凝胶层析法分离纯化蛋白质

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三、平衡
将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与 层析柱入口相连，用2～3倍柱床体积的洗脱 液平衡，流速为0.5ml/min。
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四、加样与洗脱
将柱中多余的液体放掉出，使液面刚好 盖过凝胶，关闭出口，将1ml样品沿层析柱 管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液 面降至与凝胶面相平时关闭出口，加洗脱液 至液层4cm左右，接上恒流泵，开始洗脱 （ 0.5ml/min）。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程 较长，移动速率慢；所以最后流出。
中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的
程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二
者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。
这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的
单个凝胶珠本身象 “筛子”。不同类型凝 胶的筛孔的大小不同。
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带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层可编析辑pp过t 程示意图
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凝胶 凝胶基质 珠
小分子 大分子
凝胶过滤层可析编辑过ppt 程示意图
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总结：
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程 较短，移动速度快；所以首先流出。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
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【目的】
掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验 技能
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【原理】
凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。 是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用， 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离的技术。
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凝胶过滤层析
凝胶层析是按照蛋 白质分子量大小进行分 离的技术，又称之凝胶 过滤、分子筛层析或排 阻层析。
• 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发， 凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量
气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变 坏，不得不重新装柱。
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顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
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【实验器材】
层析柱 恒流泵 紫外检测仪 部分收集器 试管等普通玻璃器皿
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【实验试剂】
待分离样品 葡聚糖凝胶 Sephadex G-100 洗脱液：0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液
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五、收集与测定
用部分收集器收集洗脱液。紫外检测仪 280nm处检测，将检测信号输入色谱工作站 系统，绘制洗脱曲线。
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六、凝胶柱的处理
凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱 （2~3倍床体积）即可。
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注意事项
• 各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损， 否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应 无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产 生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱 内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处， 应仔细检查并加以纠正。
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【操作方法】
一、凝胶的处理
Sephadex G-100干粉经蒸馏水室温充 分溶胀48h，或沸水浴中煮沸2h，冷却至 室温后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。
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二、装柱
关闭出口，向柱内加入洗脱液约1cm高， 将浓浆状的凝胶缓慢地倾入柱中，使之自然 沉降，凝胶沉降约1㎝高度后打开出水口， 继续加入凝胶浆，直到凝胶沉积至一定高度 即可。装柱要求连续，均与，无气泡，无 “纹路”。