实验六_植物原生质体分离及融合

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植物原生质体的分离及融合

植物原生质体的分离及融合生93沈睿2009012372同组：古梦婷实验日期：2011年11月2日一．实验原理1.原生质体分离原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。

细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。

2.原生质体融和诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。

本实验用PEG诱导原生质体融和。

PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。

PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。

当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。

PEG也能连接Ca2+等阳离子。

Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。

在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。

高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。

普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。

PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。

二．实验步骤1.原生质体的制备（1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。

（2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。

（3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。

（4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。

植物原生质体的分离与融合

实验六植物原生质体的分离与融合一、实验目的：1、掌握原生质体分离的方法；2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。

二、实验原理：PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。

普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。

该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。

三、实验材料：（1）韭菜或大蒜叶；（2）红辣椒四、实验步骤：Ι 植物原生质体的分离与纯化1、酶解：将撕去表皮的植物叶片和果肉置于酶液（PH 5.4_5.8,去表皮面接触酶液），在适宜温度条件下，避光酶解数小时。

2、过滤：用350目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。

3、原生质体收集：在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。

红辣椒800转/分离心5分钟。

4、洗涤：弃上清液，留沉淀约1ml，加入4ml13%CPW洗液，相同条件下再离心，弃上清液。

弃上清液，留沉淀约1ml，混匀呈悬浮备用。

5、纯化：**蔗糖漂浮法去除碎片法：（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液约3ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。

或者（1*）换一洁净离心管加入20%蔗糖溶液约3ml，然后小心将原生质体悬液平铺于离心管表面。

（以上任一方法皆能看到明显界面）(2)离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中。

注意下步镜检决定是否需要:加入3～4ml13%CPW洗液离心，离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），收集沉淀，最终原生质体体积控制在0.5ML左右。

Ⅱ细胞融合1．不同的原生质体各300μl与带盖离心管中，另加入300μl 40% PEG液，30℃水浴中温浴15min；2．融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能太干)，轻轻盖上盖玻片，显微镜观察。

04-植物原生质体的制备及融合-卢文

原生质体的制备及融合生31 卢文2003012377一、实验目的：a)学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体形态。

b)学习植物原生质体的融合技术，观察融合原生质体时其形态及变化。

二、实验原理：详见讨论。

三、实验用品：显微镜、擦镜纸、剪子、镊子、小平皿、吸管、直式漏斗、300目尼龙网、10ml离心管、载玻片、盖玻片。

四、试剂：a)洗涤液：甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 2mMpH=5.6b)酶混合液：纤维素酶1%果胶酶0.5-0.7%甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 7mMMES 3mMpH=5.6c)PEG溶液：PEG-6000 40%CaCl2·2H2O 3.5mMKH2PO4·H2O 0.7mM葡萄糖0.3mMpH=5.8d)高Ca，高pH洗涤液：CaCl2·2H2O 100mMTris 50mM山梨醇100mMpH=10.5e)蔗糖溶液：20%五、实验步骤：a)原生体的制备i.将新鲜花瓣用蒸馏水洗干净，用滤纸吸干表面水分。

ii.用尖头镊剥去木料的下表皮或将其剪成小细条，加入几滴酶液恒温振荡半小时。

iii.酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，加入少量洗涤液定容至4ml，此时，未被酶解的大块组织留在尼龙网上。

iv.500rpm离心5分钟，弃去上清液，加洗涤液至约2ml吹打均匀。

500rpm5min重复离心一次，彻底去除酶液。

v.加8滴洗涤液，悬浮原生质体。

vi.镜检，检察原生质形态和浓度，看看是否有碎片，本试验中碎片较少，故未做蔗糖漂浮。

b)PEG融合：i.在小平皿内各滴三滴原生质体悬液，静置沉淀。

ii.各缓缓滴加一滴PEG在其中两滴原生质体悬液上，iii.在另一滴上滴加一滴高Ca2+高pH洗液。

iv.镜下观察，1-2分钟后，在原先加入PEG的一滴悬液上加入一滴高Ca2+高pH洗液。

植物细胞融合(实验)

