细胞培养操作步骤
细胞培养实验步骤大全(精华版)
细胞培养实验步骤大全(精华版)细胞培养是生物学研究中常用的技术，在许多实验室中都扮演着重要角色。
下面是细胞培养的一般步骤，供参考。
材料准备1. 细胞培养基：根据实验需求选择适当的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 细胞培养器具：培养皿、离心管、移液器等。
3. 细胞培养室：确保环境清洁、无菌。
细胞准备1. 细胞来源：选择要培养的细胞系或原代细胞。
2. 细胞传代：如果使用的是细胞系，根据需要进行传代，确保细胞状态良好。
细胞培养1. 细胞计数：使用显微镜和细胞计数仪等工具，准确计算细胞数目。
2. 细胞接种：按照实验要求，在含有培养基的培养皿中接种适量的细胞。
根据细胞类型的不同，可能需要预先涂覆培养皿。
3. 细胞培养条件：根据细胞类型的要求，提供适宜的培养条件，如温度、湿度和CO2浓度等。
4. 培养培养：定期更换培养基，保持细胞处于良好的生长状态。
5. 细胞观察：使用显微镜观察细胞形态和生长情况，检测是否存在异常。
细胞处理1. 细胞传代：根据细胞数量和状态，决定是否进行细胞传代。
传代可以延续细胞的寿命和维持细胞应答。
2. 细胞刺激：根据实验设计，给予细胞适当的刺激，如添加药物、因子或介质等。
3. 细胞采集：当需要获取细胞样本时，使用细胞剥离剂或胰蛋白酶等方法将细胞从培养皿中采集。
4. 细胞冻存：如果需要长期保存细胞，可以使用液氮冷冻保存的方法。
先加入冻存液，然后将细胞在适当条件下冷冻保存。
以上是细胞培养的一般步骤，根据具体实验和细胞类型，步骤可能会有所调整和细化。
在进行细胞培养实验时，请始终注意无菌操作和合理使用实验工具，以确保实验结果的准确性和可靠性。
细胞培养的实验步骤
细胞培养的实验步骤细胞培养的实验步骤如下：1、细胞复苏：细胞培养条件2、复苏流程：（1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。
（2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。
（3）提前做好复苏准备，预热培养基。
（4）悬浮和贴壁细胞复苏参数：（5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8ml时间大概1分30秒，1ml大概1min左右，需计时，其间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。
（6）贴壁细胞需离心，1000rpm，5min。
悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中（7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入T25方瓶，蕞后放入培养箱中培养。
（8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。
低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。
3、细胞传代培养1．悬浮细胞传代流程：（1）先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台。
（2）打开摇瓶瓶盖，用200ul移液器取100~200ul细胞放入1.5mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床。
（3）将200ul细胞混匀，取10ul细胞加入10ul台盼蓝，显微镜下计数。
根据细胞数决定下游实验。
（4）细胞需计数两次求平均值。
（5）悬浮细胞生长参数（6）根据不同细胞的生长曲线在合适的时间和密度给细胞接种传代。
以sf9细胞为例：细胞接种密度0.4x10^6个/ml,24h密度1x10^6个/ml,48h密度2.4x10^6个/ml,72h密度6x10^6个/ml，此时需要传代细胞。
要求留样100ml0.4x10^6个/ml具体操作如下：计算：需要母细胞体积=100*0.4/6=6.6ml需要培养基体积=100-6.6=93.4ml将上面体积的细胞和培养基加入摇瓶中，放回27度培养箱培养即可2.贴壁细胞传代流程：（1）显微镜下观察细胞状态和密度，80%汇合率以上需要传代。
（2）T25方瓶中加入0.5ml~1ml0.25%胰酶溶液（需37度预热），使瓶底细胞都浸入溶液中。
细胞培养的方法与步骤
细胞培养的方法与步骤1．开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。
同时将放在4℃内的培养液提前放置到室温。
（可放在抽屉中，防止紫外照射）换液2．先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。
3．将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。
4．打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要用纱布擦净。
5．倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5ml）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。
6．倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。
传代2．拿出细胞，开口，烧，倒液。
3．（5ml大枪加3ml）用PBS洗2~3遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。
4．胰酶消化，37℃5分钟（时间可自控）。
消化程度是细胞不能滑落，要吹落。
500微升胰酶（4×，1%）+1.5mlPBS→工作浓度0.25%（此时要用大枪）。
5．（大枪）加入3mlDMEM完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要让吸管的嘴端接触到瓶壁）6．将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶3遍，PBS一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少100次）7．倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3mlDMEM完全培养液重悬细胞，用吸管吹掉（再洗，清除胰酶）。
