农杆菌介导的植物转基因技术实验指导
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。
二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。
共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。
三、材料及方法1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。
2.植物幼苗。
（一）细菌培养液直接浸染法操作︰（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。
取自无菌试管苗。
取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。
（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。
（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。
取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。
从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。
取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
20 【终版】农杆菌介导的烟草转gfp基因(叶盘法)
1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。
转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。
1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。
◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。
◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。
◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。
1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。
植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。
原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。
多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。
农杆菌介导甘蓝转化实验
农杆菌介导甘蓝转化实验摘要：农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，将外源DNA导入受体。
本实验主要材料是中甘十一号甘蓝种子。
该品种早熟丰产，冬性较强，并且早熟，适于我国华北、东北、西北及华南、中南、西南、华东等部分地区。
用中甘十一号甘蓝种子发芽，接入MS培养基制成无菌苗，超净工作台下取下胚轴和带柄子叶，接入脱分化培养基获得外植体。
再利用LB固体培养基做平板划线培养农杆菌，挑取单菌落在LB液体培养基培养至OD：0.3-0.6。
将外植体在30ml加入了3ml农杆菌的MS0培养基浸泡，完成转导。
接回原培养基，7天后移入含500mg/L头孢霉素的抑菌培养基。
一星期后进行继代培养，接入300mg/L头孢霉素培养基，再进行结果检测。
Abstract: Agrobacterium is a gram-negative bacteria, in the natural conditions become injured parts of infection most dicots and gymnosperms, exogenous DNA into receptor. The main material of this experiment is in the sweet eleven cabbage seeds. The variety of the early harvest, winter is strong, and premature, suitable for parts of North China, northeast, northwest and southwest, South, Southern China, East china. No. eleven seed germination of cabbage sweet use, access to MS medium made of aseptic seedlings, ultra-clean table from hypocotyl and cotyledon with petiole explants dedifferentiation, gain access medium. Then using LB solid medium plate streaking cultivation of Agrobacterium, taking one colony culture medium to OD:0.3-0.6 in liquid LB. The explants in 30ml joined the 3ml of Agrobacterium tumefaciens MS0 medium soaking, complete transduction. Back to the original medium, 7 days into the trichostatin 500mg\/L containing Cephalosporium medium. A week after the subculture, access 300mg\/L cefotaxime medium, then the test results.关键词：甘蓝转基因外植体前言：甘蓝近年来随着国内周年供应需求及出口贸易的增加，出于甘蓝产业发展的需要，甘蓝遗传育种的重要性日益凸显，对遗传育种目标提出许多新的要求。
