凝胶层析法分离纯化蛋白质
葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
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凝胶层析的实际操作
4、上样 上样体积不大于6%柱床体积,上样浓度控制再35mg / ml~50 mg / ml, 以不大于12cm / h线性流速上样。
5、洗脱 用0.05mol / L NaCl-5mmol / L PB溶液,以不大于12cm / h线性流速洗脱
凝胶层析的操作注意事项
1、盐析过程盐溶液加少,盐析程度不够;盐溶液加多,盐 浓度过高有可能会导致蛋白变性; 2、蛋白的上样浓度不宜过高(70 mg / ml GE公司凝胶手册 数据 ),否则样品粘稠影响分离效果; 3、样品必须是均匀的溶液体系,没有颗粒,否则容易造成 柱子阻塞;
凝胶柱层析 分离纯化蛋白质
学习目的
了解:层析技术的基本原理;
有效分配系数Kav的计算。
理解:凝胶的选择和准备。 掌握:凝胶层析的原理和操作方法;
有效分配系数Kav的意义。
重点:
1、凝胶层析的原理和实际操作步骤。
2、分配系数与被分离分子量之间的关系。
蛋白质的分离纯化
蛋白质分离纯化的方法很多,主要是根据蛋白分子之间 特异性的差异,如分子大小,溶解度,电荷等建立起来的。
凝胶层析的基本原理
凝胶层析(又叫分子筛层析或排阻层析) 指混合物随流动相经过装有凝胶作为固 定相的层析柱时,各组分因分子大小不 同而被分离的技术。
凝胶:一些具有立体网状结构 和一定孔径的高分子化合物。
分子大于凝胶孔隙范围的物质: 随着溶剂在凝胶颗粒间流动
分子小于凝胶孔隙范围的物质: 渗入凝胶颗粒的孔隙中
型号:S-100,S-200,S-300,S-400等
Sephacryl的常见规格(分级范围)
预装柱
车间现有规格 1000~100000
凝胶层析的实际操作
凝胶层析法分离纯化蛋白质
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了解凝胶层析分基本原理,学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
三、试剂和材料
1)载体:葡聚糖凝胶G-50 2)样品液:
含蓝色葡聚糖2000[相对分子质量在200万以上,蓝色], 红色水溶性百里香酚蓝[分子质量488.60,红色]
3)洗脱液: 50mmol/L pH3.0 磷酸缓冲液。
(每组200ml。溶液配方:磷酸氢二钠:1.754g;磷酸二氢钠: 0.796g;NaCl:1.752g,用水定容至200ml。配制完成后用盐酸调pH 值为3.0)
凝胶过滤层析原理示意图
一、目的 二、原理
1)凝胶层析是基于分子大小不同而进行分离的一种分离方 法。 2)将一定量的含有不同大小分子的混合原料加在柱上并用 流动相洗脱,则无法进入多孔凝胶颗粒内部的大分子会直接随 流动相由凝胶颗粒之间的空隙被洗脱下来; 3)小分子因可深入凝胶颗粒内部而受到很大的阻滞,最晚 洗脱下来; 4)中等大小的分子虽可进入凝胶颗粒内部但并不深入,受 到凝胶颗粒的阻滞作用不强,因而在两者之间被洗脱下来。
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实验步骤
五、收集: 1、用试管进行样品的收集,每管1ml。
2、注意观察层析柱内分离现象,并观察收集管内颜色深浅, 以—、+、++等记号记录两种物质洗脱液的颜色。或者用400nm, 550nm测其OD值
六、凝胶柱的处理: 1、凝胶柱用过后,反复用蒸馏水(2~3倍床体积)通过柱即可。
2、如果凝胶有颜色或比较脏,需用0.5 mol/L 的NaOH-0.5 mol/L NaБайду номын сангаасl洗涤,再用蒸馏水洗。
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实验步骤
三、平衡: 1、将洗脱液与恒流泵相连,用2倍床体积的洗脱液平衡,平衡 完成后,检测流出液的pH值是否为3.0。 四、加样和洗脱: 1、将柱中多余的液体放出,使液面刚好盖过凝胶,关闭出口。 2、将400ul的样品沿层析柱管壁小心加入,加完后,在打开底 端出口。 3、用少量洗脱液清洗柱内壁2次,加洗脱液至液层4cm左右, 按上恒流泵,开始洗脱。
根据分子大小分离蛋白质的方法
![根据分子大小分离蛋白质的方法](https://img.taocdn.com/s3/m/5c0774603a3567ec102de2bd960590c69ec3d8db.png)