8．离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50~100下，视细胞情况而定），防止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。
9．在培养瓶中加入新鲜培养液4ml，将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要而定）。
80微升，100微升都可以。
冻存8．在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。
9．封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。
细胞培养过程
细胞培养过程：复苏、换液、传代、冻存1、复苏（1）取适量培养液加入离心管中；（2）将冻存的细胞在37℃水浴中快速使其融化；（3）将细胞吸入离心管中，1000r.min-1离心5 min,倒去上清液，规定加入培养液，打匀，转移到培养瓶中，即可。
2、换液（1）将培养瓶中已变色的培养液倒掉，余液用棉花蘸掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（从没有细胞的一侧倒掉）（3）加入新鲜培养液，即可。
3、传代（细胞生长得较满、较好，分瓶后至少培养两天后再铺板）（1）将培养瓶中已变色的培养液倒掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（细胞一侧）；（3）加入2 mL胰酶，静置，待细胞将脱落时，倒掉胰酶，加入培养液，打匀后，分至多个瓶中。
4、冻存（1）将培养瓶中已变色的培养液倒掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（细胞一侧）；（3）加入胰酶，静置，待细胞将脱落时，倒掉胰酶（可不倒），加入适量培养液，将贴壁细胞吹落，吸入到离心管中，1000r.min-1×5min,倒掉上清液，加入900uL新生牛血清（营养来源）和100 uLDMSO（保护剂）打匀后，吸到冻存管中，密封，于-80℃冻存。
1.预先配制冻存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清，4℃冰箱保存预冷；2.用胰酶对细胞进行消化：倒去培养瓶中的培养基或用枪小心吸去培养板中的培养基，PBS 冲洗两次，用胰酶消化细胞（尽可能温和）；3.再次用完全培养液悬浮细胞，将预冷的冻存液加入消化完全的细胞中，用滴管轻轻吹打混匀。
4.在每支冻存管中加入1ml细胞液，密封后标记冻存细胞名称和冻存日期。
5.冻存步骤的细致直接关系到细胞复苏时的活力，如果有程序降温器（放在-80℃冰箱过夜，放入液氮罐）最好；或者可以在4℃，2h；然后转到-20℃，2h；-80℃，2h；放入液氮罐。
细胞复苏1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3. 离心， 1000rpm，5min；4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；5. 次日更换一次培养液，继续培养。
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤细胞培养是一种在体外培养和繁殖细胞的方法，广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域。
下面是细胞培养的操作步骤，包括细胞的收获、传代和检测。
1.材料准备：- 细胞培养基：选择适合细胞类型和培养要求的培养基，常用的包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI（Roswell Park Memorial Institute）等。
-细胞：选择合适的细胞系，如人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。
-细胞培养器具：包括培养皿、细胞培养瓶、细胞离心管等。
2.细胞收获：-细胞培养器具消毒：用70%乙醇或其他消毒剂将培养器具进行消毒。
-细胞培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞培养皿涂覆：将培养皿或瓶子内壁涂覆一层细胞黏附物，如明胶或聚-卵氨酸等，以增加细胞附着。
3.细胞传代：-培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞收获：将细胞培养瓶中的培养基倒掉，用生理盐水等缓冲液洗涤细胞。
- 细胞分离：使用胰酶（Trypsin）或胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）将细胞从细胞培养瓶上析离下来。
-细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。
-细胞培养：将细胞培养在新的细胞培养瓶中，加入适量的预热培养基。
4.细胞检测：-细胞形态观察：使用倒置显微镜或显微摄像系统观察细胞的形态变化和增殖情况。
- 细胞活力检测：使用细胞活力检测试剂，如MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）或CCK-8（Cell Counting Kit-8）等，评估细胞的存活率和代谢活力。
- 细胞凋亡检测：使用凋亡检测试剂盒，如Annexin V-FITC和PI （Propidium Iodide）等，评估细胞凋亡的程度。
细胞培养详细过程及注意事项
细胞培养详细过程及注意事项细胞培养是在体外培养和维持生物细胞生长和繁殖的一种技术，它是生物学、医学研究和药物研发等领域的重要实验手段。
细胞培养的过程需要遵循一定的步骤和注意事项，以确保细胞的正常生长和繁殖。
细胞培养的详细过程如下：2.细胞分离：将组织或细胞样品分离，去除多余的组织或细胞，获得单个细胞的悬浮液。