农杆菌介导的植物转基因技术
农杆菌介导的植物转基因技术
农杆菌介导的植物转基因技术（Agrobacterium-mediated plant transformation）是一种常用的植物遗传转化技术。
该技术利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体，将外源基因
导入目标植物细胞，使其产生转基因植物。
农杆菌天然具有植物细胞转化的能力。
当农杆菌感染植物时，其携带的质粒（T质粒）能够在植物细胞中插入外源基因，并
将其转化为转座子形式，随后将其整合入宿主植物基因组中。
转座子通常包含目标基因、转座酶和调控序列，它们共同确保外源基因正确表达。
T质粒还携带有自身所需的发育激素和植
物生长调节物质，以维持转化后细胞的生存和分裂。
农杆菌介导的植物转基因技术具有许多优点。
首先，它可以用于许多不同植物物种的基因转化。
其次，该技术可以实现整株或局部的基因转化，包括细胞、组织、器官或整个植株。
此外，农杆菌介导的转基因技术可实现稳定遗传转化，外源基因可以遗传到植物后代中。
最后，该技术对植物基因组中的特定位点插入外源基因，使得外源基因可以与内源基因进行正常结合。
随着转基因技术的不断发展，农杆菌介导的植物转基因技术仍然广泛应用于研究和农业生产领域。
它为植物功能研究、抗病虫害、提高产量和改善品质等方面提供了有效手段。
然而，农杆菌介导的转基因技术也面临着一些挑战，如转化效率低、插入位点随机性以及响应植物抗性等问题。
因此，研究人员不断探索新的转基因技术和改进农杆菌介导的植物转基因技术的方法，以改善转基因植物的性状和应用。
实验三(1)通过根瘤农杆菌转化拟南芥
4．将沉淀用200ml浸染液重悬，形成均匀的农杆菌悬浮液 （OD600=0.8左右），并将农杆菌悬浮液转移到一个敞口 的器皿中（500ml烧杯）。 5．选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬 浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约 20-30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触。同一个烧杯中 的农杆菌悬浮液可以转化10株或者更多株拟南芥。在此过 程中，尽量避免将蛭石倒入农杆菌悬浮液中。 6．将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时。注意保持一定的 湿度。 7．24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条 件下使其正常生长。 8．大约三周后收取成熟种子。
人工改造后的Ti质粒
1.保留T-DNA的转移功能，去掉T-DNA的致瘤性， 有利于转化体再生植株； 2.在T-DNA左右边界序列之间构建一段DNA序列， 其上含有一系列单个的限制性内切酶的识别位点、 即单克隆位点，以利于插入外源DNA和其后的操 作； 3.具有目的基因表达所需的启动子、终止子以及提 供重组细胞筛选的标记基因等； 4.具有使质粒能够在大肠杆菌中进行复制的DNA复 制起始位点，某些载体还同时带有可在农杆菌中 进行复制的起始位点。
思 考 题
1．目前拟南芥稳定表达有几种基本的方法？ 试分析不同转化方法的优缺点。 2．植物转基因技术有哪些应用? 3．拟南芥作为研究植物发育的重要模式植株 之一，请问有哪些特性？
培养基配制
准备—下周筛转基因种子和萌发实验。每两个人一 组，准备下述平板： （1）1个含有卡那霉素（50 mg/L）的 1/2 MS固体 平板； （2）1个1/2 MS固体平板（不含任何抗生素或者是 激素）； （3）一个加200 mM NaCl 1/2 MS固体平板（不含 抗生素）； （4）一个加1µM ABA 2 MS固体。 灭菌后将平板倒好并再4 ℃保存备用。
农杆菌转化法及转基因植物检测方法
农杆菌转化法及转基因植物检测方法摘要：近年来，植物基因工程技术飞速发展，转基因植物在很多领域的研究推广取得了令人瞩目的成绩。
植物基因工程中常用的转化方法一般是通过土壤农杆菌系统、植物病毒系统和DNA直接导入法这三种方法进行。
另外，转基因技术快速发展的同时转基因植物检测技术也在不断地进歩和完善，目前被广泛应用的转基因植物检测方法有三类：整合水平上的检测、转录水平上的检测和表达水平上的检测。
本文着重对农杆菌介导的植物转化方法和转基因植物的检测两方面进行综述。
关键词：农杆菌，转化，转基因植物，检测方法伴随着生命科学的飞速发展，植物组织培养技术以及植物组织分化、植物基因重组等技术发展迅速并得到广泛应用。
1984年转基因烟草的诞生[1]，使外源基因导入植物细胞从而获得转基因新品种的设想成为现实。
随后，转基因技术被广泛应用于各个方面如：植物新品种的改良、植物性状改良、植物抗性的提高以及植物基因功能的研究等[2-4]。
新型转基因大豆、转基因番茄及转基因玉米等转基因新品种陆续面世[5]。
植物转基因技术不但能够打破植物的物种界限，还能够使物种基因彼此进行交流。
使植物育种年限缩短，植物育种进程加快，植物抗性也在一定程度上得到很大提高，使来自于不同生物种类的优良目的基因导入植物并得到优良植物新品种。
同时，运用转基因技术研究植物自身基因结构组成及其基因功能调控等方面也取得了一定成果；运用转基因技术还研制出生物反应器和雄性不育系[6]。
目前，利用转基因技术将目的基因导入植物基因组中的常用方法主要有：土壤农杆菌介导的基因转化、DNA直接导入和植物病毒系统介导法。
本文着重介绍土壤农杆菌介导的目的基因转化法，同时也对目前转基因植物的检测进行适当总结。
1 土壤农杆菌介导系统的种类土壤农杆菌中的发根农杆菌和根癌农杆菌能够侵染植物伤口并形成与土壤农杆菌中大质粒有关的植物肿瘤和冠瘿。
能够诱发此类肿瘤的根瘤农杆菌中常常带有分子量为200-250kb的Ti质粒。
根癌农杆菌介导的植物遗传转化1
实验三根癌农杆菌介导的植物遗传转化一实验目的了解植物遗传转化的方法和理论掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术二原理植物遗传转化技术是指通过物理的，化学的或生物学的方法，将外源的基因导入受体植物细胞中获得再生植株的转基因技术。