On cell division nuclear material condenses together and hybrids cells are formed that contain DNA from both parental lines.
Potato plants growing in a test tube
Phenotype of intraspecific diploids of S. tuberosum
US-W9310.3 Somatic hybrid US-W9545.99
在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂质与类脂质反应。继之，类脂质分子的扰动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合，形成很小的细胞质桥，之后它逐渐扩大，两个原生质体最终融合。
使用化学促融剂时，Ca2+是必需的。关于Ca2+的作用机理，有的认为是Ca2+和 PO43-形成不溶于水的配合物，成为细胞间的钙桥，由此引起融合。也有解释为Ca2+ 结合到带负电磷脂的电离基上，使磷脂分子在膜上相互分离，由此引起融合。
Putative somatic hybrid plants
A fertile somatic hybrid
Phenotype of somatic hybrids clearly shows characteristics of both parents
S. brevidens somatic hybrid S. tuberosum
电融合法原生质体的融合结果
原生质体成串（40×）
原生质体融合（图1）
电融合法原生质体的融合结果
原生质体融合（图2）原生质体融合（图3）

植物原生质体的分离与融合

实验七植物原生质体的分离与融合一、实验目的：1、掌握原生质体分离的方法；2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。

二、实验原理：PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。

该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。

三、实验材料：（1）韭菜或大蒜叶；（2）红辣椒四、实验步骤：Ι 植物原生质体的分离与纯化1、将撕去表皮的植物叶片和果肉置于酶液（PH 5.4_5.8,去表皮面接触酶液），在25℃黑暗条件下，酶解0。

5小时。

2、用200目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。

3、在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。

红辣椒800转/分离心5分钟。

加入3～4ml13%CPW洗液，相同条件下离心，弃上清液。

加1ml 13%CPW洗液悬浮。

4、蔗糖漂浮法去除碎片。

** 蔗糖漂浮方法：（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液约3ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面(注意要有明显界面).(2)离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心（镜检决定是否需要离心），离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），收集沉淀，最终原生质体体积控制在0.5ML左右。

细胞生物学实验材料

实验一荧光显微镜的原理和使用实验二叶绿体的分离与荧光观察实验三线粒体的活体染色与观察实验四细胞膜的通透性实验五 DNA的细胞化学——Feulgen反应实验六植物染色体标本的制备和观察实验七细胞计数实验八植物细胞骨架的光学显微镜观察实验九植物原生质体的分离和活性鉴定实验十环境因素诱变染色体改组的观察实验一荧光显微镜的原理和使用一、实验目的了解荧光显微镜的构造及其维护方法；掌握荧光显微镜的使用方法和使用中的注意事项。

二、实验原理荧光显微镜是选择由高压汞灯或类似光源发出一定波长的激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，观察细胞某种特异成分的分布状态的显微镜。

与普通光学显微镜一样，荧光显微镜也有物镜、目镜、调焦装置、光源、聚光器、载物台、镜身等组成部分。

所不同的是，荧光显微镜增加了激发光源和滤片系统，它投射到样品上的是特定波长的激发光而不是普通的可见光。

在激发光的作用下，样品中的荧光物质产生图1荧光显微镜发射光（即荧光）。

因此，荧光显微镜观察到的是样品中能产生荧光的部分所呈现的荧光映象，普通光学显微镜则是整个样品的可见光透射和折射影像。

某些物质在—定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。

若停止供能荧光现象立即停止。

有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。

有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。

利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。

因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。

三、实验用品荧光显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、解剖刀、0.01%吖啶橙染色液（acridine orange）、蒸馏水、水葫芦叶片四、实验内容与方法（一）荧光显微镜的构造1、基本装置荧光显微镜的基本装置是由普通光学显微镜加上一些附件（如荧光光源、激发滤片、二向色镜和阻断滤片等）的基础上组成的。

ch02植物原生质体的分离、融合及培养

五、影响原生质体活力的因素原生质体活力？原生质体活力？有活力的原生质体数占所观察原生质体总数的比例 1. 分离材料的生理状态分离材料的生理状态 2. 酶解条件：酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压
3. 分离条件：分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间环境条件：操作环境的温度、光照、 4. 环境条件：操作环境的温度、光照、分离用具的影响
3. 酚藏花红染色法有活力－无色，无活力－有活力－无色，无活力－红色 4. 荧光增白剂染色法结合细胞壁－绿色荧光，叶绿素－结合细胞壁－绿色荧光，叶绿素－红色 5. 伊凡蓝法伊凡蓝不能穿过质膜，伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏时，细胞才能被染色，严重损坏时，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。通过细胞被染色与否确定活性。
3. 梯度离心法利用比重不同的溶液，利用比重不同的溶液，离心后使原生质体处于两液相交界面，而杂质沉于管底。质体处于两液相交界面，而杂质沉于管底。
四、原生质体活力检测
1. 目测法在显微镜下观察，根据细胞形态、在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。定原生质体活力。 2. FDA（fluorescein diacetate, 二乙酸荧光素）二乙酸荧光素）（法 FDA是一种非极性物质，能自由地穿越细胞是一种非极性物质，是一种非极性物质质膜，在活细胞内，质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光被酯酶裂解即发荧光荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，），由于荧光素不能自由通过质膜（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。观察确定细胞活性。

