质粒提取及酶切鉴定
质粒DNA的提取与酶切鉴定
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管, 以混匀 内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变 性并形成交联的网状结构
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置2～3min； 溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部分变性的闭环
试剂： LB培养基 氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL； 溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)，
25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml
冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，pH8.0；
5×TBE缓冲液：0.45mol/L Tris－硼酸，0.01 mol/L EDTA, pH 8.0； 10×Loading buffer：1% SDS, 0.05%溴酚兰，50％的甘油； 无水乙醇；70％乙醇； 标准分子量片段； 核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解缓冲液(10× buffer H)； 琼脂糖； 溴化乙啶（EB）染色液(10mg/ml)。
质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep管中； 7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀，室温放 置2min. 8、12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙醇洗涤 一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干， 然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含50 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓 冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)， 存于－20℃或直接用于酶切。
质粒提取及双酶切鉴定内切酶内切重组质粒
纯化质粒
通过吸附、洗涤等步骤进一步 纯化质粒DNA。
02 双酶切鉴定
双酶切鉴定的原理
酶切原理
双酶切鉴定基于限制性内切酶对DNA的特异性切割，通过两种不同的限制性内 切酶对质粒进行切割，产生特定的DNA片段。
产物分析
通过电泳分析切割后的DNA片段，判断是否出现预期的酶切产物，从而确定重 组质粒是否正确。
酶切效率计算
通过比较酶切前后的质粒浓度，可以计算出酶切效率。
重组质粒鉴定
通过对比酶切后的质粒片段和预期的重组质粒片段， 可以初步判断重组质粒是否被成功构建。
序列分析
对重组质粒进行序列分析，可以进一步确认重组质粒 的准确性。
实验结果分析注意事项
确保电泳结果的可信度
01
在分析电泳结果时，应排除假阳性或假阴性的可能，确保结果
筛选与鉴定
通过特定的筛选和鉴定方法，如菌落PCR、酶切分析和电泳检测 等，对重组质粒进行筛选和鉴定。
内切酶内切重组质粒的步骤
酶切反应
将重组质粒与适量的内切酶混合，进行酶切 反应。
胶回收
通过凝胶电泳分离酶切产物，并使用胶回收 试剂盒回收目的片段。
连接反应
将两个不同的DNA片段进行连接，形成新的 重组分子。
质粒提取及双酶切鉴定 内切酶内切重组质粒
目录
CONTENTS
• 质粒提取 • 双酶切鉴定 • 内切酶内切重组质粒 • 实验结果分析
01 质粒提取
质粒提取方法
01
02
03
碱裂解法
利用高pH值环境下质粒 DNA与细胞基因组DNA 的变性差异，将二者分离。
煮沸法
通过加热使细胞破裂，释 放质粒DNA，再通过离心 将质粒DNA与其他细胞成 分分离。
质粒提取定量与酶切鉴定
三、质粒DNA的酶切分析
• 质粒 DNA: ～3 kb
载体: pMD18-T 2.7kb 基因: CHD5 1.4 kb
质粒提取定量与酶切鉴定
限制性内切酶
• 限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的 特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切 割双链DNA。
• 分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为 4～6个核苷酸的反向重复序列。
质粒提取定量与酶切鉴定
琼脂糖凝胶电泳上样
-
1234
+
每组上2个样品
1：DNA Marker（ 5 l ） 2：提取的质粒DNA （ 5 l ） 3：质粒DNA酶切产物 （ 10 l ）
质粒提取定量与酶切鉴定