自1983转基因植物问世以来，至今不到20年时间里，植物转基因技术发展迅速，除了占指导地位，运用最为广泛的农杆菌介导法，还发展了10多种转基因方法，如物理方面的基因枪法，电激法，显微注射法，超声波法，激光微束法，炭化硅纤维介导法，电泳法等；化学方面PEG介导转化，脂质体介导转化；生物学方面的种质系统法如花粉介导法，花粉管通道法等。
农杆菌介导法土壤农杆菌（Agrobacterium）是一种革兰氏阳性菌，有两个种与植物转基因有关，即根癌农杆菌（Agrobacterium Tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium Rhizogenes）.它们在自然状态下具有趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠缨瘤或发状根，在离体条件下，可以在不加任何生长素的培养基中持续生长，研究表明根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti 和Ri质粒,上面有一段T-DNA区，可以通过一系列过程进入植物细胞并将这一段T-DN插入到植物基因组中，这是农杆菌侵染植物后产生冠缨瘤或发状根的根本原因，因此农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，人们可将所构建的目的基因插入到去除了致瘤基因的Ti(Ri)质粒的T-DNA区，借助农杆菌侵染受体植物细胞后T-DNA向植物基因组的高频转移和整合特性，实现目的基因对受体植物细胞的转化，然后通过植物细胞合和组织培养技术，利用植物细胞的全能性获得转基因再生植株。
农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体植物基因组的过程，这一过程依赖与Ti质粒上的T-DNA区，和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋白质和核酸的相互作用。
简略地说。
其过程是：植物细胞在受伤后细胞壁破裂，分泌高浓度的创伤诱导分子，它们是一些酚类化合物，如乙酰丁香酮（acetosyringone,AS）和羟基乙酰丁香酮（hydroxy- acetosyringone,OH-As）农杆菌对这类物质具有趋化性，首先在植物细胞表面发生贴壁，继而植物创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达。
农杆菌介导水稻转基因技术的原理与运用分析
·29·所谓的转基因技术实际上是DNA 技术的重组方式，从外源克隆到的优良基因直接地注入到植物体的基因组织当中来，对作物的遗传性特征进行改变，使其向着人类更加向往的发展方向。
转基因技术自从问世以来实现了非常快速的发展，目前全球种植转基因的作物越来越多。
农杆菌介导是转基因技术之一，其在水稻转基因当中的应用，采取的是外源基因转化的方式，使外源基因的转化更具更正性，降其为稳定性等，进而实现大片段的基因转换等。
近年来水稻转基因技术不断地发展，并取得了相当大的成效，其中农杆菌介导水稻转基因技术发胡了重要的作用，以下降低基本的原理以及运用情况进行重点分析。
1.基本原理农杆菌介导是一种天热性的基因转化系统。
在具体的划分过程中可以分诶根瘤农杆菌和发根农杆菌。
首先，根瘤农杆菌当中有一种肿瘤诱导颗粒，这种颗粒具有可转移性的DNA 以及毒性区和冠瘿碱代谢基因。
在T -DNA 的两端是在两个数为25bp 的重复性序列，分别位于左右两个边界当中，两个边界的序列之间又是生长素和细胞分裂素合成的共性基因以及冠瘿碱合成性基因。
不同的区域内存在多个基因段，每一个基因段当中又有非常多基因。
一旦植物出现被伤害的情况，就会分泌出具有酚类化合物的一种汁液，此种汁液是通过染色体的毒性基因等介导㢟进行传输的，从而使农杆菌可以向只的其他部位上进行移动，并附着在其表面之上。
在T -DNA的转移上两个边界序列与之关系非常密切，特别是右侧的边界对于T -DNA 的精准转移是必不可少的重要条件，而且在边界序列之间也存在着一定的基因，但这些基因对于T -DNA 的转移并不发生太大的影响。
因此，T -DNA 区域的基因是可以采取外源性基金进行替代的，之后再利用农杆菌将已经改造后的T -DNA 转移到植物的基因组织当中，进而获取到转基因的植株。
伴随着科学技术水平的不断提升，农杆菌转化也进入到了非常关键的阶段，人们对此进行了多次地改造，并使其载体不断地创新与完善，转化的效率不断地提升，这样应用的范围也会越来越广泛。
植物生物技术中的基因转导技术
植物生物技术中的基因转导技术基因转导技术在植物生物技术中具有重要的应用价值。
通过基因转导技术，我们可以在植物体内引入外源基因或调控内源基因的表达，进而实现对植物性状的改良和提高，促进作物产量、品质的提升。
本文将对基因转导技术在植物生物技术中的原理、应用及挑战进行探讨。
一、基因转导技术的原理基因转导技术是通过介导物质将目标基因送入靶细胞中，使其被转录和翻译为蛋白质。
目前常用的基因转导技术主要包括农杆菌介导的转化、基因枪法和冷冻处理法。
1. 农杆菌介导的转化农杆菌介导的转化是目前最常用的基因转导方法之一。
通过将目标基因导入农杆菌中，利用农杆菌与植物细胞发生共生关系的特点，使农杆菌将目标基因传递给植物细胞。
这种方法适用于一些易感植物，因其易操作、高转化效率而被广泛应用于植物遗传转化领域。
2. 基因枪法基因枪法是一种将DNA微粒载体通过高压射击的方式导入植物细胞的方法。
通过将目标基因包裹在微粒载体上，并在射击中将微粒载体射入植物细胞内，使目标基因被植物细胞摄取。
这种方法适用于不易进行农杆菌介导转化的植物，可以克服芽体发生的障碍，对于某些作物品种遗传转化也有较高的效率。
3. 冷冻处理法冷冻处理法是一种通过植物细胞的质膜和细胞壁的物理破坏，使目标基因进入植物细胞的方法。
通过在目标基因解冻后迅速与植物细胞接触，利用渗透压和温度梯度等因素，使目标基因进入植物细胞中。
这种方法适用于不易进行农杆菌介导转化的植物，操作简便，但转化效率较低。
二、基因转导技术在植物生物技术中的应用基因转导技术在植物生物技术中具有广泛的应用前景，主要体现在以下几个方面：1. 抗病虫害基因的导入通过基因转导技术，我们可以将植物抗病虫害的基因导入到感病的作物中，使其获得抗病虫害的能力。
