1、正常值：40-100分，大多数CMLNAP积分在10分以下， 有时甚至为0分，有时可达30分左右，因此定义正常值低限 为40分。
2、目前由于体检的增加，有时CML患者的白细胞只有1-2 万，外周血可有少许的幼稚粒细胞，无原始细胞，骨髓可 分类正常，但嗜酸及嗜碱性粒细胞易见，此时注意做NAP 积分。
若POX（+），肯定是髓系的。
POX （-）
颗粒 （+）
酯酶双染 免疫分型
颗粒 （-）
+
临床及形态
MDS转白 CML急变 HAL
淋系 M0
血片
血片
M0的片子POX常为阴性 形态象淋系。
注意胞浆及胞浆是否存在颗粒。 免疫分型才能诊断
如果是淋系，出现颗粒，POX一定是阴性的。
如果POX是阴性，除外CML急变，MDS转白，M4c（做一个酯酶双 染）， HAL ，（看是一种还是两种） ，M0（看形态，等免疫分型）， 99.99%是淋系。0.01%，就漏诊吧（此时我们可以诊断ALL）
细胞化学染色步骤
固定 染色原理 复染
固定： 意义：保持细胞结构及化学成分的不变。 目的：使细胞内的蛋白质、酶类、糖类等变 成不溶性物质。 蒸汽固定—甲醛 液体固定—甲醛、丙酮、乙醇、甲醇
染色原理
偶氮偶联法： NAP、A-NAE、A-NBE、AS-DCE、ACP 联苯胺法：MPO 普鲁士兰反应：FE 雪夫反应：PAS
颗粒 什么关系
POX
如果原粒出现颗粒POX一定阳性吗？NO 如果幼淋出现颗粒POX一定阴性吗？YES
若POX阳性，肯定是髓系的。 有颗粒+POX阴性 做酯酶双染及免疫分型 （存在一部分是POX阴性的白血病，MDS转白，CML急变，HAL ） 无颗粒+POX阴性 +临床及形态 淋系 （1%做免疫分型，M0）
血病，M5a。 如何在错综复杂的淋系白血病中与这1%的白血病进行分
析？
POX染色（—）
诊断的准确率：99%
淋系的POX肯定（—）。
怎么鉴别呢
髓系白血病POX （—） 。
如何诊断
CML急变，MDS转白，M0
少见的POX（-)的髓系白血病， M5a
1.临床表现：询问病史，CML，MDS
细胞化学染色
细胞化学染色项目
髓过氧化物酶染色 （MPO） 中性粒细胞碱磷酸酶染色（ NAP) 糖原染色（PAS） 铁染色 酯酶双染： Α-醋酸萘酚酯酶染色 （ A-NAE ）+特异性酯酶染色 (CE) Α-丁酸萘酚酯酶染色 （ A-NBE ）+特异性酯酶染色 (CE) 抗酒石酸性磷酶染色 (TRAP)