10食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程
大肠菌群测试片操作流程
大肠菌群测试片检测操作流程1.样品的前处理:(建议使用蔬菜瓜果、河水及大肠菌群标准菌作为样品)（1）蔬菜瓜果：称取25g样品切成1cm左右的碎片，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min制成1:10的样品匀液。
（2）河水：以无菌吸管吸取25mL河水置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
（3）大肠杆菌标准菌：挑取平板上大肠杆菌标准菌的单菌落，于盛有5mL LB 液体培养基的试管中，37℃培养过夜，以此作为菌原液。
用1mL无菌吸管或微量移液器吸1mL菌原液于盛有9mL的稀释液的无菌试管中，制成1:10的样品匀液。
2.样本稀释倍数：用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL的稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸管尖端不要触及稀释液面），振荡试管或换用一只无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
按此操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释液需用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCl）调节pH至7.0~7.2。
（1）蔬菜样品的稀释倍数：取100、10-1两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况而定)。
（2）河水样品的稀释倍数：取10-1、10-2两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况而定)。
（3）大肠菌群标准菌的稀释倍数：取10-7、10-8两个进行接种验证(可根据实际情况而定)。
（4）自来水的稀释倍数：直接取自来水接种进行验证。
3.接种一般食品选1～2个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如饮用纯水和矿泉水等）可直接吸取原液进行检测。
将大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1mL样品匀液垂直加入到测试片中央，用手轻轻将上层盖下，使检测样品液覆盖整个检测圈（应尽量避免产生气泡），静置1 min使培养基凝固，最后用手轻轻将上层盖下。
食品微生物学检验 大肠菌群计数作业指导书
食品微生物学检验大肠菌群计数1、范围：适用于食品中大肠菌群的计数2、定义：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。
3、设备和材料：除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 恒温培养箱：36℃±1℃。
3.2 冰箱：2℃~5℃。
3.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。
3.4 天平：感量0.1g。
3.5 均质器。
3.6 振荡器3.7 无菌吸管：1ml、10ml或微量移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。
3.9无菌培养皿：直径 90 mm。
3.10 pH计或pH比色管或pH试纸。
3.11菌落计数器。
4、培养基和试剂：4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤；4.2 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤；4.3结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）；4.4磷酸盐缓冲液；4.5无菌生理盐水；4.6无菌1moL/L NaoH；4.7 无菌1moL/L HCL。
第一法：大肠菌群 MPN计数法5、操作步骤：5.1样品的稀释固体和半固体样品：称取 25 g 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1～2 min，制成 1:10 的样品匀液。
液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。
样品均液的pH值应在6.5~7.5之间，必要时分别用1moL/L NaoH或1moL/L HCL调节。
用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。
根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品均液。
10食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程
规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。
2范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
3术语和定义3.1 大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
3.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。
4责任质量部组织制订、化验室负责实施。
5内容5.1 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
5.1.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
5.1.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。
5.1.4 天平：感量0.1 g。
5.1.5 均质器。
5.1.6 振荡器。
5.1.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
5.1.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。
5.1.9 无菌培养皿：直径90 mm。
5.1.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
5.1.11 菌落计数器。
5.2培养基和试剂5.2.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。
5.2.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。
5.2.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。
5.2.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。
5.2.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。
5.2.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。
5.2.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7。
5.3大肠菌群MPN 计数法5.3.1 检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
大肠菌群测定操作规程
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大肠菌群测定操作规程
适用范围：大肠菌群系指一群在 36℃条件下培养 48h 能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革 兰氏阴性无芽孢杆菌。通常用此法作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量。
二． 1.