分离的方法包括酶消化、机械或化学分离等。
3.细胞培养基准备：准备培养基，培养基的配制根据细胞的要求而定，可以是无血清培养基、低血清培养基或含血清的培养基。
培养基提供了细胞所需要的营养物质和生长因子。
4.细胞接种：将细胞悬浮液接种到含有培养基的培养皿或培养瓶中，密度通常在1×105至1×106个细胞/mL之间。
接种后，培养皿或培养瓶需放入培养箱中，设定适当的温度、湿度和气体环境。
5.细胞培养条件控制：细胞的生长和繁殖需要适宜的培养条件。
常规的培养条件包括37℃、5%CO2和95%湿度。
通过调节培养基的pH值、温度和培养箱内的CO2和湿度等参数，来维持良好的培养环境。
6.细胞观察和培养基更换：培养过程中，需要定期观察细胞的生长状态和形态，通过显微镜观察细胞的形态变化和细胞层的覆盖率等指标。
根据需要，定期更换培养基，以确保提供足够的营养物质和维持适宜的细胞密度。
7.细胞传代：当细胞达到充分生长的状态时，需要进行传代，即将细胞从当前培养皿或培养瓶中移至新的培养皿或培养瓶中，以保证细胞的健康和生长。
用一句话总结上述细胞培养的过程就是从细胞分离到细胞培养，并按照一定条件进行观察和传代。
在进行细胞培养时，需要注意以下事项：1.无菌操作：细胞培养需要在无菌条件下进行，避免细胞被异物或外源性微生物污染。
操作前，材料和设备需要进行消毒。
2.培养基筛选：根据细胞的特性和需求选择合适的培养基，确保细胞能够获得必要的营养物质和生长因子。
3.冻存细胞库：定期将细胞进行冻存，以备后续使用，以避免病毒污染或细胞失活。
细胞培养操作流程
细胞培养操作流程细胞培养是一种人工环境中扩增和维持活细胞的技术。
它对于研究细胞生物学、药物筛选和治疗等方面有着重要的应用。
下面是一个常见的细胞培养操作流程，具体步骤如下：1.准备培养器具和试剂：首先需要准备好培养器具和所需试剂，包括培养皿、离心管、培养基、培养液、胶原蛋白贴士等。
2.细胞的分离和收获：将待培养的组织或细胞样品取出，用适当的方法将细胞分离开来。
可以使用酶消化、机械切割或筛选等方法。
分离好的细胞通过离心将细胞沉淀，将上清液吸掉，得到细胞沉淀。
3.细胞计数和浓度调整：使用细胞计数仪或血球计数室等工具，将细胞计数。
根据需要可以进行浓度调整，使其适合在培养器具中的扩增。
4.细胞的接种和培养：将得到的细胞沉淀重新悬浮于培养基中，并将其放置于培养皿中。
确定适宜的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。
定期观察细胞的生长情况，并更换培养基，以维持细胞的健康生长。
5.细胞的传代：当细胞在培养皿中达到一定密度时，需要进行传代，以防止细胞群体过于致密导致细胞生长受限。
传代前需先将细胞沉淀，并用如十倍的细胞培养基将其重新悬浮。
将悬浮的细胞分装至新的培养皿中，培养基的更换和细胞的观察也是相同的。
6.试验处理：在细胞培养过程中，可能需要对细胞进行各种试验处理，如药物处理、感染等。
根据需要，将试验处理物加入培养基中，确保细胞接触到试剂，并保持正常生长。
7.细胞固定和染色：进行一些试验或者观察时，对细胞进行固定和染色可以帮助观察或者分析细胞的形态、细胞器分布等。
选择适合的固定和染色方法，将细胞固定在培养皿中，并使用染色剂染色。
8.细胞的收集和保存：在实验完毕后，可以用适当的方法将培养皿中的细胞收集起来。
例如，轻轻洗涤细胞，然后加入适当的缓冲液，用吸管吸出，或者使用离心机离心沉淀。
收集好的细胞可以用于下一步的实验，或者进行冷冻保存。
9.培养器具的清洁和消毒：一旦细胞收集完毕，需要对使用过的培养器具进行清洗和消毒，以防止细菌、真菌、病毒等的传播。
细胞培养操作步骤
细胞培养操作步骤细胞培养是一项用于研究和生产生物技术产品的基础技术。
以下是细胞培养的一般操作步骤：1.实验室准备：-消毒：在开始实验之前，对实验室进行消毒处理，确保实验环境的无菌。
-工具准备：准备好所有需要的培养器具，如离心管、试管、培养皿、吸管等。
-培养基准备：根据实验需要，准备好适当的培养基，并对其进行消毒处理。
2.细胞准备：-细胞收获：收获细胞，并将其转移到一个装有细胞培养基的培养皿中。
-细胞计数：使用细胞计数器或显微镜对细胞进行计数和分析，以确定细胞的浓度和活性。
-细胞传代：如果需要，将细胞进行传代以维持其活性和数量。
3.培养条件：-培养温度：根据细胞的要求，将培养皿放置在适当的温度控制设备中，通常为37℃。
-CO2浓度：对于一些细胞（如哺乳动物细胞），需要提供适当的CO2浓度来维持其生长和代谢。
-培养液更换：根据具体要求，定期更换培养液，以保持细胞的健康生长。
4.细胞培养：-培养基添加：向培养皿中加入适当量的培养基，以提供细胞生长和繁殖所需的养分。
-培养皿处理：将培养皿放入恒温培养箱中，确保细胞在适宜的环境中生长。
-细胞观察：定期使用显微镜观察细胞的生长情况和形态变化，以评估细胞的健康状态。
-培养皿除菌：如果培养皿被发现有细菌或真菌污染，需要将其除菌，以保证细胞的无菌状态。
5.细胞传递：-细胞解离：当细胞达到所需密度或需要进行分离时，使用适当的酶或溶液将细胞从培养皿中解离。
-细胞收获：通过离心，将细胞收集到离心管中，并进行计数和分析。
-细胞传递：将细胞转移到新的培养皿中，重新开始培养过程。
细胞培养是一项复杂而精细的操作，需要高度的无菌技术和细心的操作。
在整个过程中，需要持续监测和调整培养条件，以确保细胞的健康生长和繁殖。
此外，注意遵循实验室的安全规范，保护自己和实验室的安全。
细胞培养的成功与否，将直接影响到后续实验的结果和应用。
细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存)
例如,配制1000ml的5%的稀盐酸,150ml的浓HCL加850ml的蒸馏水即 可。
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细胞计数
方法
吸出细胞悬液少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和 计数板之间。 静置三分钟 镜下观察，计数板四大格细胞总数。公式为：细胞数/ml= 四大格细胞总数/4 ×104个
细胞培养
1
一 原代培养（略）
2
二. 传 代 培 养
准备及注意事项 换液 传代 冻存 复苏 MTT
3
准备事项
1. 紫外灯照射细胞室30分钟,风机运行10分 钟后方可进入实验室.
