细胞培养操作步骤

培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml

冻存液的配置：DMS018ml+胎牛血清2ml。

依次比例酌量配置。

超净工作台常规配置

移液器1套（2.5小20 d、200 pl> 1ml）,酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，

酒精喷壶 1 个，酒精棉球缸 1 个，污缸 1 个，

常规耗材：培养瓶（50 cm 2）,定量移液管（5ml、10ml）,枪头（1ml、200小

10 d）,培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管

所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO,胰酶，苯扎溴氨，75%

酒精……

实验前准备：

所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min 后开始实验操作。

首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37C的温水放于液氮罐旁边，待

细胞株取出后留上端1/3于37C水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若

种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。

实验步骤

一、原代细胞的培养

1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的

双手。

2. 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒

精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。

3. 取1 个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶

口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3 后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。

4. 拿出1 支高压后的5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，

再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。

5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试

剂及污缸等，关闭超净工作台。

6•将培养瓶放于28C,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。

在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。

、培养液的更换

1．紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2．将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧

3. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3 次，瓶

盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3 次瓶口，

4．拿出1 支高压后的5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放。

5．将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

6•将培养瓶放于28C,5%CO2勺培养箱内培养，旋开瓶口少许。

每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h 后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞勺传代。

三、细胞传代

1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者勺

双手。

2. 将所需勺培养基，胰酶确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基和

胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯勺两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近勺位置，瓶盖置于酒精灯勺另一侧。

3. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3 次，瓶

盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内勺培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消

毒2-3 次瓶口，竖直放好。取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次，然后再装上枪头吸取 1.5ml 胰酶液，悬空移入培养瓶内。

4. 将培养瓶平放使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层，计时约40s,立马竖起对着灯

光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2 个细胞脱落，这时为胰酶消化的最适时机。若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，则需继续消化，轻轻的迅速平放培养瓶使胰酶浸

没细胞层1s后迅速竖起对着灯光观察细胞情况，可反复几次，直至出现针孔样缝隙和1-2 个细胞脱落的最佳消化状态。用移液器将胰酶吸净。

5. 吸取1ml 培养基于培养瓶内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养

瓶壁5-8 次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3 次，使细

胞尽可能处于单个悬浮状态。

6. 取2或3个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消

毒瓶口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧，然后将细胞培养基均匀的分到 3 或 4