比如将Bt（Bacillus thuringiensis）基因导入到作物中，使其产生杀虫蛋白，从而提高作物对害虫的抗性。
这一技术的应用不仅可以减少农药的使用，降低环境污染，还可以提高作物的产量和品质。
农杆菌介导的植物转基因技术试验指导
农杆菌介导的植物转基因技术一、实验目的1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。
2学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。
二、实验原理农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。
农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。
因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。
人们将目的基因插入到经过改造的丁-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
实验一培养基配制一、仪器和试剂1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台2、药品：Beef extract （牛肉浸膏）5g/L，Yeast extract （酵母提取物）1g/L， Peptone （蛋白胨）5g/L，Sucrose （蔗糖）5g/L，100ml，Agar （琼脂）100ml， MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA （萘乙酸），6-BA（6-苄氨基腺嘌吟），卡那霉素（kan），利福平（"「，链霉素（str）。
二、实验方法第一组配制YEB固体培养基1、配制250mlYEB固体培养基：先称取Beef extract （牛肉浸膏）；Peptone （蛋白胨）；Yeast extract （酵母提取物）；Sucrose （蔗糖）；1g ；琼脂粉；将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml,用NaOH调pH=。
2、灭菌：将盛有250ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。
3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60℃时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100ug/ml kan+50Dg/ml Str+50ug/ml rif）,以免温度过高导致抗生素失效。
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化
一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。
二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。
共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、茎段等共同培养的一种转化方法（图6－1）三、材料及方法1．含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。
2．植物幼苗。
（一）细菌培养液直接浸染法操作：（1）无菌受体材料的准备：叶片、茎段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。
①取自无菌试管苗。
②取自田间或温室栽培植株：叶片、茎尖、茎段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。
（2）受体材料预培养：将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、茎切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下：预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。
（3）农杆菌培养：①从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培为0.6～0.8。
②取OD600养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入600100～500μmol/的AS；（4）侵染：于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。
从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。
取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
（5）共培养：将侵染过的外植体接种在愈伤组织诱导或分化培养基上（烟草为MS 十IAA0.5mg/L BA2.0mg/L) ，在28℃暗培养条件下共培养2～4 天（光对某些植物的转化有抑制作用，故需暗培养，共培养时间因不同植物而异）。
农杆菌介导的转化作用原理
农杆菌介导的转化作用原理
农杆菌介导的转化是一种生物技术方法，用于将外源DNA引入植物细胞中。
其原理是利用农杆菌生长势旺盛、易于培养的特点，将目标外源DNA导入到农杆菌的质粒中，形成重组质粒。
然后通过将转化质粒与植物细胞接触，使其外源DNA传递到植物细胞内部。
具体步骤如下：
1. 构建重组质粒：在质粒中插入目标外源DNA，通常使用限制性内切酶将目标基因插入到质粒的多克隆位点（多克隆位点是一段DNA序列，能够容纳外源DNA）。
2. 转化农杆菌：将质粒导入到农杆菌中，使其质粒与细菌细胞融合，形成重组菌株。
3. 培养菌株：培养重组菌株，使其扩增到大量细胞。
4. 处理植物组织：将希望转化的植物组织（例如幼嫩的叶片或胚）与农杆菌接触，使农杆菌与植物细胞发生互作用。
5. 重组质粒转入植物细胞：通过机械方法（例如悬浮培养）或生理方法（例如创伤诱导），使农杆菌穿过植物细胞的细胞壁，使重组质粒进入植物细胞。