2. 穿专用的口罩,帽子,拖鞋,工作衣等. 3. 带手套,并用酒精擦拭之. 4. 准备好实验必需用品. 5. 超净工作台内操作前用酒精棉球擦拭台面. 6. 超净工作台内操作完成后，
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RPMI1640培养基的配制：
1. 取一小袋1640培养粉，加高压过的三蒸水800ml， 在1000ml的烧杯中用玻璃棒搅拌溶解；
2. 加碳酸氢钠2.0g，再加三蒸水定容至1000ml； 3. 加青霉素(100U/ml) ，链霉素（100µg/ml）； 4. 在超净工作台内过滤除菌，分装成180ml，-
15
MTT法
1.实验开始前，96孔板应在超净台紫外灯下照 射2个小时以上。
2.从培养箱中拿出培养瓶，观察，加PBS，加 胰酶消化，加培养基，计数。
（方法及步骤同传代1-13步。）
3.加培养基，调整细胞浓度为10000个/200µl.
4.加到96孔板内,每板6行8列共48孔,每孔
200µl.
5.盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微
4. 取出器皿，高压后，放烤箱上层，再次烘 干即可使用。
细胞培养的操作步骤
细胞培养得操作步骤一、原代培养及其操作步骤原代分离细胞培养就是指从供体内取出组织后,经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群,使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度与一定得营养条件下，生存、生长与繁殖。
原代培养细胞常有不同得细胞成分,生长缓慢,但就是更能代表所来源得组织细胞类型与表达组织得特异性特征。
利用原代细胞培养做各种实验,如药物测试、细胞分化及病毒学方面得试验效果很好。
其操作步骤如下。
1、剪切组织先将所取得得组织，用D－Haｎｋｓ或Hankｓ液清洗,以去除表面血污，并用手术镊去除黏附得结缔组织等非培养所需组织。
再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块,移入青霉素小瓶或小烧杯中,加入适量缓冲液,用弯头眼科剪,反复剪切组织,直到组织成糊状，约1mm3大小。
静置片刻后,用吸管吸去上层液体，加入适当得缓冲液再清洗一次。
2、消化分离消化分离得目得就是将细小得组织块消化分离成细胞团或分散得单个细胞,以利于进一步得培养,常用得消化酶有胰蛋白酶与胶原酶。
３、培养细胞悬液用计数板进行细胞计数。
用培养液将细胞数调整为（2～５)×105 cellｓ/ｍl，或实验所需密度,分装于培养瓶中,使细胞悬液得量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。
置CＯ２培养箱内,5％CＯ2,37℃静置培养。
一般3～5d,原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长,可补加原培养液量1/２得新培养液,继续培养2～3d后换液,一般7～１４d可以长满瓶壁,进行传代。
4、注意事项(１)无菌操作:细菌或霉菌污染就是培养失败得常见原因,必须加强各个环节得无菌操作观念,以预防为主,一旦污染,一般很难消除。
(2）培养液：所用得培养液必须满足细胞生存与生长得必要条件。
由于细胞来源得动物种类、组织类型不同,对培养液得要求有一定得差异,必要时可用预实验得方法选择适当得培养液。
（3)小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞得生存与促进细胞增殖起着关键性作用。
实验室细胞培养的一般步骤
实验室细胞培养的一般步骤细胞培养是一项重要的实验室技术，广泛应用于生命科学研究以及医药产业中。
下面将为您介绍一般的细胞培养步骤，希望能为您提供一些指导意义。
第一步：制备培养基细胞培养的第一步是制备适合细胞生长的培养基。
培养基通常包括营养物质、氨基酸、维生素、生长因子等，可以为细胞提供足够的养分和环境条件。
根据不同的细胞类型和实验目的，制备不同种类和浓度的培养基。
第二步：分离细胞在细胞培养之前，需要将细胞从组织、器官或已有培养物中分离出来。
通常采用酶消化、机械剪切或离心等方法来分离细胞。
分离后，细胞可以在培养基中生长和繁殖。
第三步：细胞接种将分离出的细胞接种到含有培养基的培养皿或培养瓶中。
接种密度要适当，不宜过稀或过密。
同时，需要将培养基中的氧气和二氧化碳平衡，通常使用CO2培养箱来提供适宜的气体环境。
第四步：细胞培养经过接种后，细胞开始在培养基中生长和分裂。
在培养过程中，需要控制细胞的温度、湿度和pH值，保持适宜的生长条件。
此外，定期更换新鲜的培养基可以提供足够的营养物质，维持细胞的正常生长。
第五步：细胞检测和观察细胞培养的过程中，需要定期对细胞进行检测和观察。
包括细胞数量的计数、形态的观察和生长曲线的绘制等。
通过这些检测和观察，可以了解细胞的健康状态、增殖速率以及其他相关参数。
第六步：细胞应用或冻存根据研究或实验的需要，可以选择将细胞用于进一步的实验、传代培养或冻存保存。
冻存细胞需要使用适当的冻存液，将细胞缓慢冷冻并存放在液氮罐中，以便长期保存。
细胞培养是一项需要耐心和细心的工作，每一步都需要严格控制条件和遵循操作规范。
只有如此，才能获得可靠的实验结果和高质量的细胞培养。
希望本文能为您提供参考，更好地开展细胞培养工作。
细胞培养技术基本操作步骤
细胞培养
（1）超净台准备：穿好隔离衣，拖鞋后，进入细胞培养室。
带好手套，紫外线消毒30分钟，点
燃酒精灯，烘烤仪器架，将要使用的滴管烘烤大
约四分之三的长度，并配好胶头，放在仪器架上
备用。
（2）细胞复苏：将准备复苏的细胞，快速送入细胞室后，放入37℃的温箱，大约1分钟左右，
至冻存管解冻大约五分之四时取出，进入超净台，开始复苏。
将冻存管中的液体用一号吸管取出放
入准备好的离心管中，放入离心机中离心5分钟
／1000R，弃去上清，用2号吸管放入适量的培
养液用一号吸管充分吹打后分装在培养瓶中，并
用2号吸管注入适量培养基，于细胞培养箱中培
养（松开瓶口）。
（3）细胞换液：用1号吸管吸取液体，紧贴细胞生长的壁吸液，用2号吸管吸取新的培养液。
（4）细胞传代：用1号吸管弃去废液，并用PBS 液冲洗两遍，用枪头取胰酶约800ul入培养瓶,
震荡一分钟左右,当有片状脱离时,用培养液终止
反应,取出离心,后弃去上液,加入新的培养液吹
打充分后,分装.