操作内容： 检验程序： 检样→ 稀释 → LST 发酵管（36±1℃，24±2h）
↓→不产气 → 大肠菌群阴性 → 报告 产气 →BGLG（36±1℃，48±2h） → 不产气 → 大肠菌群阴性 → 报告 产气 → 大肠菌群阳性 → 报告 2. 操作方法：
2.1 以无菌操作，将检样 10ml 被测液放于含有 90ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶 内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成 1：10 的均匀稀释液。 2.2 用 1ml 灭菌吸管吸取 1：10 稀释液 1ml，沿管壁徐徐注入含有 9ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的 试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液） ，振摇试管，混合均匀，做成 1：100 的稀释液。 （均 液的 PH 值应在 6.5～７.5 之间，必要时分别用 1mol/L 氢氧化钠（NaoH）或(1mol/L)盐酸（HCL） 调节。 2.3 另取 1ml 灭菌吸管，按上条操作顺序，做 10 倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用 1 支 1ml 灭菌吸管。 2.4 根据食品卫生标准要求或对检污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种 3 管。 2.5 初发酵试验：将待检样品接种于月桂基硫盐胰蛋白胨发酵管内，接种量在 1ml，每一稀释度接种 3 管， 36±1℃文箱内培养 24±2h， 置 观察倒管内是否有气泡产生， 如未产气则继续培养至 48h±2h. 记录在 24h 和 48h 内产气的 LST 肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。 2.6 复发酵试验 用按种环从所有 48h±2h 内发酵产气的 LST 肉汤管中分别取培养物 1 环， 移种于 BGLB 肉汤管中， 36±1℃培养 48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 2.8 报告： 根据证实为大肠菌群阳性的管数， MPN 检索表 查 （见 GB/T4789.3 附表 B） 报告每 100ml ， （g） 大肠菌群的 MPN 值。
食品中大肠菌群的测定实验报告
食品中大肠菌群的测定实验报告一、实验目的。
本实验旨在测定食品中的大肠菌群数量，以评估食品的卫生安全水平。
二、实验原理。
食品中的大肠菌群是指能在37℃条件下在Lauryl Tryptose Broth培养基中生长产气的革兰氏阴性杆菌的总数。
大肠杆菌是大肠菌群的代表性菌种，因此其数量可以作为食品卫生安全的指标之一。
三、实验步骤。
1. 取样，从不同来源的食品中取样，如肉类、蔬菜、水果、奶制品等。
2. 样品处理，将取样的食品样品进行处理，如洗涤、研磨等，以获得可检测的样品。
3. 菌落计数，将处理后的样品接种在Lauryl Tryptose Broth培养基中，培养一定时间后，进行菌落计数。
4. 数据分析，根据菌落计数结果，计算出食品中的大肠菌群数量。
四、实验结果。
经过实验测定，不同食品样品中的大肠菌群数量有所不同。
其中，肉类制品中的大肠菌群数量较高，蔬菜水果中次之，奶制品中较低。
这表明食品的卫生安全水平存在一定差异。
五、实验结论。
食品中的大肠菌群数量是评估食品卫生安全水平的重要指标之一。
通过本实验的测定，可以初步评估食品的卫生安全状况，为食品生产和消费提供参考依据。
未来可以结合其他指标和方法，进一步完善食品卫生安全评估体系。
六、实验注意事项。
1. 在取样和处理过程中，要注意避免外源污染，以保证实验结果的准确性。
2. 在菌落计数过程中，要严格按照操作规程进行，避免误差的产生。
3. 实验结束后，要及时清洗和消毒实验器材，以确保实验室的卫生安全。
七、参考文献。
1. 《食品微生物学实验指导》，XXX，XXX出版社，200X年。
2. 《食品卫生与安全》，XXX，XXX出版社，200X年。
以上为食品中大肠菌群的测定实验报告内容，谢谢阅读。
大肠菌群检测中平板计数法主要操作要领
大肠菌裙检测是一项非常重要的微生物检测工作，它可以帮助我们了解环境和食品中是否存在大肠菌裙，从而保证人们的健康安全。
在大肠菌裙检测中，平板计数法是一种常用的检测方法。
下面将介绍大肠菌裙检测中平板计数法的主要操作要领。
1.准备工作在进行大肠菌裙检测之前，需要准备相应的实验器材和培养基。
实验器材包括平板计数仪、移液器、无菌培养皿等。
培养基一般选择大肠埃希氏菌（EC）培养基。
2.样品处理将待测样品取适量放入无菌容器中，进行适当的稀释。
这一步要确保样品的稀释倍数适中，以保证后续的计数结果准确。
3.接种和培养取一定量的处理过的样品，在无菌工作台上均匀涂抹于含有适量培养基的培养皿上，然后进行培养。
培养条件一般为37摄氏度，培养时间为24小时。
培养后会形成菌落，这些菌落代表了原始样品中的细菌数量。
4.计数和记录在培养后，利用平板计数仪对菌落进行计数。
计数的时候需要注意避免重复计数同一菌落，保证计数准确。
需要记录计数结果，包括菌落数量和相应的单位。
5.结果分析根据计数结果，可以对原始样品中的大肠菌裙数量进行估算。
可以通过对对照组和样品组的比较来判断样品中大肠菌裙的数量是否合格。
大肠菌裙检测中平板计数法的主要操作要领就是以上几点。
通过严格按照这些要领进行操作，可以确保检测结果的准确性和可靠性。
在进行操作过程中，还需要遵守无菌操作规范，确保实验过程中不受外界污染。
希望大家在进行大肠菌裙检测时能够严格按照操作要领进行，保证测试结果的准确性，从而更好地保障人们的健康安全。
大肠菌裙检测中的平板计数法是一种经典的微生物计数方法，它主要用于测定食品、饮用水、环境等样品中大肠菌裙的数量。
在这个过程中，我们需要注意几个关键的环节，来保证实验的准确性和结果的可靠性。
在准备工作环节，我们需要保证实验器材和培养基的质量。
实验器材一定要经过严格的消毒和清洁，以免外来细菌的污染影响实验结果。
培养基的选用也尤为重要，要选择与待测细菌的生长要求相适应的培养基，以保证细菌在培养基上的正常生长。
食品中大肠菌群计数——第二法检测程序步骤.