根据分子大小分离蛋白质的方法蛋白质是生命体中非常重要的分子,它们在细胞的结构和功能中起着关键作用。
为了研究蛋白质的特性和功能,科学家们经常需要对蛋白质进行分离和纯化。
分离蛋白质的一个重要方法是根据蛋白质的分子大小进行分离。
本文将介绍几种常用的根据分子大小分离蛋白质的方法。
一、凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法是一种基于分子大小的常用分离技术。
其原理是利用孔径大小不同的凝胶材料,将大分子蛋白质滞留在凝胶中,而小分子溶质可以顺利通过凝胶。
常用的凝胶材料有琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶等。
根据需要选择不同的凝胶孔径,可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术。
它利用电场作用将蛋白质分子按照大小进行分离。
在聚丙烯酰胺凝胶中,较大的蛋白质分子迁移速度较慢,而较小的蛋白质分子迁移速度较快。
通过调整电场强度和时间,可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
三、尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的变性凝胶电泳方法。
尿素是一种强变性剂,可以使蛋白质分子解离成单体,并且具有较好的可溶性。
在尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳中,蛋白质分子的迁移速度主要取决于它们的电荷和分子大小。
通过调整电场强度和时间,可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
四、尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱是一种利用固定相孔径大小进行分离的色谱技术。
在尺寸排阻色谱中,较大的蛋白质分子无法进入固定相孔径,因此会以较快的速度从色谱柱中洗脱,而较小的蛋白质分子则会在固定相中发生多次扩散,从而保留更长的时间。
通过调整固定相的孔径,可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
五、离心过滤法离心过滤法是一种简便快速的蛋白质分离方法。
它利用离心力将大分子蛋白质沉淀在滤膜上,而小分子蛋白质则通过滤膜被洗脱出来。
通过选择不同孔径的滤膜,可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
根据分子大小分离蛋白质的方法有凝胶过滤层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳、尺寸排阻色谱和离心过滤法等。
分离纯化蛋白质的方法
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分离纯化蛋白质的方法蛋白质是生命体内最基本的分子,它们参与了生命体内的许多重要生物学过程,如代谢、信号转导、免疫防御等。
因此,对蛋白质的研究具有重要的科学意义。
但是,蛋白质在生物体内的含量很少,且与其他成分相混合,因此需要通过分离纯化的方法来获取纯净的蛋白质样品。
本文将介绍几种常用的分离纯化蛋白质的方法。
1. 溶液层析法溶液层析法是一种常用的蛋白质分离纯化方法。
它基于蛋白质在不同的化学性质和结构特征下在固定相中的不同亲和力,通过不同的溶液组成、pH值、离子强度等条件来分离纯化蛋白质。
溶液层析法的操作简单、效果好,可以分离出高纯度的蛋白质。
但是,它需要对分离材料的性质和蛋白质的性质有深入的了解,以便选择合适的分离条件。
此外,溶液层析法需要大量的分离材料和实验室设备,成本较高。
2. 凝胶层析法凝胶层析法是一种基于蛋白质分子大小、形状和电荷等性质的分离纯化方法。
它利用凝胶作为分离材料,通过分子筛效应、凝胶孔道大小和分子电荷等因素来分离不同大小和电荷的蛋白质。
凝胶层析法具有操作简单、分离效果好、成本低等优点。
但是,它需要长时间的分离过程,而且凝胶的孔径大小和材料的性质会影响分离效果。
此外,凝胶层析法只能分离相对较小的蛋白质,对大分子蛋白质的分离效果较差。
3. 电泳法电泳法是一种通过电场作用将不同电荷的蛋白质分离的方法。
它利用电泳移动速度与蛋白质质量和电荷密度之间的关系,将蛋白质分离纯化。
电泳法具有操作简单、分离效果好、成本低等优点。
但是,它需要专业的电泳设备和实验技能,而且对蛋白质的性质和电泳条件有较高的要求。
