蛋白质分离纯化
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蛋白质分离纯化
蛋白质分离纯化
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蛋白质分离纯化
蛋白质的分离纯化
（一）材料 1、选材 2、破碎 3、混合物的分离
（二）粗分级 （三）细分级 （四）结晶
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蛋白质分离纯化
样品的前处理
1、生物样品的选择和处理 样品的选择：有效成分含量高、来源丰富、保持 新鲜、实验条件恒定、取材工艺简单、有综合利 用价值等。 处理：包括去除脂肪、结缔组织等。
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蛋白质分离纯化
2、根据分子大小不同
（1）透析和超滤
1）透析（Dialysis）：
就是利用蛋白质分子不能通过半透膜（Semipermeable membrane）而小分子可以自由透过的性质，使蛋白质与 小分子物质分开。 作用：脱盐、无机离子和小分子物质等。 透析膜：动物膜、羊皮纸、火棉胶、赛璐玢或其他材料等。
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在浓缩胶中的三个主要作用角色：
蛋白质分离纯化
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浓缩效应：
蛋白质分离纯化
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蛋白质分离纯化
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷 以及分子大小和形状等因素。
加入SDS（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇，
则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而
与原来所带电荷、分子形状无关。
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蛋白质分离纯化
透析——只用于除盐类和小分子杂质
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蛋白质分离纯化
透析——只用于除盐类和小分子杂质
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蛋白质分离纯化
2）超滤（ultrafiltration）： 是利用压力和离心力，借助于超滤膜将不同分子量 的物质分离的技术。 Ultrafiltration的功能：纯化和浓缩（同PEG，聚乙 二醇）。 Ultrafiltration膜：丙烯氰、醋酸纤维素、硝酸纤维 素和尼龙等。
基本原理： 离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换 剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固 定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子 聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基 团形成的。
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蛋白质分离纯化
离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基 团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成 一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电 荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生 可逆的交换反应。
蛋白质分离纯化
离子交换层析
吸附本质：非共价连接 常用吸附剂：结晶磷酸钙、硅胶 脱附方式：1、改变蛋白质带电状态；
2、改变环境溶液的pH、离子强度等。
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蛋白质分离纯化
4、根据配体特异性不同
亲和层析(Affinity Chromatography) 是利用生物分子间专一的亲和力而进行分 离的一种层析技术。
亲和层析是分离纯化蛋白质、酶等生物大 分子最为特异而有效的层析技术，分离过 程简单、快速，具有很高的分辨率，在生 物分离中有广泛的应用。
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蛋白质分离纯化
亲和层析的基本原理： 生物分子间存在很多特异性的相互作用， 如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑 制剂、激素－受体等等，它们之间都能够 专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲 和力。亲和层析的分离原理简单的说就是 通过将具有亲和力的两个分子中一个固定 在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特 异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯 化。
实际测定时，以几种标准单体蛋白质分子量的对 数值对其μR作图，根据样品的μR值，从标准曲线 上就可查出其分子量。
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蛋白质分离纯化
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
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蛋白质分离纯化
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蛋白质分离纯化
等电聚焦（ Isoelectric focusing）
(1)以不同蛋白质的等电点的差异分离。 (2)凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。 (3)载体两性电解质：
筛效应。
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蛋白质分离纯化 连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒 在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不 连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应， 还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳
注意事项：1、时间相对长对分离有利； 2、也可用来测定蛋白质的等电点。
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等电聚焦（ Isoelectric focusing）
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蛋白质分离纯化
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蛋白质分离纯化
等电聚焦（ Isoelectric focusing）
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蛋白质分离纯化
（2）离子交换层析
以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交 换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别 而进行分离的一种层析方法。
2、细胞破碎：机械破碎法、物理学方法、化学法、 酶学法
3、抽提（extraction）：是指在一定条件下，用 适当的溶剂和方法，使有效成分充分溶解到溶剂 的过程。
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蛋白质分离纯化
蛋白质的分离方法
根据蛋白质的溶解度差异分离 —沉淀技术 根据蛋白质分子大小的差异分离 根据蛋白质的荷电差异分离 根据蛋白质与某些物质的吸附差异—吸附分离 利用生物分子专一性结合的特性—亲和层析
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蛋白质分离纯化
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蛋白质分离纯化
（3）密度梯度离心 原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，
在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速 度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带 的方法。
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蛋白质分离纯化
密度梯度离心
滴加样 品
塑料离心 管
大分
Байду номын сангаас
SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和
疏水作用。巯基乙醇打开二硫键，因此使蛋白质分
子处于伸展状态。此时SDS以其烃链与蛋白质分子的
侧链结合成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一 个SDS分子。
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蛋白质分离纯化
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