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谢谢
1：100样品匀液
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过渡页 平板培养
四
1. 选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释 度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL 生理盐水加入无菌平皿作空白对照。 2. 及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中 性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。 小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀， 待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平 板表层。翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
1:100
用 1mL 无菌吸管 或微量移液器吸 取1∶10样品匀液 1mL,沿管壁缓缓 注入9mL磷酸盐缓 冲 液或生理盐水 的无菌试管中(注 意吸管或吸头尖 端不要触及稀释 液面),振摇试管 或换用1支1mL 无 菌吸管反复吹打, 使其混合均匀,制 成1∶100的样品 匀液。
其他稀释度
根据对样品 污染状况的 估计,按上述 操作,依次制 成十倍递增 系列稀释样 品匀液。每 递增稀释 1 次,换用1支 1mL无菌吸管 或吸头。
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培养基和试剂 名称
磷酸盐缓 冲液
物料名称
磷酸二氢钾 蒸馏水
用量
34.0g 500mL
配制说明
贮存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中, 用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶 液调节pH 至 7.2±0.2,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。 稀释液:取贮存液1.25mL,用蒸馏 水稀释至1000mL,分 装于适宜容器中, 121 ℃高压灭菌15min。 称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121 ℃高压灭菌 15min。 称取40g氢氧化钠溶于1000mL无菌蒸馏水中。 移取浓盐酸90mL,用无菌蒸馏水稀释至1000mL。
食品中微生物检测操作规程
微生物检测操作规范1范围本标准规定了食品中菌落总数的测定方法本标准适用于食品生产线微生物控制及验证计划。
本标准适用于食品产品菌落总数、大肠菌群检测。
2 规范性引用标准GB 4789.1-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验总则》。
GB/T 4789.3-2003《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》。
GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》。
4 设备和材料恒温培养箱：36℃±1℃。
恒温水浴箱：46℃±1℃。
天平：感量为0.1g。
无菌吸管：1ml（具有0.01ml刻度）、10ml（具有0.1ml刻度）。
无菌培养皿：直径90mm。
无菌锥形瓶：容量500ml；或225ml塑料稀释瓶（带内垫，可高温灭菌）。
灭菌试管：16mm×160mm；或10ml-20ml无菌管。
显微镜：10×-100×4 培养基和试剂平板计数琼脂培养基：GB 4789.2-2016 附录A.1。
无菌生理盐水：GB 4789.2-2016 附录A.3。
乳糖胆盐发酵管：按GB/T 4789.3-2003中4.9规定。
伊红美蓝琼脂平板：按GB/T 4789.3-2003中4.25规定。
乳糖发酵管：按GB/T 4789.3-2003中2.2规定。
EC肉汤：按GB/T 4789.28-2003中4.11规定。
格兰仕染色液：按GB/T 4789.3-2003中4.9规定。
5菌落总数检验程序实验前准备移液管、三角瓶、试管包扎、灭菌移液管：洗净烘干后在吸管粗头顶端约0.5cm处，塞上一小段棉花，后用4-5cm宽的报纸或牛皮纸将其以下图所示包扎好。
三角瓶包扎图例将包扎后的器具放入灭菌锅，121℃ 15min灭菌。
a.样品处理面饼样品经粉碎机粉碎后，称取25g粉碎样加入装有225ml无菌生理盐水的稀释瓶内，充分振摇，做成1:10的均匀稀释液。
注意：①实验前无菌室提前30min打开紫外灯进行消毒，进入无菌室前洗手消毒，开始试验、样品处理前使用装有75%酒精的喷壶进行手部消毒。
大肠菌群测试片操作流程
大肠菌群测试片检测操作流程1.样品的前处理:(建议使用蔬菜瓜果、河水及大肠菌群标准菌作为样品)（1）蔬菜瓜果：称取25g样品切成1cm左右的碎片，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min制成1:10的样品匀液。
（2）河水：以无菌吸管吸取25mL河水置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
（3）大肠杆菌标准菌：挑取平板上大肠杆菌标准菌的单菌落，于盛有5mL LB 液体培养基的试管中，37℃培养过夜，以此作为菌原液。
用1mL无菌吸管或微量移液器吸1mL菌原液于盛有9mL的稀释液的无菌试管中，制成1:10的样品匀液。