原生质体的分离与融合

原生质体融合技术体系大致包括三大环节：
02
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简意赅地阐述观点。
诱导原生质体融合
03
杂种植株的再生与鉴定
选择融合体或杂种细胞
(一) 原生质体融合
原生质体融合（Protoplast fusion）是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。自然融合（Spontaneous fusion）来源于分裂旺盛细胞的原生质体，自发融合的频率较高。小孢子来源的原生质体融合率可高达50~70%。实际上自然条件下受精就是一种自发融合。
2.酶法
原生质体的分离
01
二、影响原生质体分离的因素
01
原生质体分离时主要考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透
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压、酶解时间、温度等。
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组织和细胞材料的生理状态
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植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体
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的最方便、最合适的植物材料。叶肉细胞排列松散，酶试剂很
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容易达到细胞壁。用于分离原生质体的愈伤组织或悬浮细胞应
添加标题
质杂种。
体细胞杂交
物种间生殖隔离阻碍了物种之间的基因交流，从而给作物育种带来很大的局限性。原生质体融合技术是实现基因重组的一条新途径，目前利用细胞融合已从很多物种、属间，甚至科间获得体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物类型。
01
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简意赅地阐述观点。
01
体细胞杂种的应用
一、体细胞杂种的应用潜力
添加标题
植物育种中的核质替换
添加标题
细胞质杂种的获得
添加标题
远缘杂交创造新物种

植物生理学实验指导

植物生理学实验指导目录植物材料的采集、处理与保存..................................... 实验一拟南芥种植和形态观察................................... 实验二植物细胞的活体染色和死活的鉴定......................... 实验三植物原生质体的分离和融合............................... 实验四植物叶面积测定原理、方法和步骤......................... 实验五植物细胞渗透势的测定（质壁分离法）..................... 实验六植物组织水势的测定（小液流法）......................... 实验七植物根系活力的测定（TTC法）............................ 实验八根系总吸收面积和活跃吸收面积的测定..................... 实验九离体叶绿体的制备以及完整度的测定....................... 实验十叶绿体色素的提取、分离和理化性质....................... 实验十一植物叶片光合速率的测定（改良半叶法）................. 实验十二氧电极法测定植物组织的光合与呼吸速率................. 实验十三小篮子法（广口瓶法）测定植物的呼吸速率. (37)实验十四谷物淀粉含量的测定（旋光法）......................... 实验十五类似生长素对种子萌发的影响........................... 实验十六赤霉素对α-淀粉酶的诱导形成........ 错误！未指定书签。

实验十七植物种子生活力快速测定............................... 实验十八植物光周期现象的观察................................. 实验十九植物抗逆性的测定（电导仪法）....... 错误！未指定书签。

植物原生质体的分离与融合

综合性（设计性）实验实验报告实验名称：原生质体的分离培养与融合姓名：马淑媛指导教师：卜婷专业：生物科学实验班级： 10级生物科学2班实验时间： 2012年11月16日实验地点：细胞学实验室成绩：__________________________植物原生质体的分离与融合及培养一实验目的1、掌握原生质体分离的方法；2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。

3、掌握原生质培养技术二试验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。

其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。

由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。

其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。

测定原生质体的活性有多种方法。

荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。

一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。

它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。

许多化学、物理学和生物学方法可诱导原生质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇（PEG）法、高钙高pH法和电融合法；聚乙二醇（PEG）作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高钙高pH法进行清洗，使原生质体融合得以完成。

聚乙二醇（PEG）诱导如何的机理：聚乙二醇（PEG）由于含有醚键而具有负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当聚乙二醇（PEG）分子足够长时，可作为临近原生质表面之间的分子桥而使之粘连、聚乙二醇（PEG）也能连接钙等阳离子，钙可在一些负极化基团和聚乙二醇（PEG）之间形成桥，因而促进粘连。

原生质体分离与融合

原生质体的分离、融合与培养一、实验目的1.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理。

2.掌握植物原生质体分离、融合和培养的基本过程。

3.了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。

二、实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。

其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。

许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和电融合法。

PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。

PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。

在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。

三、实验材料、试剂与仪器1．材料新鲜的菠菜叶片2．试剂（1）酶液：依次加入 1.25%纤维素酶、0.3%果胶酶、0.04%甘露醇、20mmol/LKCl和20mmol/L2-吗啉乙磺酸（MES），55℃水浴10min，冷却至室温，再加10mmol/LCaCL2、5mmol/Lβ-巯基乙醇和0.1%BSA，0.45um微孔滤膜过滤，溶液呈透明橙色。