6. 重组质粒在植物细胞中复制和表达：重组质粒在植物细胞中复制，并将插入的目标基因转录和翻译为蛋白质。
通过农杆菌介导的转化方法，可以有效地将外源基因导入到植物细胞中，实现基
因转移和基因表达的目的。
这种方法在植物基因工程和转基因技术中得到广泛应用。
农杆菌介导油菜转化实验
农杆菌介导的油菜遗传转化操作流程一、所需试剂母液配制方法1. MS母液配制方法见小孢子培养部分。
2. 6-BA（6-苄基嘌呤）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g 6-BA用微量HCl溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。
3. NAA（α-萘乙酸）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g NAA用微量NaOH溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。
4. 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g 2,4-D用微量NaOH溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。
5. AgNO3：称取0.5 g AgNO3溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤。
6. AS（乙酰丁香酮）：溶解于DMSO（二甲基亚砜），母液浓度为100 mM，0.22 μm有机系滤膜过滤，分装成小份保存。
7. Kan（卡那霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。
8. Carb（羧苄青霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22 μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。
9. Cef（头孢霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。
二、操作流程1. 无菌受体材料的准备选取饱满、干净的油菜种子用75%乙醇浸泡1 min，然后在0.1%升汞中灭菌10~15 min，无菌水冲洗4~5次，用无菌滤纸吸干多余的水分，接种于1/2 MS（添加10 g/L 蔗糖，0.7 % 琼脂，pH 5.8）培养基上，25~28℃下暗培养，待种子萌发再移至光下培养，光照16 h/d，强度2000 lx左右。
2. 受体材料的预处理取4~6 d的无菌苗子叶或下胚轴作为转化受体。
用解剖刀切下完整的子叶（带1~2 mm子叶柄）或下胚轴（5~10 mm），将切下的外植体置于预培养基（MS +30 g/L 蔗糖 + 0.7% 琼脂 + 1 mg/L 6-BA + 1 mg/L 2,4-D，pH 5.8）上进行预培养2~3 d，材料切口处刚开始膨大时即可进行接种浸染。
农杆菌如何介导植物遗传转化
农杆菌如何介导植物遗传转化？植物遗传转化技术植物遗传转化技术也称植物转基因技术，是应用DNA重组技术将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入植物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的植物遗传改良的一门技术。
目前最常用的转基因方法是基因枪法和农杆菌法。
基因枪法的基本原理是利用表面附着有外源DNA的金属微粒在高压装置中加速后高速运动到受体细胞中，从而达到转化DNA的目的。
但是基因枪法与农杆菌介导法相比，存在着转化率低、遗传稳定性较差、外源DNA整合机理不清楚、得到的转化体往往是嵌合体、转入外源基因的沉默现象突出等缺点。
接下来，这篇文章着重介绍农杆菌介导的植物遗传转化。
优点农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统，其介导的转化属于纯生物学的过程，与其它转化方法相比具有明显的优点，主要包括：(1)转化频率高；(2)可导入大片段的DNA，且导入植物细胞的片段确切；(3)导入基因拷贝数低，大多只有1-3个，表达效果好，能稳定遗传，多数符合盂德尔遗传规律。
而且，从大量的报道可以发现，农杆菌的寄主范围有很大的扩展，已经延伸到了原核生物、真菌甚至人类细胞等非植物领域。
原理农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，它对寄主细胞的转化是借助诱导瘤细胞(tumor-inducing, Ti)质粒将其中一段特定的DNA片断转入寄主细胞基因组的过程。
在自然环境中，被转移的DNA (T-DNA)携带了一套致瘤基因和冠瘿碱代谢基因，它们在植物中的表达可引起被侵染组织产生肿瘤并合成冠瘿碱作为细菌的氮源。
利用分子克隆技术可以将T-DNA替换为目标基因，使农杆菌成为一个能有效将外源基因导入植物的天然工具。
图1 农杆菌介导的基因转化。
此外，有多种植物蛋白质也参与了农杆菌介导的基因转化过程，主要作用于T-DNA胞内运输、进入细胞核以及整合阶段。
因为农杆菌主要利用植物细胞内的生物过程(例如DNA和蛋白质运输、靶蛋白水解和DNA修复)来转化其受体，研究这些基本的植物细胞生物学机制有助于扩大农杆菌的受体范围，同样也可促进转化过程和转基因植物的产物控制。
农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究
农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究农杆菌介导的植物转基因技术在研究植物基因功能、改良作物农艺性状等方面发挥着重要作用。
拟南芥作为模式植物，是研究植物基因功能的重要材料。
本文主要介绍农杆菌介导的拟南芥转基因方法——浸花法。
该方法操作简单，转化效率高，易于在中学生物实验教学中推广。
通过该实验，可以培养中学生对于生物学科的兴趣，提高学生对于生物知识的理解力和创新能力。
标签：植物转基因；农杆菌；浸花法植物转基因技术是指把目的基因通过各种方法转移到植物基因组中，使之稳定遗传。