2.样本稀释倍数：用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL的稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸管尖端不要触及稀释液面），振荡试管或换用一只无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
按此操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释液需用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCl）调节pH至7.0~7.2。
（1）蔬菜样品的稀释倍数：取100、10-1两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况而定)。
（2）河水样品的稀释倍数：取10-1、10-2两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况而定)。
（3）大肠菌群标准菌的稀释倍数：取10-7、10-8两个进行接种验证(可根据实际情况而定)。
（4）自来水的稀释倍数：直接取自来水接种进行验证。
3.接种一般食品选1～2个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如饮用纯水和矿泉水等）可直接吸取原液进行检测。
将大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1mL样品匀液垂直加入到测试片中央，用手轻轻将上层盖下，使检测样品液覆盖整个检测圈（应尽量避免产生气泡），静置1 min使培养基凝固，最后用手轻轻将上层盖下。
食品中大肠菌群的检验
食品中大肠菌群的检验简介大肠菌群是指含有大肠菌属（Escherichia coli）和奇异变形杆菌属（Coliform bacteria）的细菌群体。
它们存在于人和动物的肠道中，也可以存在于环境中，如土壤、水体和食品中。
食品中的大肠菌群是导致食品中毒的主要病原体之一。
因此，对食品中大肠菌群的检验非常重要，以确保食品的卫生和安全。
本文将介绍食品中大肠菌群的检验方法和操作流程。
方法和步骤1. 样品采集样品采集是食品中大肠菌群检验的第一步。
根据需要检验的食品种类，选择合适的采样方法。
常见的食品样品包括水果、蔬菜、肉类和乳制品等。
采集样品时，应使用干净无菌的容器，并避免污染。
确保样品的代表性，避免极端状况下的取样，如选择已烂的水果或有明显变质的食品。
2. 样品处理样品处理是为了提取样品中的菌群以进行后续的检测。
处理过程应在无菌条件下进行，以避免外部的污染。
常见的样品处理方法包括：•加入盐水：将样品加入含有氯化钠的缓冲液中，以便菌群的释放。
•搅拌和均质：使用搅拌器或者均质器将样品搅拌均匀，以确保菌群的均匀分布。
•过滤：通过滤膜将样品过滤，以分离固体物质和悬浮物。
3. 培养基选择选择适当的培养基是进行大肠菌群检验的关键。
常用的培养基包括马铃薯葡萄糖琼脂（Plate Count Agar，PCA）、大肠杆菌选择琼脂（MacConkey Agar）、经典蓝琼脂（Eosin Methylene Blue Agar）等。
不同的培养基适用于不同目的的检验。
PCA适用于总菌群计数，MacConkey Agar适用于大肠菌群的选择性检测，Eosin Methylene Blue Agar适用于大肠杆菌的计数和鉴别。
4. 培养和孵育将样品处理后的培养基平板进行孵育。
孵育的时间和温度根据菌群的生长特性而定。
一般情况下，孵育时间为24小时，温度为37摄氏度。
培养过程中，需要注意避免交叉污染。
每个样品应使用独立的培养基平板进行孵育，且标记清楚以区分不同样品。
大肠菌群计数检验步骤
大肠菌群计数检验步骤第一法大肠菌群MPN 计数操作步骤6.1、样品的稀释6.1.1、固体和半固体样品：称取25g 样品，放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 00or/min-10 000r/min 均质1 min-2 min ，或放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。
6.1.2、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品，置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。
6.1.3、样品匀液的pH 值应在6.5-7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。
6.1.4、用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1ml无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
6.1.5、根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1 次，换用1 支1ml无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。
6.2、初发酵试验每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如接种量超过1ml，则用双料LST肉汤）, 36℃±1℃培养24h±Zh ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。
记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。
未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。
6.3、复发酵试验用接种环从所有48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐( BGLB）肉汤管中，36℃±1℃培养48h±2h ，观察产气情况。
食品中大肠菌群计数检测标准(GB 4789.3-2016)及解读.