此外,电泳法只能分离相对较小的蛋白质,对大分子蛋白质的分离效果较差。
4. 亲和层析法亲和层析法是一种基于蛋白质与其配体之间的亲和作用来分离纯化蛋白质的方法。
它利用配体与蛋白质的特异性结合来分离纯化目标蛋白质。
亲和层析法具有分离效果好、选择性高、可重复使用等优点。
但是,它需要高纯度的配体和专业的实验技能,而且对蛋白质的性质和配体的选择有较高的要求。
实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质
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层析柱的重要参数 :
Vt(total volume) Vo(outer volume) Vi(inner volume) Ve(elution volume) Vg(gel volume) Vt=Vo+Vi+Vg , Ve=Vo+Kd×Vi。
组分的洗脱体积(Ve):①当样品的 体积很少时(与洗脱体积比较可以忽 略不计) ,在洗脱图中,从加样到峰 顶位置所用洗脱液体积为Ve。 ②当 样品体积与洗脱体积比较不能忽略时, 洗脱体积计算可以从样品体积的一半 到峰顶位置。③当样品体积很大时, 洗脱体积计算可以从应用样品开始到 洗脱峰升高的弯曲点(或半高处)。
常用0.02%叠氮钠或20%乙醇溶液作防腐剂。 1 厘 米 光 程 时 , 254nm 处 透 光 率 为 60 % ,
280nm处透光率为100%。
3、试剂、器材:
3.1、层析介质 Sephadex G-50; 3.2、样品(包含三个组分): ①蓝色葡聚糖2000, ②溶菌酶,③ Trp
上样量:0.4ml/柱。 3.3、洗脱液:0.15M氯化钠,即生理盐 水。
、洗脱液流速的影响:
洗脱液的流速与样品分离的分辨率相关。 流速过快,会使色谱峰变形, 流速过慢,样品扩散倾向加剧。 一般流速控制在30-200ml/h。
今天洗脱流速控制在1ml/min。
、洗脱液的离子强度和pH值的影响:
纯化蛋白时,通常选用离子强度>0.02的盐 溶液作洗脱剂,以增加样品的溶解度和 消除凝胶的吸附作用;
Kd是分配系数:用于衡量两个物质的分离分辩率, 是凝胶层析的一个特征常数,只与被分离物质 分子大小和凝胶孔径大小有关,与层析柱的长 短粗细无关。
Kd值的计算:Kd=(Ve-Vo)/Vi
蛋白质的分离纯化方法
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蛋白质的分离纯化方法蛋白质是细胞中的重要生物大分子,具有多样的结构和功能。
为了研究蛋白质的性质和功能,需要将蛋白质从混合样品中分离纯化出来。
蛋白质的分离纯化方法有很多种,主要包括离心法、电泳法、层析法和亲和纯化法等。
下面将逐一介绍这些方法及其原理。
1. 离心法离心法是利用离心机将混合物中的蛋白质分离出来。
首先将细胞裂解,得到细胞裂解液,然后进行离心,以将细胞器、胞外物质和亲粒子(如蛋白质颗粒)分离。
离心可以根据不同物质的相对密度和大小进行分层分离,快速旋转离心机可以很好地分离出不同密度的颗粒。
2. 电泳法电泳法是将带电的蛋白质沿着电场移动,根据蛋白质的带电性质和大小分离的方法。
蛋白质可以根据电荷性质分为阴离子蛋白和阳离子蛋白,也可以根据亲水性质分为亲水性蛋白和疏水性蛋白。
电泳法常用的有SDS-PAGE、等电聚焦电泳等。
其中,SDS-PAGE可以根据蛋白质的分子量进行分离。
3. 层析法层析法是通过蛋白质与载体之间的亲和性或者分离介质之间的亲和性进行分离的方法。
层析法主要分为凝胶层析、离子交换层析、亲合层析和大小排阻层析等。
凝胶层析法是利用凝胶的网格结构来分离蛋白质,如凝胶过滤层析、凝胶过渡层析等。
离子交换层析法是利用蛋白质对离子交换树脂的吸附性质进行分离。
亲合层析法是通过亲和柱中的配体与蛋白质的亲和作用进行分离。
大小排阻层析法是根据蛋白质的分子量和形状进行分离。
4. 亲和纯化法亲和纯化法是利用特定的亲合剂与目标蛋白质之间的特异性亲和性进行分离纯化的方法。
亲和纯化主要包括亲和柱层析法、浸没纯化法、亲和剂电泳法等。
亲和柱层析法是将具有亲和填料的柱子与样品接触,通过洗脱再生的操作,将目标蛋白质从其他组分中分离纯化出来。
浸没纯化法是将特定亲合剂浸泡在蛋白质混合物中,使其与目标蛋白质发生亲和结合,然后以特定条件洗脱目标蛋白质。
亲和剂电泳法是负载亲和剂的凝胶片上进行电泳,使蛋白质与亲和剂结合,再通过电泳将其分离纯化出来。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