利用该技术研究基因在植物个体生长发育以及生理代谢过程中功能，研究成果可应用于农艺性状的改良、植物经济价值和观赏价值的提高等方面。
植物基因转化的方法可分为直接转化和载体介导两种转化方法。
基因直接导入法直接将外源目的基因导入植物的基因组中，包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法、PEG 介导转化方法、脂质体法和花粉管通道法等；载体介导的转化方法需要将目的基因插入到改造后的农杆菌质粒或病毒的DN分子上，利用农杆菌或病毒对植物的侵染作用将目的基因导入到植物基因组中。
农杆菌介导的转化方法具有应用范围广，转化率高，单拷贝比例高，转化子稳定等特点，是植物转基因研究中的常用转化方法。
农杆菌能在自然条件下感染大多数双子叶植物受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
在农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，农杆菌中Ti质粒上的T-DNA可以插入到植物基因中。
科研人员经过长期的研究，将目的基因插入到经过改造T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，从而获得转基因植株。
利用农杆菌介导的转化方法进行转基因操作时，根据植物材料的不同，采用不同的转化方法，如在烟草转化时常采用叶盘法，而水稻转化则采用愈伤组织转化的方法。
浸花法（floral tip）是拟南芥转化最常用的方法。
这种转化方法不需要组织培养和再生植株的过程，操作简便、转化效率较高，为科研人员提供了极大的便利。
实验六、农杆菌介导转化拟南芥
• （1）形态个体小，生活力强,种子量大；
• （2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需 6--8周；
• （3）基因组小(2n=10)，是目前已知植 物基因组中最小的，但是具有完成“复 杂”的植物生长发育的所有基因；
2. 取上述菌液0.1ml 接至50ml 新鲜YEB液体培养基（50 g/ml Kan，125 g/ml Rif）中，28℃ 220rpm培养2～4h， 使OD值达到0.8左右。
3.取上述菌液1ml于EP管中，室温22℃，5500g，离心15min， 弃去上清，用转化介质重悬沉淀至OD值达到0.8左右。
Hale Waihona Puke • 为了提高转化率，去除塑料袋3d后，用吸管吸 取适量重悬目的质粒的新鲜转化液，逐个醮沾 花蕾。
说明
• 转化后拟南芥的培养恢复正常管理，一旦再出现 侧蘖或主苔出现分枝，及时剪除。
• 转化5-6周后，为了加速拟南芥成熟可以适量少浇 营养液。待拟南芥个别角果开始枯黄后，可将其 角果剪下放于培养皿内干燥。拟南芥角果大部分 枯黄后，即可收取全部种子存于1.5ml 的EP管中 （在盖上扎一小孔以便干燥）。种子完全干燥后， 放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于 -20℃冰箱内长期保存。
Vir区
2.3 双元表达载体系统
•
双元表达载体系统主要包括两个部分：
•
一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T
－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir
基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定1. 引言植物基因转化是一种重要的生物工程技术，利用这种技术可以引入外源基因或修改内源基因，从而改变植物的性状和功能。
转基因植物是通过植物基因转化技术获得的具有外源基因的植物，具有重要的应用价值。
本文将介绍植物基因转化的基本原理和方法，并探讨转基因植物的分析与鉴定方法。
2. 植物基因转化的基本原理和方法2.1 基本原理植物基因转化利用穿透细胞壁的技术，将外源DNA导入植物细胞，通过细胞的内源机制使其稳定地表达。
常用的植物基因转化方法包括农杆菌介导的转化、生物弹射法和基因枪法等。
2.2 基本方法2.2.1 农杆菌介导的转化农杆菌介导的转化是最常用的植物基因转化方法之一。
基本步骤包括构建表达载体、感受剂的处理和遗传转化的选择和鉴定。
构建表达载体时，将目标基因插入适当的载体上，并添加转录和翻译的调控序列，如启动子和终止子，以确保目标基因的表达。
感受剂的处理是将表达载体导入农杆菌中，并通过培养条件的优化，使农杆菌中的表达载体得到高效表达。
遗传转化的选择和鉴定是将感受剂经过适当的处理后，转化到植物细胞中，并通过筛选和鉴定来确定转化成功的细胞株。
2.2.2 生物弹射法生物弹射法是将DNA以高速撞击植物细胞，使其穿透细胞的质壁和细胞膜，进而将外源基因导入细胞内。
生物弹射法通常使用微粒子加速器或毛发管射击法进行。
微粒子加速器是一种将金属微粒或微球与外源DNA一起加速，并将其发射到目标细胞上的设备。
通过微粒的高速撞击，外源基因能够穿透细胞的质壁和细胞膜。
毛发管射击法是将DNA包裹在微小的金属颗粒上，然后使用高压气体将金属颗粒射击到目标细胞上。
这种方法也能够使外源基因穿透细胞膜进入细胞。
2.2.3 基因枪法基因枪法是将外源DNA包裹在金粒或微米级金属颗粒上，并使用高压气体或炮发射器将其穿过细胞质，进入植物细胞。
基因枪法不需要依赖转化菌或细胞融合等辅助手段，直接将外源DNA送入目标细胞，因此具有较高的成功率。
农杆菌介导的植物转基因技术
（七）侵染后的培养
首先将红花子叶置于共培养上，使其生长。培养一周后，将其转入 分化培养基上，进行培养，待其诱导分化出不定芽后，继续培养，不定 芽分化成苗后，将其移入生根培养基中，培养获得转基因植株。
六、实验结果
农杆菌侵染时间
8min
10min 12min
15min
20min
25min
10
外植体数量
2、农杆菌遗传转化的优缺点？
将农杆菌离心，2000 rpm，10min，收集菌体,目的是去除细菌培养基的高浓度盐。
Target gene 生根培养基（MS+IBA+NAA）；
用液体MS培养基将菌
3、材料：红花无菌苗。
Ti质粒上有一段T-DNA区，人们将外源基因插入到T-DNA区，借助农杆菌的感染使携带体外源用基移因的液T-枪DN吹A区打转入起植来物基，因组中，从而实