DNA Marker (ladder)
质粒提取定量与酶切鉴定
组成
Loading Buffer 上样缓冲液
实验流程图
一、碱裂解法提取质粒
二、质粒定量
最后做
三、质粒酶切
四、酶切产物的琼脂糖电泳检测
质粒提取定量与酶切鉴定
实验目的
• 掌握碱裂解法提取质粒的方法 • 掌握紫外吸收测定DNA的方法 • 了解质粒酶切鉴定原理 • 掌握琼脂糖凝胶电泳技术
质粒提取定量与酶切鉴定
实验材料
• 大肠杆菌DH5a菌株 • pMD18-T载体 • 易瑞质粒小量提取试剂盒
• EDTA • 甘油 ……………增大溶液密度 • 溴酚蓝…………指示剂 • 二甲苯胺蓝……指示剂
0.5TBE, 0.5-1.4%浓度的胶中，
迁移率
溴酚蓝=300bp
二甲苯胺蓝=4kbp 质粒提取定量与酶切鉴定
➢染色
✓溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB) :3,8-二 氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐，能插入DNA 分子碱基对之间并与之结合,在紫外光照射 下呈现红橙荧光,
基础生物化学实验实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶切分析)
(2) 挑选单菌落，在无菌条件下放入5 ml LB液体培养基中 （100 g /ml氨苄青霉素），200-300 rpm，37℃过夜培养。 (3) 取1.5 ml菌液（其余菌液加入25%的灭菌甘油，放入对 应编号的1.5 ml离心管中，-70℃ 下作菌种保存），5000 g离心5 min。 (4) 弃上清夜，加入100 l预冷的溶液I，悬浮沉淀，室温 放 置5 min。 (5) 加入200 l 新鲜的溶液II，边加边震荡，但不能剧烈， 冰上放置5 min。 (6) 加入75 l溶液III，震荡混匀，冰上放置5 min。 (7) 12000 g 离心5 min。 (8) 取上清液，加入两倍体积的预冷无水乙醇，12000 g离 心10 min。 (9) 用1 ml 70%的乙醇洗涤沉淀，空气中放置3-5 min。 (10) 用30-50 l TE溶解，用紫外分光光度计进行DNA含量 测定，EB琼脂糖(1.4%)凝胶电泳分析。
实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶分析
(1) 溶液配制： 溶液 I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 溶液 II 0.2 mol/L NaOH 0.5% SDS 溶液 III 3 mol/L KAc (用冰醋酸调 pH值至5.0)
质粒DNA的酶切分析参照相关酶的说明书 操作步骤进行
质粒提取,定量,酶切鉴定实验报告
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级： 2018级临床卓越创新班组别：第四实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定实验日期2019-11-05 实验地点第四实验室合作者指导老师评分XX 教师签名李某某批改日期2013-06-03一、实验目的1.学习并掌握碱裂解法提取质粒的方法2.掌握紫外吸收测定DNA的操作3.了解质粒酶切鉴定原理和方法4.掌握琼脂糖凝胶电泳技术原理，操作二、实验原理1. 碱裂解法：基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
1）pH =12.6（碱性），染色体DNA：氢键断裂，变性。
质粒DNA：大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。
（不完全变性）2）（在1）溶液加入KAc溶液调节pH），中性，质粒DNA：复性，继续溶于溶液中染色体DNA：不能复性；形成了、缠连的网状结构。
3）离心后，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来2. 离心层析柱1) 硅基质膜在高盐、低pH值的状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA；2）通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；3）低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；3. 质粒DNA定量测定：紫外光分光光度计法1）物质在光的照射下会产生对光的吸收效应2）而且物质对光的吸收是具有选择性的3）各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱4）因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在紫外光260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。
5）DNA对波长260nm的紫外光有特异吸收峰，蛋白质在280nm紫外光处有特异吸收峰，A260/A280可以反应DNA纯度。