导致： 1、由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负
电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原 来的电荷差异。
2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白 质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分 子量的大小成正比变化。
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蛋白质分离纯化
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
由于不同蛋白质的SDS复合物具有相同的荷质 比，并具有相似的构象，因而有如下公式：
lgM=K1—K2μR
（K1、K2为常数，μR为相对迁移率）
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蛋白质分离纯化
等电聚焦（ Isoelectric focusing）
通电后，在介质中由于H+与OH-的相向移动，形成 了从3.0-10.0的一系列pH梯度。当载体两性电解质 移动到各自的等电点时，就停止移动，不带电荷， 并维持pH梯度（电导、缓冲能力）。 即：pH梯度由H+与OH-建立，而由载体两性电解 质来维持。当蛋白质移动到相应的pH值处，结束。
葡聚糖凝胶（Sephadex）
型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐
琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）
孔径大，用于分离大分子物质
聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
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蛋白质分离纯化
原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质 迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电
泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。 2、自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。
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垂直板电泳
蛋白质分离纯化
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垂直板电泳
蛋白质分离纯化
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垂直板电泳
蛋白质分离纯化
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聚丙烯酰胺凝胶电泳
蛋白质分离纯化
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双 丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺 （TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚 合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子
平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生 交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交 换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换 剂。
当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。
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离子交换层析
蛋白质分离纯化
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蛋白质分离纯化
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蛋白质分离纯化
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将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱 的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从 而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相 中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分 子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯 化的待分离物质。
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蛋白质分离纯化
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蛋白质分离纯化
根据蛋白质的溶解度差异分离 —沉淀技术
可逆沉淀： 等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀
不可逆沉淀： 热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀
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蛋白质分离纯化
1、根据溶解度不同
（1）盐析（salting out） 1）定义：在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高这种现象 称为盐溶（salting in），但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐 下降，直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析（salting out）。 2）原理 Salting in：蛋白质吸附某种离子→蛋白质彼此排斥，而蛋白质与水相互 作用加强→溶解度提高。 Salting out：大量中性盐加入→破坏蛋白质分子表面的水活膜，降低水的 活度，蛋白质表面的电荷被中和→蛋白质相互聚集而析出。 3）盐析中最常用的盐是： (NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4，尤其以(NH4)2SO4为最佳。 原因：(NH4)2SO4溶解度大而温度系数小，分离效果好，能保持蛋白质的天 然构象，且价廉可得，这是蛋白质粗提纯的一种最常用方法。
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（2）等电点沉淀法 1）pH 偏离pI时，蛋白质带相同符号的净电荷而互相排斥→蛋 白质溶解度大。 2）pH = pI时，蛋白质的净电荷为0→蛋白质聚集沉淀 3）等电点沉淀法的缺点：沉淀不完全。
（3）有机溶剂沉淀法 1）原理：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质 分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂 与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜。 2）注意：高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须 在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部 浓度过大。
4%
子
量
8%
由
—————
12 蔗糖浓度 小 %%
16
%
20
%
蔗糖密度梯度 （介质还可用：氯化铯、甘油等）
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蛋白质分离纯化
3、根据带电性质不同
电泳法 离子交换层析
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蛋白质分离纯化
（1）电泳法
类型：1、区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、
细丝电泳、凝胶电泳。 凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅
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蛋白质分离纯化
超过滤——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质
加 压
蛋白质溶液 半透膜 支持膜的栅板
超滤液
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蛋白质分离纯化
（2）凝胶层析
又叫分子筛层析。 分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，
也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。 具备条件：1、惰性，2、水不溶性，3、能高度水化。 常用分子筛：
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不 能相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。
b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