（2）PEG溶液：4GpPEG4000\3mL去离子水、2.5mL0.8mol/L甘露醇和1mL1mol/L CaCL2。

（3）MMg溶液：0.4mol/L甘露醇、15mmol/LMgCl2、mmol/LCaCl2和4mmol/LMES。

常见植物原生质体制备和融合实验探究

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生物学通报
2020年第 5 5 卷第丨丨期
常见植物原生质体制备和融合实验探究
李真沈環
[ 对外经济贸易大学附属中学（北京市第九十四中学）北京 100102]
摘要选择多种常见的蔬菜和当季黄花棣裳作为实验材料，使用不同的 PEG浓度和酶解时间，诱导原生质体融合，比较实验结果得出以下结论：1 ) 酶解处理小白菜，圆球形完整原生质体的数量，随处理时间的延长呈现先升高后降低的趋势，4 h 时效果最佳；2 ) 钙菜、快菜、生菜、小白菜、油菜、油麦菜、棣裳、紫甘蓝酶解 4 h 时，原生质体数量和完整性都较好，选择小白菜、棣裳花和紫甘蓝更便于制备和观察融合结果；3 ) 使用 3 0 % PEG 诱导 15 m in 融合效果最好。
3)
在玻璃平皿上滴加丨 m L 左右 0.4 mol/L3 . 2 不同材料的影响为了获得更多的原生质
甘露醇溶液，取洗净晾干的新鲜材料，用解剖刀切
体同时便于观察融合程度，本研究中共选择具有 3
2020年第 5 5 卷第 1 1期
生物学通报
55
1 实验材料、酶解时间和 P E G 浓度的设定
3 . 1 不同酶解时间的影响本研究用纤维素酶、

8原生质体的分离、培养和融合

酶解液的组成
• 酶的混合液：
纤维素酶（1-2% 浓度）、果胶酶（0.2- 0.5%浓度）等。
• 渗透稳定剂：
促进酶解，保持原生质体的完整性。甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，适宜的浓度为450800 m mol/L。 • 盐类
氯化钙 50 -100m mol/l，磷酸二氢钾(0.7m mol/l)等。
KH2PO4
KNO3 CaCl2.2H2O
27.2
101.0 1480.0
KI
CuSO4.5H2O （PH5.7）。
0.16
0.025
MgSO4.7H2O
246.0
(Cocking和Peberdy,1974)。
2、漂浮法：
利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液做离心液，将经过镍网初筛的过滤液置于蔗糖溶液的顶部，在100g下离心10分钟，离心后，碎屑沉淀，纯净的原生质体将出现在蔗糖溶液和原生质体冲洗液的界面上。利用移液管将原生质体吸出，转移到另一个离心管中，用冲洗液冲洗3次。离心液的蔗糖浓度为20-21%。 3、梯度离心法
有些悬浮培养的细胞，细胞壁难以用目前的酶制剂降解，可以在培养基中加入生长素、含硫氨基酸、还原剂或重金属离子培养细胞，有时可以改变细胞壁的组成。生长素对细胞壁的可塑性和延长是一个重要的影响因子，含硫氨基酸和还原剂可以影响细胞壁的双硫键，对细胞壁的降解有利。经常进行继代培养的细胞、或培养基中蔗糖浓度较低的悬浮培养细胞，分离原生质体时的得率高，细胞碎片少。
可以容易地获得可育的后代
4、体细胞融合中的不对称杂种只带有一个亲本的染色体和另一个亲本的部分染色体或基因的融合后代。是体细胞融合的主要产物之一
二、融合的方法和技术原生质体可以自发地发生融合，但融合频率极低，在体细胞杂交中没有意义。在体细胞杂交中，通常都是采用物理的和化学的方法人工诱导产生融合

实验六原生质体的分离与融合（2012）

实验六植物原生质体的分离与融合第一部分：综合性实验紫叶甘蓝与园葱原生质体的分离与融合一、实验原理及意义植物原生质体由于已去除了细胞壁，它能够像动物细胞一样，在人为的条件下互相融合，获得细胞杂种植株。

如果用近缘种内或种间的原生质体融合，可以获得稳定的、具有双亲两套染色体的细胞杂种植株，它们往往可育，可以直接作为育种的种质材料；如果用远缘不亲和物种间的原生质体融合，可以获得常规有性杂交得不到的无性杂种植株，不仅克服了远缘杂交不亲和性，而且可以扩大植物的变异范围，拓宽种质来源，选育出新种质，甚至产生新种。