（5）细胞冻存:如细胞传代,将细胞分离后,加入冻存液,分装到冻存管中(1.5ml),放入冻存室.。
细胞培养操作步骤及注意事项
细胞培养操作步骤及注意事项细胞培养操作步骤1. 准备培养基和培养器具：选择适合细胞生长的培养基，如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium），RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute 1640）等。
准备培养器具，如细胞培养瓶、组织培养皿、离心管等。
2. 培养器具的消毒：将培养器具放入70%的乙醇或漂白水中浸泡约15-30分钟，然后用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）清洗3次。
将培养器具在100摄氏度的烘箱中高温烘干或使用紫外线灯照射15-30分钟。
3. 细胞传代：将细胞从旧的培养瓶中移至新的培养瓶中，以防止细胞过度增殖和细胞衰老。
首先将培养瓶中的培养基抽吸掉，然后用PBS洗涤细胞2次，最后加入适量的胰酶消化细胞，使其与培养基充分接触，放置一段时间，观察细胞的离培情况，离心沉积细胞，弃去上清液，加入新的培养基。
4. 细胞培养条件控制：维持培养环境的适宜条件，包括温度、湿度、CO2浓度和培养基的pH值等。
通常细胞在37摄氏度、5%的CO2和95%湿度下生长。
定期检查培养器的培养基水平，保持培养基的适当量。
5. 细胞观察和记录：使用显微镜观察细胞的形态和数量，记录细胞培养的过程和实验结果。
注意控制细胞的密度，防止过度密集或过度稀疏。
6. 细胞分化和实验处理：根据需要，可以进行细胞的分化处理或实验处理，如加入药物、生化试剂等。
在处理时要注意药物的浓度、处理时间和处理温度等。
7. 细胞冻存：当需要长期保留细胞时，可以进行细胞冻存。
将细胞与冻存液混合，分装入冻存管中，置于液氮中冻存，以备将来使用。
细胞培养注意事项- 细胞培养实验应在无菌条件下进行，避免污染。
- 培养器具应事先消毒处理，防止细菌、真菌和病毒的污染。
- 培养基的配制要准确无误，严格按照操作手册或厂家提供的方法进行。
- 培养过程中要保持培养器的密闭性，以确保适宜的气体交换和温度控制。
医学实验中细胞培养的基本操作教程
医学实验中细胞培养的基本操作教程细胞培养是医学实验中常用的技术手段，可以通过培养细胞体外研究细胞结构、功能、代谢以及疾病的发病机制。
本文将介绍医学实验中细胞培养的基本操作教程，包括无菌操作、细胞传代和细胞培养基的制备。
一、无菌操作1. 器具准备：将工作区域和培养器具用70%乙醇喷雾消毒，将所需器具放入无菌工作台，待干燥后再进行后续操作。
2. 细胞培养基准备：将所需的细胞培养基放入无菌环境中，根据实验需求添加适量的血清、抗生素等。
3. 细胞取样：取出培养物中所需的细胞，使用吸管或移液器将细胞转移到无菌的培养基中。
4. 细胞传播：将细胞和培养基混合均匀后，转移到培养皿或培养瓶中，注意避免皿壁的污染。
5. 无菌操作结束：将使用过的培养器具进行无菌处理，清理工作区域并进行必要的消毒。
二、细胞传代1. 始代细胞收获：当细胞在培养器中达到一定密度后，使用细胞解离液将细胞从底物上解离下来。
2. 离心：将解离的细胞转移到离心管中，以适当的转速离心沉淀细胞。
3. 上清液去除：倒掉离心管中上清液，注意尽量不要干扰到细胞沉淀。
4. 细胞悬浮液制备：使用无菌PBS洗涤离心沉淀的细胞，再添加适量的细胞培养基将其悬浮均匀。
5. 细胞传代操作：将悬浮细胞转移到新的培养器具中，注意避免气泡的产生，并将培养基置于CO2孵化箱中培养。
三、细胞培养基的制备1. 培养基组成：根据实验需求，制备含有特定成分的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 液体消毒：将容器进行高温高压灭菌，确保培养基的无菌。
3. 配方调整：按照实验需求向培养基中添加适量的血清、抗生素、谷氨酸等。
4. 混合均匀：使用无菌器具将添加好成分的培养基搅拌均匀，确保各成分充分溶解。
5. 培养基保存：将制备好的培养基用无菌器具装入培养瓶中，标明日期和成分，存放于4℃的冰箱中，避免阳光直射。
以上就是医学实验中细胞培养的基本操作教程，从无菌操作、细胞传代到培养基的制备，这些基本技术对于医学实验中的细胞研究至关重要。
细胞培养标准流程
细胞间基本规定每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min)。
显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。
超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。
带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾.细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。
基培需写上开启时间。
细胞培养标准流程1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例）Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。
所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。
步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌2。
弃旧：细胞生长融合达90％时，吸出培养基3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1—2次4。
消化：加入1ml 0。
25％胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO2 放置40s-1min，，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞脱壁。
5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10％FBS的完全培养基终止消化。
6。
吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁,呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿.再加入10ml全培。