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【实验器材】
层析柱 恒流泵 紫外检测仪 部分收集器 试管等普通玻璃器皿
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
【实验试剂】
待分离样品 葡聚糖凝胶 Sephadex G-100 洗脱液:0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液
凝胶层析法分离纯化蛋白质
【原理】 凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用, 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离的技术。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶过滤层析
凝胶层析是按照蛋 白质分子量大小进行分 离的技术,又称之凝胶 过滤、分子筛层析或排 阻层析。
单个凝胶珠本身象 “筛子”。不同类型凝 胶的筛孔的大小不同。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔,可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔,在向下移动过程中,因此流程 较长,移动速率慢;所以最后流出。
中等大小的分子,它们在凝胶颗粒内外部分渗透,渗透的 程度取决于它们分子的大小,所以它们流出的时间介于二 者之间,这样分子大的组分先流出,分子小的组分后流出。 这样样品经过凝胶层析后,各个组分便按分子从大到小的 顺序依次流出,从而达到了分离的目的。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
带网入珠 内,经珠 之间缝隙 流出
凝胶过凝滤胶层层析法分析离纯过化蛋程白质 示意图
凝胶 凝胶基质 珠
小分子 大分子
凝胶过滤凝胶层层析法析分离过纯化程蛋白质示意图
总结:
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 阻在孔外,只能在凝胶颗粒外的空间向下流动,因此流程 较短,移动速度快;所以首先流出。
凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程
![凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程](https://img.taocdn.com/s3/m/0d56b3c8bb0d4a7302768e9951e79b89680268a8.png)
凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程引言:蛋白纯化是研究蛋白质结构和功能的关键步骤之一。
凝胶过滤层析是一种常用的蛋白纯化方法,通过分子大小的差异来分离和纯化目标蛋白。
本文将介绍凝胶过滤层析的流程及其应用。
一、凝胶过滤层析的原理凝胶过滤层析是基于分子大小的差异来分离蛋白的一种方法。
该方法利用特定的凝胶材料,通过将待纯化的蛋白溶液加入凝胶柱中,较大分子的蛋白无法渗透进入凝胶内部,而较小分子的蛋白则可以通过凝胶孔道进入凝胶内部。
通过这种方式,可以实现对蛋白的分离和纯化。
二、凝胶过滤层析的步骤1. 准备凝胶柱:选择适当的凝胶材料和柱子,根据待纯化蛋白的分子大小选择合适的孔径。
2. 杂质去除:使用缓冲液预先洗脱凝胶,去除其中的杂质和阻塞物。
3. 样品加载:将待纯化的蛋白溶液加载到凝胶柱中,注意保持柱子的垂直姿势,防止样品泄漏。
4. 洗脱:使用缓冲液进行洗脱,以去除非目标蛋白和杂质。
5. 收集纯化蛋白:将目标蛋白收集,可以使用分级洗脱或直接洗脱的方法。
三、凝胶过滤层析的优势和应用凝胶过滤层析具有以下优势:1. 无需特殊设备:相较于其他蛋白纯化方法,凝胶过滤层析不需要昂贵的设备,操作简单方便。
2. 高分辨率:凝胶过滤层析可以实现对不同分子大小的蛋白进行高效分离,得到高纯度的目标蛋白。
3. 适用范围广:凝胶过滤层析适用于各种类型的蛋白,包括酶、抗体、细胞因子等。
凝胶过滤层析在生物学研究中有广泛的应用,主要包括以下方面:1. 蛋白纯化:凝胶过滤层析是常用的蛋白纯化方法之一,可以用于从复杂的混合物中纯化目标蛋白。
2. 质量控制:凝胶过滤层析可以用于检测蛋白样品的分子大小和纯度,对蛋白质的质量进行评估。
3. 蛋白互作研究:凝胶过滤层析可以用于研究蛋白与其他分子(如核酸或小分子化合物)的相互作用。