4.质粒DNA的酶切分析限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA5.琼脂糖凝胶电泳（有电荷效应，分子筛效应）不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动速率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。
质粒的提取及酶切实验报告
质粒的提取及酶切实验报告
一、实验目标
本实验旨在提取低分子量DNA、质粒，通过酶切实验检测质粒DNA片段长度，并处理实验结果。
二、实验原理
1、质粒DNA提取：使用特定的提取试剂，先提取溶菌酶凝胶中的质粒DNA；
2、质粒DNA酶切：采用酶切的方法，对质粒DNA进行切割，形成小片段；
3、质粒DNA测序：采用测序仪对质粒DNA片段进行测序，从而确定其长度。
三、实验材料
1、提取试剂：主要由蛋白酶、乙腈、缓冲液、EDTA等混合而成；
2、PCR反应液：主要由dNTP、聚合酶、反应缓冲液等组成；
3、酶：主要由DNA内切酶和DNA外切酶组成；
4、测序仪：用于测序质粒DNA的片段长度；
四、实验步骤
1、提取质粒DNA：将实验样品放入提取试剂中，加热30分钟，然后用混合物洗涤一次，最后离心得到清澈的液体，含有提取的质粒DNA；
2、进行PCR反应：将提取的质粒DNA作为反应液™添加到PCR管中，在适当温度下反应10分钟；
3、酶切：将PCR管中的反应液加入内切酶和外切酶中，在规定温度下酶切1小时；
4、离心质粒DNA片段：将酶切后的反应液离心，以得到质粒DNA片段；
5、进行测序：将质粒DNA片段放置于测序仪中，逐一测序后得到结果；
五、实验结果及分析
实验结果：
质粒DNA片段长度：
0.31kbp、0.48kbp、0.51kbp、0.58kbp、0.68kbp等。
质粒DNA的提取酶切及检测
加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min质粒DNA复性
12000rpm，离心5min，取上清记录体积到一新管
上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）
12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管
（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）
12000rpm，离心2min，取上清记录体积到一新管
醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条 件会打断DNA。
▪ 平衡酚：氯仿（1：1）
作用：酚使蛋白质的变性，但是水饱和酚 的比重略比水重，不利于含质粒的水相的 回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得 酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收。
▪ 乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀
▪ TE缓冲液：溶解DNA
Relaxed circle Linearized form Super-coiled form
四、实验结果与讨论
根据观察结果，绘图。 分析自提质粒的情况以及酶切情况。
相关知识
基因工程又称DNA重组技术 外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内， 使这个基因能够在受体细胞内复制、转录、翻 译、表达的操作
包括基因的分离、重组、转移、基因在受体细 胞内的保持、转录、翻译表达等全过程
基因工程四要素：目的基因、工具酶、载体、 受体细胞
常用到的工具酶
限制性内切酶 连接酶 聚合酶 逆转录酶 DNA酶和RNA酶
平头末端： II型酶切割方式的另一种是在同一位置 上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：
5’…… GAT’|ATC …… 3’
3’…… CTA’|TAG …… 5’
切割后形成5’…… GAT和ATC …… 3’、 3’…… CTA和TAG …… 5’。这种末端同 样可以通过DNA连接酶连接起来。
质粒DNA的提取与酶切电泳鉴定.ppt
9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温开盖放置1015min，使乙醇挥发殆尽。
10、将沉淀溶于30-50μl TE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中， 储于-20℃冰箱中。
5、加入350μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒离心管5次，出现白色 沉淀，使沉淀混匀， 4℃ 12000rpm 离心10分钟。
6、上清液移入干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混 匀，4℃下12000 rpm离心2分钟。