（大盘10ml全培，小盘6ml全培）（细胞生长快留30％，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA）7。
培养:每天或每两天更换一次培养基,直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况.PS：六孔板一般加培养基2300μL/孔。
2、细胞转染TurboFect 转染试剂转染(用于质粒的转染,说明书附后）细胞接板24 h 后转染。
转染时细胞密度需达到70-90%。
以6 孔板为例，转染前细胞先换液,加4ml全培。
取1.5 ml 离心管，加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入质粒2 μg，混匀后静置5 min，再转染试剂4 μL,混匀(转染试剂是质粒的2倍），室温静置15－20 min。
细胞培养工作步骤
细胞培养工作步骤细胞培养是一种在体外培养和繁殖细胞的技术。
它在生物学研究、药物筛选以及组织工程等领域有着广泛的应用。
下面将详细介绍细胞培养的工作步骤。
一、细胞株的选择和准备1.确定所需细胞株的种类和特性。
不同细胞株有不同的生物学特性和培养要求，因此需要选择合适的细胞株。
2.购买或获取合适的细胞株。
细胞株可以通过购买或从其他实验室获得。
确保细胞株的纯度和正常生长状态。
3.细胞株的复苏。
如果细胞株是冻存的，需要将其复苏并重新培养，以恢复其生长状态。
二、细胞传代1.收获细胞。
当细胞达到适当的生长程度时，可以通过离心或酶消化来将细胞从培养皿中收获。
2.细胞计数。
使用细胞计数仪对细胞进行计数，以确定细胞的密度。
3.传代细胞。
根据细胞株的生长速度和特点，将适量的细胞转移到新的培养皿中。
通常将细胞密度控制在适当的范围内，以避免过度或不足的细胞分离。
三、细胞培养与维持1.培养基的准备。
根据细胞株的要求配制合适的培养基，并确保培养基的无菌状态。
2.细胞接种。
在培养皿中加入适量的培养基和细胞，使细胞均匀分布在培养皿底部。
3.培养条件的控制。
控制培养室的温度、湿度和二氧化碳浓度，以提供适宜的生长环境。
定期检查培养皿中的细胞状态，并及时调整培养条件。
4.培养基的更换。
根据细胞的生长速度和代谢需求，定期更换培养基，以保持细胞的健康状态和生长活力。
5.细胞的分离和传代。
当细胞达到足够密度时，可以通过离心和酶消化将细胞从培养皿中收获，并进行传代培养。
四、细胞实验的准备1.细胞的收获和处理。
根据实验需求，收获和处理细胞，如离心、洗涤和冻存等。
2.细胞计数和分配。
根据实验要求对细胞进行计数，并将其均匀分配到不同的培养皿或器皿中。
3.细胞实验的操作。
根据具体实验的要求，进行相应的处理和操作，如细胞培养、细胞刺激、药物处理等。
4.实验的时间和条件控制。
根据实验需要，控制实验的时间、培养条件和实验室环境，以确保实验的可重复性和准确性。
细胞培养工艺操作
细胞培养工艺操作
细胞培养工艺操作是指在实验室中通过特定的操作步骤来培养和繁殖细胞。
以下是一般的细胞培养工艺操作流程：
1. 细胞培养容器消毒：将细胞培养器皿（如培养皿、培养瓶等）放入含有70%乙醇或其他适合的消毒液中浸泡一段时间，然
后用无菌工具或架起将其取出。
2. 细胞培养液的配制：根据需要选择适当的细胞培养液，加入所需的培养基、营养物质和生长因子等，按照指定比例和pH
值配制。
3. 细胞的接种：将已经培养好的细胞株加入到培养皿或培养瓶中，可以通过喷枪、注射或倒入法等方式进行接种。
4. 培养器的维持：将培养器置于恒温培养箱中，设定适当的温度、光照和通气条件，提供良好的培养环境，保持细胞的生长和繁殖。
5. 细胞的观察和检测：定期观察细胞的生长情况、形态和细胞密度，可以使用显微镜进行观察，并且可以通过细胞计数、增殖实验和细胞活力检测等方法来评估细胞的状态。
6. 细胞的分离和传代：当细胞数量增多时，可以进行细胞的分离和传代，将细胞移至新的培养器中，保持细胞活性和细胞株的纯度。
7. 检测细胞的纯度和品质：可以通过细胞鉴定方法，如PCR、免疫组化和染色体分析等来验证细胞的纯度和品质。
8. 储存和保存：将培养好的细胞冷冻保存或制备细胞冻存物，以备后续实验或重新培养使用。
以上是一般的细胞培养工艺操作流程，不同细胞类型和实验目的可能会有所不同，操作过程中需要遵循无菌操作原则和实验室安全规范。
细胞培养操作步骤
细胞培养操作步骤细胞培养是生物学实验中常用的一项技术。
通过细胞培养，可以研究细胞的生理活动、疾病发生机制以及药物的毒性和疗效等。
本文将为大家介绍细胞培养的基本操作步骤，帮助读者更好地进行细胞培养实验。
一、实验前准备1.1 材料准备首先，准备好所需的实验材料和试剂。
主要包括细胞培养基、培养皿、移液器、离心管、冰桶、显微镜和相应的培养器具等。
1.2 密切关注无菌操作细胞培养需要在严格无菌条件下进行，以避免细胞受到污染而影响实验结果。
实验前要正确佩戴防护服和洗手，确保操作台面、培养皿和使用的器械都经过高温高压消毒。
二、细胞的处理2.1 细胞种植将培养基加热至37摄氏度，并取出暖培养皿备用。
从细胞库中取出所需细胞的冻存管，在冰上迅速解冻，并将细胞转移到暖培养皿中。
注意，细胞数量应适量，不宜过多，否则会影响细胞的生长和适应。
2.2 细胞传代当细胞在培养皿中达到一定的密度后，需要进行传代操作，以保证细胞的健康和活力。
传代前，首先用生理盐水或PBS洗净细胞，并加入胰蛋白酶等消化酶将细胞从培养皿表面脱落。
然后，将细胞转移到新的培养皿中，并加入新鲜的培养基。
三、细胞培养条件的控制3.1 细胞培养环境将细胞培养皿置于37摄氏度的培养箱内，以提供适宜的温度和湿度。
此外，还要保持适当的氧气和二氧化碳浓度，可以通过培养箱上的气体调节装置进行控制。
3.2 培养基的更新培养基中含有丰富的营养物质，但随着时间的推移，这些营养物质会逐渐降解消耗，影响细胞的生长。
因此，需要按照一定的时间间隔进行培养基的更新，保持细胞在新鲜和富有营养的环境中。
四、细胞观察与处理4.1 细胞观察使用相差显微镜或荧光显微镜观察细胞的形态、数量和状态。
可以观察细胞的生长情况、染色效果以及细胞内特定蛋白的表达等。
4.2 细胞处理根据实验需求，可以对培养的细胞进行不同的处理。
例如，给细胞添加特定的药物、激素或化合物，刺激细胞产生某种反应或模拟特定的生理环境等。
细胞培养的步骤
细胞培养的步骤
1.提取细胞：从组织样本中提取细胞是第一步。
这通常涉及对组织样
本进行机械和/或化学消化，以分离细胞并减少细胞团块。
2.细胞计数：对提取的细胞进行计数。