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蛋白质分离纯化
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蛋白质分离纯化
被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的， 构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。
亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力的物质 作为配体，例如分离酶可以选择其底物类似物或竞争性抑制 剂为配体，分离抗体可以选择抗原作为配体等等。并将配体 共价结合在适当的不溶性基质上，如常用的Sepharose－4B 等。
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蛋白质的分离纯化
（一）材料 1、选材 2、破碎 3、混合物的分离
（二）粗分级 （三）细分级 （四）结晶
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蛋白质分离纯化
样品的前处理
1、生物样品的选择和处理 样品的选择：有效成分含量高、来源丰富、保持 新鲜、实验条件恒定、取材工艺简单、有综合利 用价值等。 处理：包括去除脂肪、结缔组织等。
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蛋白质分离纯化
2、根据分子大小不同
（1）透析和超滤
1）透析（Dialysis）：
就是利用蛋白质分子不能通过半透膜（Semipermeable membrane）而小分子可以自由透过的性质，使蛋白质与 小分子物质分开。 作用：脱盐、无机离子和小分子物质等。 透析膜：动物膜、羊皮纸、火棉胶、赛璐玢或其他材料等。
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在浓缩胶中的三个主要作用角色：
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浓缩效应：
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SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷 以及分子大小和形状等因素。
加入SDS（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇，
则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而
与原来所带电荷、分子形状无关。
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透析——只用于除盐类和小分子杂质
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透析——只用于除盐类和小分子杂质
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2）超滤（ultrafiltration）： 是利用压力和离心力，借助于超滤膜将不同分子量 的物质分离的技术。 Ultrafiltration的功能：纯化和浓缩（同PEG，聚乙 二醇）。 Ultrafiltration膜：丙烯氰、醋酸纤维素、硝酸纤维 素和尼龙等。
基本原理： 离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换 剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固 定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子 聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基 团形成的。
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蛋白质分离纯化
离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基 团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成 一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电 荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生 可逆的交换反应。
蛋白质分离纯化
离子交换层析
吸附本质：非共价连接 常用吸附剂：结晶磷酸钙、硅胶 脱附方式：1、改变蛋白质带电状态；
2、改变环境溶液的pH、离子强度等。
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4、根据配体特异性不同
亲和层析(Affinity Chromatography) 是利用生物分子间专一的亲和力而进行分 离的一种层析技术。
亲和层析是分离纯化蛋白质、酶等生物大 分子最为特异而有效的层析技术，分离过 程简单、快速，具有很高的分辨率，在生 物分离中有广泛的应用。
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亲和层析的基本原理： 生物分子间存在很多特异性的相互作用， 如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑 制剂、激素－受体等等，它们之间都能够 专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲 和力。亲和层析的分离原理简单的说就是 通过将具有亲和力的两个分子中一个固定 在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特 异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯 化。
实际测定时，以几种标准单体蛋白质分子量的对 数值对其μR作图，根据样品的μR值，从标准曲线 上就可查出其分子量。
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SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
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等电聚焦（ Isoelectric focusing）
(1)以不同蛋白质的等电点的差异分离。 (2)凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。 (3)载体两性电解质：
筛效应。
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蛋白质分离纯化 连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒 在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不 连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应， 还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳
注意事项：1、时间相对长对分离有利； 2、也可用来测定蛋白质的等电点。
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等电聚焦（ Isoelectric focusing）
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蛋白质分离纯化
等电聚焦（ Isoelectric focusing）
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蛋白质分离纯化
（2）离子交换层析
以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交 换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别 而进行分离的一种层析方法。
2、细胞破碎：机械破碎法、物理学方法、化学法、 酶学法
3、抽提（extraction）：是指在一定条件下，用 适当的溶剂和方法，使有效成分充分溶解到溶剂 的过程。
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蛋白质的分离方法
根据蛋白质的溶解度差异分离 —沉淀技术 根据蛋白质分子大小的差异分离 根据蛋白质的荷电差异分离 根据蛋白质与某些物质的吸附差异—吸附分离 利用生物分子专一性结合的特性—亲和层析
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（3）密度梯度离心 原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，
在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速 度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带 的方法。
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密度梯度离心
滴加样 品
塑料离心 管
大分
Байду номын сангаас
SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和
疏水作用。巯基乙醇打开二硫键，因此使蛋白质分
子处于伸展状态。此时SDS以其烃链与蛋白质分子的
侧链结合成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一 个SDS分子。
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SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