八
大肠菌群平板计数法的操作步骤
九
结果与报告
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一
大肠菌群的概念
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定义：一群在36℃培养48h可发酵乳糖、产 酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏染色阴 性无芽孢杆菌。
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二
大肠菌群的检测意义
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该菌主要来自于人畜粪便，故以 此作为粪便污染指标来评价食品 的卫生质量，推断食品中有无污 染肠道致病菌。
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大肠菌群MPN计数的检验程序
检样 25g(mL)样品+ 225mL稀释液，均质
10倍系列稀释
选择适宜三个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管
36℃±1℃
48h±2h
不产气
产气
36℃±1℃
BGLB肉汤
48h±2h
不产气
产气
大肠菌群阴性管 大肠菌群阳性管
查MPN表 报告结果
食品营养与检测专业教学资源库
食品营养与检测专业教学资源库过渡页大肠菌群的检测操作流程1大肠菌群mpn计数的检验程序2大肠菌群平板计数法的检验程序食品营养与检测专业教学资源库大肠菌群mpn计数的检验程序25gml样品225ml稀释液均质10倍系列稀释选择适宜三个连续稀释度的样品匀液接种lst肉汤管48h2h361bglb肉汤48h2h361大肠菌群阴性管大肠菌群阳性管查mpn表报告结果食品营养与检测专业教学资源库大肠菌群平板计数法的检验程序选择2个3个适宜连续稀释度的样品匀液接种vrba平板25gml样品225ml稀释液均质10倍系列稀释36118h24h计数典型和可疑菌落bglb肉汤36124h48h报告结果食品营养与检测专业教学资源库过渡页大肠菌群的检测设备及材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外其他设备和材料如下恒温培养箱冰箱恒温水浴箱天平均质器振荡器无菌吸管或微量移液器及吸头无菌锥形瓶ph计或ph比色管或精密ph试纸菌落计数器
食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程
食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程1.目的本标准操作规程的目的是为了能够准确、快速地测定食品中大肠菌群的数量，以便于对食品的卫生状况进行评估。
2.应用范围该操作规程适用于各种食品样品，如肉、鱼、蔬菜、水果等。
3.实验器材和试剂3.1器材：(1)无纤维纸滤纸或滤膜或滤布等过滤介质。
(2)LED 灯或紫外灯。
(3)培养皿、移液器、无毒胶带和显微镜。
(4)电子天平。
(5)水槽和蒸馏水。
3.2试剂：(1)胆盐琼脂培养基。
(2)大肠埃希菌ANTISERUM(可以根据需要添加，如：O157等)。
(3)含有氯化钠、肉汤和酚红的PB(NaCl、pH值7.2±0.2、菜心草浸提液)培养基。
4.操作流程4.1样品的准备样品应当是新鲜的、无病变的，如为肉类样品则需要去除肉骨、制成均匀的细碎物；如为水果蔬菜，则需将其冲洗干净削皮去籽核、制成较小的碎片。
如果是液体样品，需要摇匀，取少量样品进行分析。
(1)将胆盐琼脂培养基先膜切成适当的大小，放置在无菌的培养皿中，静置至凝固(温度约35℃)后，置于4℃左右冷藏备用。
(2)PB培养基的制备：每升PB(NaCl、pH值7.2±0.2、菜心草浸提液)培养基中加入10克肉汤粉和0.01克酚红，用蒸馏水充分搅拌均匀，灭菌后置于4℃左右。
4.3分析程序(1)取样品约10g，加入90mLPB(NaCl、pH值7.2±0.2、菜心草浸提液)中，用搅拌器搅拌1分钟，摇匀后放置2分钟(2分钟后即是样品液体)。
(2)取上述处理好的样品液1mL，加入9mL的PBS(NaCl、pH7.2±0.2)中均匀悬浮。
去除上清后再次悬浮，充分均匀。
(3)取上述悬浮液，利用无菌的吸管分别在胆盐琼脂培养基上均匀涂布(充分在滤纸上滤过)，然后进行相应的实验测定：a.在培养皿边缘涂上大肠埃希菌ANTISERUM(注意稀释)。
b.在光照充足的环境下，在37℃下培养16-18小时。
大肠菌群测定操作步骤
大肠菌群测定操作步骤咱今天就来说说这大肠菌群测定的操作步骤哈！这可真是个有意思的事儿呢。
首先呢，你得准备好各种各样的玩意儿，就像战士上战场得带好武器一样。
什么培养基啦、无菌吸管啦、培养皿啦，都得准备得妥妥当当的。
然后呢，就是取样啦！这就好比去果园里摘果子，你得挑那些看着就不错的来。
样品可得有代表性，不能随便瞎搞。
接下来，把取好的样放到合适的容器里，加上一些试剂，就像是给它来个特别的“洗礼”。
这一步可不能马虎，得认真对待。
之后呢，就把处理好的样品接种到培养基上。
这就像是给种子找个合适的土壤，让它能好好地生长发芽。
接种的时候可得小心点，别弄得到处都是。
再然后，把培养皿放到合适的温度下培养。
这就像是给小宝贝们找了个温暖的小窝，让它们能舒舒服服地长大。
在培养的过程中，你可得时刻关注着，就像妈妈关注着孩子的成长一样。
看看有没有什么变化，有没有那些让人惊喜的小现象出现。
过了一段时间后，你就能看到培养基上的情况啦！如果有大肠菌群，那它们就会显现出来，就像是舞台上的主角一样闪亮登场。
哎呀，你说这是不是很神奇呀！就通过这么一系列的操作，就能把那些看不见摸不着的大肠菌群给找出来。
这就好像是一场侦探游戏，我们就是那个聪明的侦探，通过各种线索和方法，找出隐藏在其中的“凶手”。
而且这可不是随便玩玩的，这关系到食品安全呢！要是没做好，那可不得了。
所以啊，每一步都得认真仔细，不能有一点差错。
就像建房子一样，一砖一瓦都得放好，不然房子可就不结实啦！咱做这个大肠菌群测定，不就是为了让大家吃得放心、喝得安心嘛！这是多么重要的事情呀。
大家可别小瞧了这些操作步骤，每一个细节都可能影响到最后的结果呢。
总之呢，大肠菌群测定的操作步骤虽然看起来有点麻烦，但只要我们用心去做，肯定能做好的。
就像那句话说的：“世上无难事，只怕有心人。
”咱可都是有心人，肯定能把这事儿干得漂漂亮亮的！你们说是不是呀！。
大肠菌群计数测定作业指导书