这可以通过使用像细胞计数器
这样的工具，或通过使用显微镜和涂片来实现。
3.培养基的准备：准备和调配培养基，以支持细胞的生长和增殖。
培
养基通常包含氨基酸、糖类、盐类、维生素和其他必要的营养物质。
4.培养皿的准备：选择正确的培养皿，如培养瓶、板、碟等。
这些容
器必须经过灭菌，以确保细胞在无菌条件下生长。
5.细胞接种：将已计数的细胞放入已准备好的培养皿中。
细胞的密度
和细胞数量应根据您的实验需求而定，以确保细胞在培养基中生长和繁殖。
6.细胞培养条件：定期观察细胞的生长情况，包括其形态、数量和细
胞状态。
确保充足的培养基，在恰当的温度和湿度下培养好细胞。
7.细胞传代：细胞被传代时，将细胞从一个细胞培养皿中转移到另一
个细胞培养皿中。
传代可以用于扩大细胞数量或在不同实验中使用同一批
细胞。
8.细胞收获和分离：利用细胞收获试剂将细胞释放到培养基中。
成功
收获后，对细胞进行血清处理或其他方法进行分离和纯化。
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培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml冻存液的配置：DMS018ml+胎牛血清2ml。
依次比例酌量配置。
超净工作台常规配置移液器1套（2.5小20 d、200 pl> 1ml）,酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶 1 个，酒精棉球缸 1 个，污缸 1 个，常规耗材：培养瓶（50 cm 2）,定量移液管（5ml、10ml）,枪头（1ml、200小10 d）,培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO,胰酶，苯扎溴氨，75%酒精……实验前准备：所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min 后开始实验操作。
首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37C的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37C水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。
若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。
这一过程可在超净工作台外操作。
实验步骤一、原代细胞的培养1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2. 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。
特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。
3. 取1 个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3 后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。
4. 拿出1 支高压后的5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。
5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。
6•将培养瓶放于28C,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。
注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。
在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。
最后更换培养液。
、培养液的更换1．紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2．将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。
特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧3. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3 次，瓶盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3 次瓶口，4．拿出1 支高压后的5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放。
5．将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。
6•将培养瓶放于28C,5%CO2勺培养箱内培养，旋开瓶口少许。
每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h 后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞勺传代。
三、细胞传代1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者勺双手。
2. 将所需勺培养基，胰酶确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯勺两侧。
特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近勺位置，瓶盖置于酒精灯勺另一侧。
3. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3 次，瓶盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内勺培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3 次瓶口，竖直放好。
取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次，然后再装上枪头吸取 1.5ml 胰酶液，悬空移入培养瓶内。