要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。

目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。

1.酶：分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。

2.渗透稳定剂：植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。

去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。

因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同。

3.植物材料：一般来说，植物各个器官，如：根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。

但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。

材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。

4.酶溶液的pH值：对原生质体的产量和生活力影响很大。

一般为5~7。

酶的活性与pH值有关。

Onoznka纤维素酶R－10最适宜pH值为5~6。

不过实际上酶溶液的pH值经常调节4.7~6.0之间。

对于不同的材料、不同型号的酶其所要求的最适值是不同的，应通过实验确定。

5.温度：对酶解效率和植物原生质体的活力都有影响。

酶：40~50摄氏度，适于植物材料的温度一般都在25℃，所以一般在25℃左右进行酶解。

二、试剂的配制1、pH5.7的磷酸钾缓冲液10 mL：A液：称取0.272g KH2PO4（0.2mol/L，溶于蒸馏水中，定容至10 mL。

S11实验十一植物原生质体的分离及融合（理论）

S11实验十一植物原生质体的分离及融合（理论）实验十一植物原生质体的分离及融合（理论）原生质体培养的主要目的是实现远缘物种的体细胞杂交，外源染色体、DNA或细胞器的导入，创造新的远缘杂种。

全部技术环节包括原生质体分离、原生质体培养、体细胞杂交、杂种细胞产生愈伤组织及再生植株等。

一、原生质体的概念1、原生质体是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。

没有细胞壁，但具有活细胞的一切特征。

2、原生质体培养指将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。

二、原生质体的分离方法1、机械分离法采用渗透方法使细胞发生质壁分离，然后切开细胞壁释放出原生质体。

特点是原生质体产量很低；方法繁琐费力；局限性大。

2、酶法分离采用果胶酶、纤维素酶等酶类对植物细胞壁进行酶解，得到原生质体。

三、原生质体纯化与活力测定1、原生质体的纯化a、离心沉淀法应用原生质体的比重大于溶液的性质，将原生质体沉于底部，收集原生质体备用。

b、漂浮法应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面。

依次通过网筛过滤、离心、收集沉淀，再用蔗糖液洗涤离心2—3次，漂浮收集即可。

c、界面法选用两种不同渗透浓度的溶液，一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种小于原生质体的密度，进行界面收集原生质体。

2、活力测定a、形态识别形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的即为存活的原生质体。

b、染色识别用0.1%酚番红或伊凡蓝进行染色，后进行观察，有活力而质膜完整的原生质体对染料有排斥作用而不被染色，死亡的却被染上颜色。

四、原生质体的培养方法培养方法有四种，即固体薄层培养法、液体浅层培养法、双层培养法和琼脂糖珠培养法。

1、固体薄层培养法又叫平板培养法，指将一定体积的原生质体按照一定细胞密度与等体积的处于45℃的琼脂培养基混合，在培养皿内制成薄层固体平板的方法。

使原生质体位置固定，避免其游动，便于定点观察。

植物原生质体培养及细胞融合总结

◆低温处理
龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理后，分离得到的原生质体才能分裂。
（在很多情况下材料不必经过专门的预处理）
（二）原生质体分离方法
1. 机械法
Klercker 于1892年最早进行分离高等植物原生质体的研究。
其方法是把细胞置于一种高渗的糖溶液中，使细胞发生质壁分离，原生质体收缩成球形，然后用利刃切割，
1968年，纤维素酶和离析酶商品化生产后，大量进行植物原生质体的研究。
现在
果胶酶处理 → 单细胞－－纤维素酶处理 → 原生质体
分离原生质体最有效方法。
细胞壁的组成
纤维素半纤维素果胶质
25-50％ 53％
5％
纤维素酶半纤维素酶果胶酶
少量蛋白质
酶的种类及特点
◆ 纤维素酶
主要含有纤维素酶 C ，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用，还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，
Piwowarczyk （1978 ）改进了上述方法两液相下层：培养基，含 500mM/L 蔗糖中层：培养基，含 140mM/L 蔗糖，360mM/L 山梨醇上层：含原生质体酶液，含 300mM/L 山梨醇和100mM/L CaCl 2
现在用不同连续梯度 Ficoll （聚蔗糖）溶液，上面为酶 -原生质体混合液，经离心（ 150g ，5min ）, 不同比重的原生质体漂浮在不同浓度梯度的界面上。
缺点
原生质体易受热伤害，易破碎。
五、低密度培养
与细胞培养相似，原生质体初始植板密度对植板效率有显著的影响。
原生质体培养的一般密度为 104-105。