d、根据对样品污染状况的分析，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。注意每递增稀释一次，换用一支1ml无菌吸管。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
6.2.2煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤
6.2.3乳糖胆盐发酵培养基（LBB）
6.2.4乳糖蛋白胨培养基（LPB）
6.2.5伊红美蓝琼脂培养基（EMB）
6.2.6结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）
6.2.775%乙醇溶液
6.2.8无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min
3淡紫红色、中心较深的菌落。
b、证实试验
经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖胆盐发酵管内，置于36±1℃生化培养箱培养24±2h，有产酸产气者，即证实有大肠菌群存在。
6.3.2.2.2方法二
自推测性检验阳性管中取1接种环培养液，接种到煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤管中，置于36±1℃培养箱内培养48h。观察BGLG管中的产气情况，如有气体产生，就可确定为大肠菌群阳性，如无气体产生则为大肠菌群阴性。
6.4.2.1选取1-3个适宜的稀释度（液体样品可以选用原液）接种两个无菌平皿，每皿1ml，同时分别取1ml无菌生理盐水加入到两个无菌平皿作空白对照。
6.4.2.2及时将冷却至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）15-20ml倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后再加3-4ml结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）覆盖平板表层。翻转平板，置于36±1℃培养箱内培养18-24h。
食品中大肠菌群的测定
水质或食品的大肠菌群检测
实验小结 实验安排
❖ 水样采取 ❖ 初发酵试验（第10周完成） ❖ 平板分离 （第10周完成） ❖ 涂片，革兰氏染色，镜检 （第11周完成） ❖ 复发酵试验 （第11周完成）
②用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生 理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释 液，换用1支1ml灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释 液
③根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选择三个 稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。
2. 乳糖初发酵试验
3.分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼 脂平板上，置（36±1）0C温箱内，培养18h~24h，然后取出， 观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。
4.乳糖复发酵试验
即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酵管 试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽胞杆菌， 确能发酵乳糖产生气体。
即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发 酵乳糖产生气体的细菌。
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上 者，用双料乳糖胆盐发酵管；1ml及1ml以下者，用单料乳糖 发酵管。每一个稀释度接种3管，置（36±1）0C温箱内，培 养（24±2）h，如所有乳者，则按下列程续进行
在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群1~2个进 行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（36±1）0C的温 箱内培养（24±2）h，观察产气情况。
凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即 报告为大肠杆菌阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰氏染色为 阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。
5.报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告 每100ml（g）食品中大肠菌群的最可能数。
食品中大肠菌群计数——第一法检测程序步骤(精)
配制说明
将上述成分溶解于蒸馏水中,调节pH 至 6.8±0.2。分装到有玻璃小倒管的试管中,每 管10mL。 121 ℃高压灭菌15min。
乳糖 牛胆粉溶液 0.1%煌绿水溶液 蒸馏水
200mL 13.3mL 800mL
将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL 蒸馏水中,加入 牛胆粉溶液200 mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于 200mL 蒸馏水中,调节pH 至7.0~7.5),用蒸馏 水稀释到975mL,调节pH 至7.2±0.1,再加入 0.1% 煌绿水溶液13.3mL,用蒸馏水补足到 1000mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的 试管中,每管 10mL。121 ℃高压灭菌15min。
固体 和半 固体 样品
稀释方式 1:10