7、将上层水相移入干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混 匀后室温放置2分钟，然后4℃下12000 rpm离心5分钟。
2、取2 ml培养液倒入1.5ml EP管中（分次加入，离心）， 4℃ 12000 rpm 离心30s -1min，弃去上清；
3、用涡旋混匀器使菌体沉淀重悬浮于250μl冰预冷的溶液Ⅰ。
4、加入新配制的溶液Ⅱ250μl，盖紧管口，快速温和颠倒离心管5次，菌 液变得透亮，以混匀内容物（千万不要振荡）。
11、 酶切鉴定并将没有酶切的质粒与酶切的质粒进行琼脂糖凝胶电泳。 （酶切体系一般1-2ul提取的质粒，10×buffer，相应的酶，余下加水， 一般鉴定所用的酶切体系建议10ul）
质粒提取关键：
基因组DNA与质粒DNA的有效分离 （碱裂解法）
高pH使质粒DNA和染色体DNA变性，同时沉淀蛋白 质。再将pH值调至中性，质粒DNA较小，很容易复性 成双链。而染色体DNA较大，不会复性，缠结成网状 不溶物质，从而可以通过离心除去。
注意事项:
实验方法
碱裂解法
实验二-质粒DNA的提取及酶切
实验二质粒DNA的提取及酶切（8学时，6小时）一、实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取和酶切质粒的技术与方法。
二、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。
环状闭合的质粒DNA在限制性内切酶的作用下成为线状质粒DNA，内切酶能识别DNA分子中某一特定的核苷酸序列。
三、仪器、材料、试剂(一)仪器：1、恒温摇床2、台式离心机3、高压灭菌锅4、振荡器(二)材料：1、含PUC-18质粒的大肠杆菌2、乙二胺四乙酸(EDTA)3、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 4.葡萄糖 5.氢氧化钠(NaOH) 6.十二烷基硫酸钠(SDS) 7、乙酸钾(KAc) 8、冰醋酸(HAc) 9、盐酸(HCl) 10、Tris饱和酚11、氯仿12、异戊醇13、乙醇14、胰RNA酶15、氨苄青霉素16、离心管(三)试剂：1、溶液І (pH8.0) 2、溶液Ⅱ3、溶液Ш4、TE缓冲液(pH8.0)5、0.5mol/LEDTA6、氯仿:异戊醇(V:V=24:1)7、Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1)8、70%乙醇9、胰RNA酶10、ECOR I酶四、实验步骤（一）质粒DNA的提取1、先在3mL LB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素(终浓度50ug/mL)，然后接入一个含puc-18质粒的大肠杆菌单菌落，37℃震荡培养过夜。
2、取过夜培养的菌液1mL加入1.5mL离心管中，4000r/min，倒出培养液，将所有菌体细胞收集在一个离心管中。
3、加入100µl溶液І于含菌体细胞的小指管中，旋涡震荡将细菌沉淀悬浮，室温放置10min。
4、加入200µl溶液Ⅱ(新鲜配置)，轻轻混匀内容物，溶液逐渐变清亮后加入溶液Ш(千万不可用旋涡震荡器，裂解时间不超过5min)。
5、加入150µl溶液Ш(冰上预冷)，盖紧管口，轻轻混匀数次。
质粒DNA提取、定量、酶切与PCR鉴定
限制性内切酶
影响酶切反应的因素
➢ 底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等 均能抑制酶反应; ➢ 反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+, 合适 离子强度可以激发酶切反应; ➢ 反应体积：一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于5%; ➢ 保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误;
DNA样品较纯,符合实验要求 RNA污染 有蛋白质或其它杂质的污染
实验仪器
核酸蛋白检测仪(Eppendorf BioPhotometer plus)
比色杯
数据处理
测量次数 1 2 3
平均值
质粒DNA浓度
(μg/ml)
Ratio值
(A260/A280)
定量检测
第三部分 酶切鉴定
DNA Restriction Enzyme Digestion
溶液反应温度 升至中温72℃ ，在 Taq酶作 用下，以dNTP 为原料，引物 为复制起点， 模板DNA的一 条单链在解链 和退火之后延 伸为一条双链
延伸
72˚C
实验原理
变性
95˚C
加热使模板DNA 在高温下90℃-95 变性，双链解链
退火
Tm-5˚C
降低溶液温 度，使合成 引物在低温 （35－70℃, 一般低于模 板Tm值的5℃ 左右），与 模板DNA互补 退火形成部 分双链
✓ 注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光 度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度 和Ratio值.