4. 蛋白结构分析:凝胶过滤层析可以为蛋白的结构分析提供高纯度的样品。
结论:凝胶过滤层析是一种简单、快速且高效的蛋白纯化方法,通过分子大小的差异实现对目标蛋白的分离和纯化。
凝胶层析法分离蛋白质实验报告
![凝胶层析法分离蛋白质实验报告](https://img.taocdn.com/s3/m/cd147a6bcec789eb172ded630b1c59eef8c79a07.png)
凝胶层析法分离蛋白质实验报告凝胶层析法分离蛋白质实验报告一、实验目的本实验旨在通过凝胶层析法分离蛋白质,掌握凝胶层析法的基本原理和方法,了解凝胶层析在蛋白质分离中的应用。
二、实验原理凝胶层析法是一种基于分子大小不同的分离技术。
它利用凝胶颗粒的孔径大小,将不同大小的分子进行分离。
当蛋白质溶液通过装有凝胶颗粒的层析柱时,不同大小的蛋白质分子会根据其大小分别进入凝胶颗粒的不同孔径,从而实现在一个连续的流洗过程中将不同大小的蛋白质分离开来。
三、实验步骤1.准备实验材料:凝胶颗粒(如Sephadex G-25或G-75)、层析柱、蛋白质样品(如牛血清白蛋白)、缓冲液等。
2.将凝胶颗粒装入层析柱中,注意不要压实,保持颗粒松散。
3.加入缓冲液,使凝胶颗粒充分膨胀。
4.将蛋白质样品加入到层析柱中,注意不要加太多,以免影响分离效果。
5.打开流出口,使缓冲液缓慢流过层析柱,收集流出的溶液。
6.记录每管收集的溶液体积和蛋白质含量,绘制洗脱曲线。
7.收集分离后的蛋白质。
四、实验结果与分析1.洗脱曲线的绘制与分析实验中,随着缓冲液的流过,不同大小的蛋白质分子会依次被洗脱出来。
通过观察每管收集的溶液体积和蛋白质含量,我们可以绘制出洗脱曲线。
洗脱曲线显示了不同大小的蛋白质分子被洗脱出来的时间和顺序。
通过洗脱曲线,我们可以分析不同蛋白质分子的性质和大小。
2.分离效果评估通过比较实验前后的蛋白质样品,我们可以评估凝胶层析法的分离效果。
在凝胶层析法中,不同大小的蛋白质分子被分离出来,从而可以得到多个不同的蛋白质组分。
通过观察每个组分的蛋白质含量和性质,我们可以评估凝胶层析法的分离效果。
五、结论本实验通过凝胶层析法成功地分离了蛋白质样品中的不同组分。
实验结果表明,凝胶层析法是一种有效的蛋白质分离方法。
通过调整凝胶颗粒的孔径大小和缓冲液的成分,可以进一步优化分离效果。
在生物化学、生物工程和生物医药等领域,凝胶层析法被广泛应用于蛋白质和其他生物分子的分离和纯化。
分离纯化蛋白质的方法及原理
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分离纯化蛋白质的方法及原理本页仅作为文档封面,使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March分离纯化蛋白质的方法及原理(一)利用分子大小1、透析:原理:利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质,使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。
方法:将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行涉及的问题:如何加快透析过程(1)加大浓度差,及时更换透析液(2)利用磁力搅拌器常用的半透膜:玻璃纸、火棉和其他材料合成2、超过滤:原理:利用压力和离心力,强行使其他小分子和水通过半透膜,而蛋白质留在膜上3、凝胶过滤层析:原理:当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时,比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构,排阻在凝胶珠以外,在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。
而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内,这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。
结果:大分子先被洗脱下来,小分子后被洗脱下来(二)利用溶解度差别4、等电点沉淀:原理:不同蛋白质具有不同的等电点,当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时,这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。