4. 将培养瓶平放使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层，计时约40s,立马竖起对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2 个细胞脱落，这时为胰酶消化的最适时机。
若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，则需继续消化，轻轻的迅速平放培养瓶使胰酶浸没细胞层1s后迅速竖起对着灯光观察细胞情况，可反复几次，直至出现针孔样缝隙和1-2 个细胞脱落的最佳消化状态。
用移液器将胰酶吸净。
5. 吸取1ml 培养基于培养瓶内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8 次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3 次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。
6. 取2或3个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧，然后将细胞培养基均匀的分到 3 或 4个培养瓶内（注意原来传代时使用的培养瓶可继续传代使用），进行1传3或1传4的培养。
7. 拿出1支高压后的5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基悬空移入每个培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。
8. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。
9•将培养瓶放于28C,5%CO2勺培养箱内培养，旋开瓶口少许。
注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。
每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h 后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞勺传代或保株。
四、细胞株勺保存1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者勺双手。
2. 将所需勺培养基，胰酶确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯勺两侧。
特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近勺位置，瓶盖置于酒精灯勺另一侧。
3. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3 次，盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内勺培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3 次瓶口，竖直放好。
取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次，然后再装上枪头吸取 1.5ml 胰酶液，悬空移入培养瓶内。
4. 将培养使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层，计时约40s,立马竖起对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2 个细胞脱落，这时为胰酶消化的最适时机。
若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，则需继续消化，轻轻的迅速平放培养瓶使胰酶浸没细胞层1s 后迅速竖起对着灯光观察细胞情况，可反复几次，直至出现针孔样缝隙和1-2 个细胞脱落的最佳消化状态。
用移液器将胰酶吸净。
5. 吸取1ml 细胞冻存液于培养瓶内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8 次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3 次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。
6. 将1ml 含有细胞的冻存液移入新的保种管内，拧紧瓶盖，做好实验标记。
7. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。
8•将保种管先放于4C冰箱30min后拿出放置-20 C冰箱过夜，次日再放于-80 C 的冰箱内3-4天，最后存放于-196 C的液氮灌内长期保存。
注此过程也可简化因实际操作过程中经验所得：步骤7 结束后将保种管用干脱脂棉包裹后胶带封好直接放于-80 C冰箱内4-5天，即可放于液氮灌保存。
但-80 C 冰箱也可保存细胞株2-3月。
五、细胞转染操作前：紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
1. 预混液A fugeneHD 5ul/孔+ OPTI-MEM 45ul/孑L 室温温育10min2. 预混液B arr 16ul/孔+ OPTI-MEM 34ul/孑L 室温温育5min3. 预混液C 空载16ul/孔+ OPTI-MEM 34ul/孔室温温育5min4. 预混液D arr 12ul/孔+ ops 12ul/孔+ OPTI-MEM 26ul孔室温温育5min 注：fugeneHD为转染试剂,arr，空载，ops为模板？OPTI-MEM为空培养基5•将步骤2,3,4中的预混液B,C,D中分别加入步骤1中的等体积的预混液A,轻柔混匀，室温温育15mi n,再次轻柔混匀后室温温育15mi n。
6. 取出6 孔培养板，将每培养孔的培养基全部吸净，无残留，是为了防止残留的双抗和胎牛血清影响转染效果。
加入 1.5-2.0ml/孔的OPTI-MEM到6孔培养板内，轻轻摇匀。
7•将步骤5中再次混匀温育结束的预混液B,C,D分别以100ul/孔，加入目的培养孔中（空载，目的质粒，48h 72h）,按上下，左右，斜对角的方向轻轻摇匀。
8. 28C, 5%CO培养箱孵育6-8h后。
细胞换液为完全培养基。
另外，转染试剂与质粒的比例为5ul: 2ug，此时包被效果最佳一般，细胞培养48h 收RNA，72h 收蛋白。