实验方法
2.根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的 纯度（Ratio=A260/A280）
• Ratio= 1.8 • Ratio＞1.9 • Ratio＜1.6
质粒DNA的提取与酶切
生物化学实验报告质粒DNA的提取与酶切质粒DNA的提取与酶切一实验原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒是分子生物学研究的常规技术，碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I：50 mM葡萄糖、25 mM Tris-Cl 、10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II：0.2 N NaOH、1% SDS；（临用前混合）溶液III ：3 M 醋酸钾、2 M 醋酸。
1、溶液I的作用：对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此选用适当浓度和适当pH值的Tris-Cl溶液。
加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。
EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase的活性和微生物生长。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。
2、溶液II的作用：NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
3、溶液III的作用：SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。
溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。
同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。
质粒DNA提取与限制性内切酶酶切鉴定
为了检验大肠杆菌质粒是否有目的基因，我们先要用碱法提取出高纯度的大肠杆菌质粒DNA并且进行限制性核酸内切酶酶切，然后，我们要进行酶切产物的电泳以及紫外线分光光度法检测DNA。目前这些技术已经广泛应用于基因克隆技术的检验克隆产物阶段。
二、实验原理
(1)首先利用质粒DNA和染色体DNA分子量的差异来进行的。质粒小，为双链、闭环的超螺旋DNA分子，复性容易，而染色体DNA大，不易复性，导致这两种DNA提取不同的方法。因而利用碱法提取质粒DNA，先从混合物中分离出来，然后逐步纯化即可得。
三、实验基本流程
第一部分
1、将1.5ml大肠杆菌培养液加于EP管，然后以12000rpm×60s离心；
2、弃上清，再重复一次；
3、加入150ul溶液I，充分重悬；
4、加入200ul溶液II，立即、轻柔振荡数次；
5、加入150μl冰溶液III，震荡10s，冰浴3~5min后以12000rpm×10min离心；
4、酶切时加入的DNA溶液体积不能太大，防止DNA溶液中其它成分会干扰酶反应。
5、在紫外分光光度调零的时候，要先选定波长260nm（样品中RNA浓度）或280nm（样品中DNA浓度）。若数值一直在波动，则表明仪器不稳定，应该立即停止使用。
五、实验结果
1、在质粒酶切电泳中，1孔Marker出现多条带状；2孔已酶切质粒出现双条带状，但是短条带比长条带更明显；而3孔未酶切质粒只有一条带状，并且长度介于已酶切质粒两个条带之间。
-
10-
1-质粒DNA酶切较完全；2-有一部分质粒DNA被酶切了，而有另一部分无；3-质粒DNA被酶切了，但是另一部分太少，所以显现清楚；4-未酶切的质粒DNA。
质粒的提取与酶切实验报告
质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的方法，用于提取和分离特定的DNA 分子或者蛋白质分子。
这些分子通常用于进一步的分析和研究，比如测序、克隆、表达、结构分析等。
质粒提取是指从细胞或组织中提取DNA 的过程。
这通常包括将细胞破碎或消化，然后使用不同的化学方法去除蛋白质、脂质和其他污染物，最后得到纯的DNA。
常用的质粒提取方法有沉淀法、超声法、溶剂法、离心法和酶法等。
酶切实验是指使用酶切特定的序列，将DNA 或蛋白质分割成较小的片段的实验。
常用的DNA 酶有限制性内切酶、全基因组酶和多克隆抗体酶，常用的蛋白质酶有蛋白酶K、蛋白酶D 和蛋白酶R。
酶切实验可用于检测和鉴定特定的DNA 序列或蛋白质分子、研究基因组结构和功能、分离和纯化蛋白质分子等。
在进行质粒提取和酶切实验时，应注意实验条件的控制，包括温度、pH 值、酶的活性和浓度、酶的孵育时间和物质的浓度等。
此外，应注意保护样品的纯度，避免受到污染或酶的抑制。
在进行酶切实验时，还应注意使用适当的酶抑制剂来控制酶的活性，以防止不必要的酶切。
在实验报告中，应详细记录实验条件和步骤，并描述样品的特征和纯度。
对于质粒提取实验，应记录使用的提取方法、提取效率和纯度，并对提取的质粒进行简单的鉴定。
对于酶切实验，应记录使用的酶种类和条件、酶切特异性和效率，并对酶切的片段进行简单的鉴定。
总的来说，质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的基础实验，在进行这些实验时应注意实验条件的控制和样品的纯度，并在实验报告中详细记录实验条件和结果。
质粒DNA的提取、酶切及检测
医学课件ppt
10
溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；
NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，这是 由于细胞膜发生了从双层膜结构向微囊 结构的相变化所导致。SDS是为下一步 操作做的铺垫。
医学课件ppt
11
溶液III，3 M醋酸钾/ 2 M醋酸。
钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不 溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀 更完全。钾钠离子置换所产生的大量沉 淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大 肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀。 因为基因组DNA太长了。
医学课件ppt
14
加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min质粒DNA复性
12000rpm，离心5min，取上清记录体积到一新管
上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）
12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管
（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）