导致： 1、由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负
电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原 来的电荷差异。
2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白 质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分 子量的大小成正比变化。
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SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
由于不同蛋白质的SDS复合物具有相同的荷质 比，并具有相似的构象，因而有如下公式：
lgM=K1—K2μR
（K1、K2为常数，μR为相对迁移率）
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蛋白质分离纯化
等电聚焦（ Isoelectric focusing）
通电后，在介质中由于H+与OH-的相向移动，形成 了从3.0-10.0的一系列pH梯度。当载体两性电解质 移动到各自的等电点时，就停止移动，不带电荷， 并维持pH梯度（电导、缓冲能力）。 即：pH梯度由H+与OH-建立，而由载体两性电解 质来维持。当蛋白质移动到相应的pH值处，结束。
葡聚糖凝胶（Sephadex）
型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐
琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）
孔径大，用于分离大分子物质
聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
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蛋白质分离纯化
原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质 迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电
泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。 2、自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。
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垂直板电泳
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垂直板电泳
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聚丙烯酰胺凝胶电泳
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聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双 丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺 （TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚 合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子
平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生 交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交 换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换 剂。
当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。
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离子交换层析
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将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱 的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从 而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相 中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分 子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯 化的待分离物质。
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根据蛋白质的溶解度差异分离 —沉淀技术
可逆沉淀： 等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀
不可逆沉淀： 热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀
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1、根据溶解度不同
（1）盐析（salting out） 1）定义：在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高这种现象 称为盐溶（salting in），但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐 下降，直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析（salting out）。 2）原理 Salting in：蛋白质吸附某种离子→蛋白质彼此排斥，而蛋白质与水相互 作用加强→溶解度提高。 Salting out：大量中性盐加入→破坏蛋白质分子表面的水活膜，降低水的 活度，蛋白质表面的电荷被中和→蛋白质相互聚集而析出。 3）盐析中最常用的盐是： (NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4，尤其以(NH4)2SO4为最佳。 原因：(NH4)2SO4溶解度大而温度系数小，分离效果好，能保持蛋白质的天 然构象，且价廉可得，这是蛋白质粗提纯的一种最常用方法。
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（2）等电点沉淀法 1）pH 偏离pI时，蛋白质带相同符号的净电荷而互相排斥→蛋 白质溶解度大。 2）pH = pI时，蛋白质的净电荷为0→蛋白质聚集沉淀 3）等电点沉淀法的缺点：沉淀不完全。
（3）有机溶剂沉淀法 1）原理：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质 分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂 与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜。 2）注意：高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须 在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部 浓度过大。
4%
子
量
8%
由
—————
12 蔗糖浓度 小 %%
16
%
20
%
蔗糖密度梯度 （介质还可用：氯化铯、甘油等）
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3、根据带电性质不同
电泳法 离子交换层析
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（1）电泳法
类型：1、区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、
细丝电泳、凝胶电泳。 凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅
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超过滤——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质
加 压
蛋白质溶液 半透膜 支持膜的栅板
超滤液
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（2）凝胶层析
又叫分子筛层析。 分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，
也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。 具备条件：1、惰性，2、水不溶性，3、能高度水化。 常用分子筛：
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不 能相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。
b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
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蛋白质分离纯化
被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的， 构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。
亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力的物质 作为配体，例如分离酶可以选择其底物类似物或竞争性抑制 剂为配体，分离抗体可以选择抗原作为配体等等。并将配体 共价结合在适当的不溶性基质上，如常用的Sepharose－4B 等。