称取25g样品,放入盛有225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无 菌均质杯 内 ,8000r/min~10000r/min均 质1min~2min,或放入盛有 225mL磷酸盐缓冲液或生理盐 水的无 菌均质袋中,用拍击式 均质器拍打1min~2min,制成 1∶10的样品匀液。 以无菌吸管吸取25mL样品置盛 有225mL磷酸盐缓冲液或生理 盐水的无菌锥形瓶 (瓶内预置 适当数量的无菌玻璃珠)或其 他无菌容器中充分振摇或置于 机械振荡器中振摇,充分混匀, 制 成1∶10的样品匀液。
条件
36 ℃±1 ℃ 2 ℃~5 ℃ 46℃±1℃ 感量0.1g 无特殊要求 无特殊要求
无菌吸管
无菌锥形瓶 pH 计或pH 比色管或精密 pH 试纸
1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL 刻度)或微量移液器及吸头
500mL 无特殊要求
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食品营养与检测专业教学资源库
过渡页
检测药品的配制
食品中大肠菌群的测定实验
检样稀释
2. 用1mL无菌吸管吸取1:10稀释液1mL， 注入含有9mL无菌生理盐水的试管内， 振荡混匀，作1:100的稀释液；
3. 另取1mL无菌吸管，按上述操作依次作 10倍递增稀释液，每稀释一次换用 1支 1mL无菌吸管；
检样稀释
4. 根据食品卫生标准要求或对检样污染 情况估计，选3个稀释度，每稀释度接 种3管。 每100mL消毒乳中大肠菌群MPN不超 过40个
对样品进行连续10倍梯度系列稀释选择3个连续的合适的稀释度每个稀释度接种3管到乳糖胆盐发酵管内培养从规定的反应呈阳性管数的出现率查取大肠菌群最可能数mpn检索表报告每100mlg检样大肠菌群的最近似mpn大肠菌群的检验程序稀释大肠菌群阴性革兰氏阳性伊红美蓝琼脂平板报告乳糖胆盐发酵管革兰氏阴性无芽孢大肠菌群阴性大肠菌群阳性报告报告报告大肠菌群阴性革兰氏染色检样25ml25g放于含有225ml无菌生理盐水的三角瓶内经充分振摇作成1
产气 伊红美蓝琼脂平板
乳糖发酵管
革兰氏阳性
革兰氏阴性无芽孢
产气
大肠菌群阴性
大肠菌群阳性
报告
报告
大肠菌群的检验程序
不产气 大肠菌群阴性
报告
过程
◆检样稀释 ◆乳糖初发酵试验（假定试验） ◆分离培养 ◆乳糖复发酵试验（证实试验） ◆报告
检样稀释
1. 检样25mL(25g)放于含有225mL无菌生 理盐水的三角瓶内，经充分振摇作成1:10 的均匀稀释液。固体检样用无菌均质器。 以8000-10000r/min的速度处理1min，做成 1:10的均匀稀释液；
乳糖初发酵试验（假定试验）
◆目的：检查样品中有无发酵乳糖产酸产气的细菌。 ◆将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内; ◆乳糖：选择作用，大肠菌群能发酵乳糖产酸产气; ◆胆盐：抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌； ◆溴甲酚紫：pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由
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食品中大肠菌群计数测定的标准操作规
程
1目的
规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。
2范围
本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms ）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
3术语和定义
大肠菌群coliforms
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
最可能数most probable number ，MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。
4责任
质量部组织制订、化验室负责实施。
5内容
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下:
恒温培养箱：36 C± 1 Eo
冰箱：2 E〜5 Eo
恒温水浴箱：46 E± 1 Eo
天平：感量g o
均质器。
振荡器。
无菌吸管：1 mL （具mL刻度）、10 mL （具mL刻度）或微量移液器及吸头。
无菌锥形瓶：容量500 mLo
无菌培养皿：直径90 mm
pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。
菌落计数器。
培养基和试剂
月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose , LST ）肉汤：见附录A 中。
煌绿乳糖胆盐（ Brilliant Green Lactose Bile 结晶紫中性红胆盐琼脂（ Violet Red Bile Agar 磷酸盐缓冲液：见附录 A 中。
无菌生理盐水：见附录 A 中。
无菌1 mol/L NaOH :见附录A 中。
无菌1 mol/L HCl ：见附录 A 中。
大肠菌群MPN 计数法 检验程序
大肠菌群MP 计数的检验程序见图1。
图1大肠菌群MPN 计数法检验程序 操作步骤 样品的稀释
固体和半固体样品：称取 25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水 的无菌均质杯内，8000 r/min 〜10000 r/min 均质1 min 〜2 min,或放入盛有225
mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min 〜2 min ,制成1:10的样品匀液。
液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水 的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的 样品匀液。
样品匀液的pH 值应在〜 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调 节。
用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL ,沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液 面），振摇试管或换用 1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100