12000rpm，离心2min，取上清记录体积到一新管
❖ 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 Rd菌株用d，即Hind。
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
医学课件ppt
19
II型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序， 并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于 这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都 是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA 重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识 别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核 苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8 个、9个、10个和11个核苷酸的。 II 型限 制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序， 即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向 “读”都完全相同。这种酶的切割可以有两 种方式：
实验一 质粒提取、酶切及琼脂糖电泳检测
实验一质粒提取、酶切及琼脂糖电泳检测一、实验内容1.采用碱裂解法提取质粒DNA2.采用限制性内切酶对质粒进行酶切3.采用琼脂糖电泳对所提取的质粒DNA及其酶切产物进行鉴定二、实验目的和要求1.掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法2.掌握限制性内切酶酶切DNA的操作过程3.掌握琼脂糖电泳的原理和方法三、实验仪器、材料和试剂1.仪器：摇床、无菌操作台、离心机、电泳仪、凝胶成像仪等2. 材料：移液枪、枪头、离心管、三角烧瓶等3. 试剂：LB培养基，卡那霉素，质粒提取试剂盒，琼脂糖，电泳缓冲液TAE,核酸染料，DNA Marker(DL2000，λ-Hind III digest DNAMarker), Eco R I内切酶等。
四、实验操作1. 质粒提取（1）挑取单菌落至3 mL LB液体培养基，37℃摇动（200 rpm）培养过夜。
（2）转移菌液至1.5 mL Eppendorf管中，12000 rpm离心45 sec，尽量弃尽上清。
（3）加入250 l 预冷的PI(请先检查是否加入RNaseA)，使用移液器彻底混匀细菌沉淀，充分悬浮，静置2 min。
注意：如果有未彻底悬浮的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度的偏低。
（4）向离心管中加入250ul溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注意：温和地混合，不要剧烈振荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。
此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒收到破坏。
如果未变得清亮，可能菌体过多，裂解得不彻底，应减少菌体量。
（5）向离心管中加入350ul 溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。
12,000rpm离心1min，此时在离心管底部形成沉淀。
注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小的白色沉淀，可再次离心后取上清。
（6）向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500ul的平衡液BL，12,000rpm 离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附管重新放入收集管中。
动物分子生物学实验6重组质粒DNA的提取及插入DNA的酶切鉴定
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四、实验步骤
接含质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 370C，190rpm振荡培养过夜
取1.5ml菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体 100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）
10min 加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体
3 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混匀，室 温放置10 min。
4 加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，混匀内 容物，将离心管放冰上5 min。
5 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数 次使混匀。冰上放置15min。
6 12 000r/min，离心10 min，将上清转至另一离心管中。 向上清中加入等体积酚：氯仿 (1:1)（去蛋白），反复 混匀，12 000r/min，离心5 min，将上清转至另一离心 管中。转移时小心！（total volume: 400 μL）
－ 原核细胞 － 繁殖力强, 2-30 分细胞分裂、加倍
DNA
基因组107bp, 编码约2000种蛋白质
质粒（plasmid）
－ 染色体外的稳定遗传因子
－ 双链、闭环的DNA分子，大小1-200 kb 不等 － 存在于细菌、放线菌和真菌细胞中
－ 具有自主复制和转录能力，并表达所携带的遗传信息
DNA
*溶液II 0.2mol/L溶液(3M, pH=4.8)：
60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O
*饱和酚(pH8.0 Tris-HCl饱和) *氯仿 *3M乙酸钠溶液(pH5.2) * TE缓冲液:
10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, * 100%乙醇与70％乙醇
质粒提取酶切实验报告
质粒提取酶切实验报告实验一质粒的提取酶切实验目的掌握质粒小量快速提取法。
用琼脂糖凝胶电泳法鉴定其纯度。
实验原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子。