农杆菌介导的植物转基因技术
一、转基因植物概述
转基因玉米
转基因辣椒
转基因玫瑰
日闭幕的东京国际花卉博览会上，全球首批真正的蓝玫瑰首次在公众面前亮相。
二、实验目的
1、学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理； 2、掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术 的操作流程。
三、实验原理
根癌农杆菌，属根瘤菌科，为革兰
产生 冠瘿瘤
四、实验仪器与试剂
1、仪器：超净工作台，离心机，恒温摇床，组织培养室；
2、试剂：农杆菌EHA105，YEB培养基，MS液体培养基，共培 养基（MS+6-BA+NAA），分化培养基（MS+6-BA） 生根培养基（MS+IBA+NAA）；
3、材料：红花无菌苗。
实验六、农杆菌介导转化拟南芥
实验六、农杆菌介导转化拟南芥
实验目的：学习真核生物的转基因技术及农杆菌介 导的转化原理。
•实验要求：掌握农杆菌介导转化拟南芥 的实验方法， 了解拟南芥的生理特点及在基因工程实验中应用。
• 技术应用：一种方便，高效的植物转基因方 法，多用于转化双子叶植物，经过改进后也 逐渐用于单子叶植物的转化。
• 实验材料： 农杆菌GV3101重组菌株，重组双元 表达载体pCAMBIA1300 ，拟南芥
4. 将待转化的拟南芥植株平放，将花蕾部分插入2mlEP管中， 加入上述转化液，浸染5min(如图)。轻轻甩掉浸液，做好 标记。
农杆菌介导转化拟南芥
转化后的管理
• 在箱底撒水保湿，然后将花盆平放到箱子中， 并用塑料袋罩住箱子暗培养16-24h（过夜）后， 将拟南芥放置于塑料培养池内，并浇足 horgland营养液，恢复正常培养。
Vir区
2.3 双元表达载体系统
•
双元表达载体系统主要包括两个部分：
•
一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T
－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir
基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
•
另一部分是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在
T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如
• （4）拟南芥是自花授粉植物，易于获 得纯合突变体。
• 1.2 拟南芥的培养：
• 将拟南芥种子经10%双氧水消毒后接种 于MS培养基上，于22℃、光照10h培养12周，长出无菌苗后转移至坧石和土（3：1） 混合物上培养。
• 注意： 湿度要大一些。
2.转化原理
• 2.1 农杆菌对双子叶植物的创伤部位侵染广泛， 在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
农杆菌介导的植物转基因技术
一、实验目的
1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。
2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。
二、实验原理
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。
农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将
T-DNA插入到植物基因组中。
因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
实验一培养基配制
一、仪器和试剂
1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台
2、药品：Beef extract （牛肉浸膏） 5g/L ，Yeast extract （酵母提取物）
1g/L ，Peptone （蛋白胨） 5g/L ，Sucrose （蔗糖） 5g/L ，MgSO4.7H2O
0.4g/100ml ，Agar （琼脂）1.5g/100ml，MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA
（6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif ），链霉素（str ）。
二、实验方法
第一组配制YEB固体培养基
1、配制250mlYEB固体培养基：先称取1.25g Beef extract （牛肉浸膏）；
1.25g Peptone （蛋白胨）；0.25g Yeast extract （酵母提取物）；1.25g Sucrose
（蔗糖）;1g MgS04.7H2O琼脂粉3.75g ;将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取
200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml,用NaOH调pH=7.4。
2、灭菌：将盛有250ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。
3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ）,以免温度过高导致抗生素失效。
4 、倒板：将抗生素与培养基混匀，每个平皿倒15ml 培养基，可以倒16个平皿，倒完后打开平皿盖，在紫外灯下照10min,等待培养基凝固，盖上平皿盖，封口备用。
第二组配制YEB液体培养基
1、配制500mlYEB液体培养基：先称取2.5g Beef extract （牛肉浸膏）;2.5g Peptone （蛋白胨）; 0.5g Yeast extract （酵母提取物）; 2.5g Sucrose （蔗糖）; 2g MgSO4.7H2O将上述药品置于500ml三角瓶中，用量筒称取450ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至500ml，用NaOH调pH=7.4。