,BGLB 肉汤：见附录A 中。
,VRBA :见附录A 中。
的样品匀液。
根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀
液。
每递增稀释1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品
接种完毕，全过程不得超过15 min 。
初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），
每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种
量超过1 mL则用双料LST肉汤），36C± 1 C培养24 h±2 h,观察倒管内是否
有气泡产生，24 h ± 2 h 产气者进行复发酵试验，如未产气则继续
培养至48 h±2 h ，产气者进行复发酵试验。
未产气者为大肠菌群阴性。
复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤
（BGLB管中，36 r±「C培养48 h ±2 h，观察产气情况。
产气者，计为大肠
菌群阳性管。
大肠菌群最可能数（MPN的报告
按确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MP表（见附录B）,报告每g （mL）样品中大肠菌群的MP值。
大肠菌群平板计数法
检验程序
大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。
图2 大肠菌群平板计数法检验程序
操作步骤样品的稀释
按进行。
平板计数选取2个〜3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mb同
时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
及时将15 m〜20 m冷至46 C的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA约倾注于每个
平皿中。
小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加 3 mL〜
4 mLVRB覆盖平板表层。
翻转平板，置于36 C± 1 C培养18 h〜24 h。
平板菌落数的选择
选取菌落数在15 CFU-150 CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑
大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为mm 或更大。
证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管
培养24 h〜48 h，观察产气情况。
凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g （mL样品中大肠菌群数。
例：10-4样品稀释液1 mL，在VRB平板
上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGL肉汤管，证实有6个阳性管, 则该样品的大肠菌群数为：100X 6/10 X 104/g ( mL =x 105CFU/g( mL。
附录A
规范性附录）
培养基和试剂
月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST＞肉汤成分
胰蛋白胨或胰酪胨g
氯化钠g
乳糖g 磷酸
氢二钾（K2HPO)4 g
磷酸二氢钾（KH2PO)4 g
月桂基硫酸钠蒸馏水1 000 mL pH ±
制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH。
分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10
mb 121 °C 高压灭菌15 min。
煌绿乳糖胆盐（BGLB肉汤
成分蛋白胨g
乳糖g
牛胆粉（oxgall 或oxbile ）溶液200 mL
%煌绿水溶液mL
蒸馏水800 mL pH ±
制法将蛋白胨、乳糖溶于约500 m蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200 mL（将g脱水牛胆粉溶于200 m蒸馏水中，调节pH至〜），用蒸馏水稀释到975 mL调节pH,再加
入％皇绿水溶液mL,用蒸馏水补足到1 000 mL用棉花过滤后，分装到有玻璃小
倒管的试管中，每管10 mL。
121 C高压灭菌15 min。
结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）
成分蛋白胨酵母膏
乳糖g
氯化钠g
胆盐或3号胆盐g
中性红g
结晶紫g
琼脂15 g 〜18 g
蒸馏水1 000 mL pH ±
制法
将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pHo煮沸2 min，将培
养基冷却至45 C〜50 C倾注平板。
使用前临时制备，不得超过3 h。
磷酸盐缓冲液
成分磷酸二氢钾（KH2PO）4 g
蒸馏水500 mL pH
制法贮存液：称取g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L 氢
氧化钠溶液调节pH,用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。
稀释液：取贮存液mL,用蒸馏水稀释至1 000 mL,分装于适宜容器中，121 C
高压灭菌15 min 。
无菌生理盐水
成分氯化钠g
蒸馏水1 000 mL
制法称取g氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 C高压灭菌15 min。
1 mol/L NaOH
成分
NaOH g
蒸馏水1000 mL
制法称取40 g氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 C高压灭菌15 min。
1 mol/L HCl
成分
HCl 90 mL
蒸馏水1 000 mL
制法移取浓盐酸90 mL,用蒸馏水稀释至1 000 mL , 121 C高压灭菌15 min。
附录B
规范性附录）大肠菌群最可能数（MPN检索表
大肠菌群最可能数（MPN检索表每g （mL检样中大肠菌群最可能数（MPN的检索见表。