大小在1~200kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子。
主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。
他可独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞的某些表型。
采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。
用酒精沉淀洗涤，可得到质粒DNA。
在细胞内，共价闭环DNA（cccDNA）常以超螺旋形式存在。
若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA（ocDNA）。
在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。
限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA 分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序DNA片段。
EcoR=1\*ROMANI和Bgl=2\*ROMANII的识别序列和切口是：EcoR=1\*ROMANI：G↓AATTCBgl=2\*ROMANII:A↓GATCTG，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。
用已知分子量的线状DNA为，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。
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了解DNA限制性核酸内切酶酶切 鉴定原理
质粒提取原理
质粒的提取主要是利用共价闭合环状质
粒与线性染色质在拓扑学上的差异：在
碱性环境中，线性的大分子细菌染色体
DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然
状态；
溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠 （Sodium dodecyl sulfate, SDS）可使细胞 壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS） 处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上， 离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清 液中。再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质 粒DNA。
Ⅱ型酶识别序列特点— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端切口
粘端切口
钝性末端
粘性末端
掌握质粒DNA提取的原理与方法
（5）向上清液中加入等体积苯酚/氯仿，震荡混
匀，13 000 r/min离心2 min，300 μL上清液转
移至新的离心管中。
（6）向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室 温放置2 min。离心5 min，倒去上清乙醇溶液， 将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
（7）加入1 mL 70 %乙醇，震荡并离心， 13 000
分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，基因工程技术中常用Ⅱ型 Ⅰ型酶具有限制和DNA修饰作用，且识别及切 割位点不同（下游100-1000bp） Ⅲ型酶具有限制和DNA修饰作用，识别及切割 位点不同（相距较近）
Ⅱ型限制酶特点
（1）识别及切割位点相同 （2）识别序列通常为4～8bp的回文结 构；
（3）切割可产生两类切口，三种末端。
Marker
质粒DNA过夜酶切
操作步骤(Methods)
分组：4人/组，每组提取两种质粒（空 载及重组质粒） 1.质粒的提取 （1）接种一个单菌落（single colony）
于5 mL含相应抗生素的LB培养基中， 37℃振荡培养至饱和状态（A600=0.4） 或过夜。（教师准备）
（2）取1.5 mL离心管一支，加入1.4 mL菌液， 13 000 r/min离心1 min去掉上清液。加入 150 μL 的溶液Ⅰ，充分混悬细菌，在室温 下放置10 min。 （3）加入200 μL新配制的溶液Ⅱ。加盖， 颠倒5次使之混匀。冰上放置5 min。 （4）加150 μL预冷的溶液Ⅲ，加盖后颠倒5 次混匀，冰上放置15 min。13 000 r/min离 心5 min，取400 μL上清液移入另一离心管 中。
具有自我复制功能。
带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物 经改造后具有多克隆位点。
质粒 (plasmid)
特点
能在宿主细胞内独立自主复制；带有某 些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状
限制性核酸内切酶：
概念 ------基因工程的手术刀
是分子生物学研究中的一种工具酶， 能识别DNA的特异序列, 并在识别位点或 其周围切割双链DNA的一类内切酶。
实验一 质粒提取及酶切鉴定
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相关基础知识
基因工程（genetic engineering） 是指采用人工方法将不同来源的
DNA进行重组，并将重组后的DNA引
入宿主细胞中进行增殖或表达的过
程。
基因工程相关物质
目的基因 工具酶 载体
质粒
存在于细菌细胞内、染色体外、共价闭合的 小型环状DNA分子(covalent closed circular DNA)。
由于操作原因，提取的质粒可有三种结构： 线形、开环、闭环超螺旋。
Relaxed circle Linearized form
Super-coiled form
质粒DNA酶切鉴定的原理
与DNA分子量标准物（Marker）比较能
大概判断未知DNA的分子量
质粒DNA为环状，在酶切彻底的情况下
，DNA片段数与酶切位点数目相同
如：EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是： EcoRⅠ：G↓AATTC
HindⅢ：A↓AGCTT
作用
与甲基化酶共同构成细菌的限 制 修 饰 系 统 （ restriction-
modification system），限制外源
DNA， 保护自身DNA。
分类
酶结构、作用、识别及切割特异性的不同
r/min离心2 min，倒去上清液，晾干，加入20
μL的 TE缓冲液，使 DNA完全溶解，待用。
2.质粒DNA的酶切鉴定
取一只1.5mL EP管加入以下试剂： 酶切混合液：15 μL 质粒DNA：5 μL
混匀后，置37 ℃过夜保温，反应源自结束后4 ℃放置备用。