2、灭菌：将盛有500ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。
3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ），以免温度过高导致抗生素失效。
4 、分装：将培养基分别分装到试管和三角瓶中，每个试管中分装5ml，分
装12个试管。
每个三角瓶中倒入35ml，共12个三角瓶。
5、分装好后，封口备用。
第三组配制MS液体培养基
1、配制500mlMS液体培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS 粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后混匀定容至500ml,用NaOH 调pH=5.8。
2、灭菌：将盛有500ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。
3、乙酰丁香酮的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触
摸）加入已经过滤好的乙酰丁香酮。
4、分装：将培养基分别分装到三角瓶中，每个三角瓶中倒入40ml，共12个
5、分装好后，封口备用。
第四组配制MS共培养基
1、配制500mlM9固体共培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS 粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA （按照实际需要，根据母液浓度计算用量），混匀定容至500ml，用NaOH调pH=5.8, 然后再加入7%的琼脂粉3.5g。
2、灭菌：将盛有500ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。
3、分装：将培养基分别分装到平皿中，每个平皿中倒入25ml，共20个平皿。
4、分装好后，封口备用。
第五组配制MS分化筛选培养基
1、配制1000mlM9固体共培养基：用2个500ml三角瓶进行盛取，先在500ml 三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe 盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA （按照实际需要，根据母液浓度计算用量），混匀定容至500ml，用NaOH调pH=5.8，然后再加入7%勺琼脂粉3.5g。
2、灭菌：将盛有500ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌
3、分装：将培养基分别分装到平皿中，每个平皿中倒入25ml,共40个平皿。
4、分装好后，封口备用。
第六组配制MS生根培养基
1、配制500mlM9固体共培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取
2.15gMS粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA（根据母液浓度计算用量），混匀定容至500ml，用NaOH调pH=5.8，然后再加入7% 的琼脂粉
3.5g。
2、灭菌：将盛有500ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。
3、分装：将培养基分别分装到100ml三角瓶中，每个三角瓶中倒入35ml，共14个三角瓶。
4、分装好后，封口备用。
实验二植物转化工程菌的制备
一、仪器和试剂
1仪器：低温离心机（德国EPPENDO公司）；恒温培养箱（哈东联）；超净工作台（苏州净化），恒温摇床。
2 试剂：根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens.）菌种EHA105 YEB培养基，接种
环，牙签。
二、实验方法
1、将农杆菌接种于附加50mg/L卡那霉素、50mg/L链霉素、50mg/L利福
平的YEB固体培养基上，28E暗培养48h，至长出单菌落。
2、用接菌环挑取单菌落，接种在含相应抗生素的YEB液体培养基中，于28C, 180rpm,培养过夜。
3、待菌液长至OD600为0.4 ~ 0.6 时，将其按1 : 10的比例接种到新鲜的上述培养基中振荡培养，进行二次活化。
实验三农杆菌侵染转化
一、仪器和试剂
1仪器：超净工作台（苏州净化），植物组织培养箱2试剂：根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens.）菌种EHA105红花无菌苗,
MS液体培养基，共培养基（MS+6-BA+NAA手术刀，镊子，剪刀，滤
纸，培养皿。
二、实验方法
1、当农杆菌OD60C为0.5 ~ 0.6时，吸取菌液于无菌50ml离心管中，2000 rpm,离心10mi n,弃上清，收集菌体，用等体积的MS液体培养基将菌体重悬，备用。
2、侵染取红花无菌苗，在超净工作台中将子叶上下边缘切掉，置于无菌
培养皿内，加入适量重悬好的菌液，侵染8~25 min （第一组侵染8min，第二组侵染10min，第三组侵染12min，第四组侵染15min，第五组侵染20min，第六组侵染25min）,此间要不时的摇动。
3、除菌侵染完成后，弃去菌液，用无菌滤纸吸干多余的菌液。
4、共培养侵染过的红花子叶接种于共培养培养基上，28E暗培养3d，观察是否有农杆菌过量生长。
实验四农杆菌侵染转化
一、仪器和试剂
1仪器：超净工作台（苏州净化），植物组织培养箱。
2试剂：根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens.）菌种EHA105红花无菌苗, 无菌水，分化培养基（MS+6-BA,滤纸，镊子，培养皿。
二、实验方法
1、除菌取共培养后染菌的植物材料，放于无菌三角瓶内，先用无菌水（可以添加抗生素）冲洗至溶液澄清为止。
（如果没有农杆菌滋生的，此步骤可省略）
2、分化培养将除菌后的植物材料转至分化筛选培养基中进行转化筛选，诱导再生植株，每天观察，记录分化情况，以后每两周继代一次。
3、生根培养将分化得到的分化苗放入生根培养基中，进行培养，每天观察，统计生根情况。
三、数据处理
原始数据表。