5、盐析与盐溶:原理:低浓度时,中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加,足够高时,例如饱和或半饱和程度,很多蛋白质可以从水中沉淀出来,这种现象称为盐析(三)根据电荷不同6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳原理:通过加热和SDS可以使蛋白质变性,多亚基的蛋白质也解离为单亚基,处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的,分离的状态。
电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而主要取决于蛋白质分子量。
所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。
7、离子交换层析:原理:氨基酸分离常用阳离子交换树脂,树脂被处理成钠型,将混合氨基酸上柱,氨基酸主要以阳离子形式存在,在树脂上与钠离子发生交换,而被挂在树脂上。
凝胶过滤法分离蛋白质实验报告
![凝胶过滤法分离蛋白质实验报告](https://img.taocdn.com/s3/m/c4b52f724b73f242326c5f27.png)
凝胶过滤法分离蛋白质一、实验目的了解凝胶层析的基本原理,并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
二、实验原理凝胶过滤其基本原理是利用被分离的分子大小不同及固定相(凝胶)具有分子筛的特点:本实验使用交联葡聚凝胶,其具有一定孔径的网络结构。
高亲水,在水溶液里吸水可膨胀。
当其填充完成后,加入混合分子大小不同的分离液。
由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动,所经路短,最先流出;而涌入胶粒内部的小分子物质,受迷宫效应的影响,要经过层层扩散向下流动,所经路程长,最后流出,通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。
从而按大到小的顺序流出实现分离的目的。
三、试剂与仪器0.1mol/L磷酸缓冲液(PH7.0),0.4%K3Fe(CN)6,交联葡聚凝胶,鸡的抗凝全血1.5*20cm的层析柱,试管,量筒,大烧杯,玻璃棒四、实验步骤1.凝胶溶胀2.装柱:从层析柱加入缓冲液,打开出口,将气泡赶走,关闭下端开口,然后加入约6cm的缓冲液,灌注凝胶,打开下端开口。
使其自然沉降高度约17cm,并使其床面覆盖缓冲液,关闭出口盖上小形圆形滤纸。
待凝胶形成后,再用缓冲液洗脱2~3次。
3.样品处理4.上样和过滤:吸取约0.5ml混合液,在距离床面1mm处沿管内壁轻轻加入样品。
打开出口,让样品溶液慢慢浸入凝胶内。
凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲液,并用1~2倍体积的此缓冲洗脱。
5.部分收集:控制速度为0.5ml/min左右,用试管收集洗脱液。
并观察柱上的色带,待黄色的0.4%完全脱下来后,再继续收集两管透明洗脱液作对照,关闭出口。
6.凝胶回收:收集样品后,凝胶柱用3~5倍体积洗脱液继续洗脱,从回收凝胶留给下一组。
五、实验现象结果及其讨论颜色:开始时为无色透明,但时间过去,试管中收集的红褐色开始变深,到最后,试管的颜色为深褐色,接着溶液的颜色开始变浅,红褐色几乎要消失。
接着又开始出现浅黄色,再到黄色,再黄色开始慢慢变浅,最后又变成无色透明。
原因:1.开始时,由于先加进缓冲液,而加入的全血扩散没有那么快,所以白色透明液体为缓冲液。
凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理
![凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理](https://img.taocdn.com/s3/m/26d0f659fe00bed5b9f3f90f76c66137ee064f1f.png)
凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理一、凝胶过滤层析的概念和原理凝胶过滤层析是一种常用的生物化学分离技术,主要用于蛋白质的精细纯化和分离。
其原理是利用凝胶颗粒的孔隙结构,根据蛋白质的大小和形状差异,使不同分子量和形状的蛋白质在凝胶颗粒的孔隙中发生不同程度的阻滞和流动,从而实现蛋白质的分离和纯化。
二、凝胶过滤层析的操作步骤1. 样品加载:将待纯化的蛋白样品均匀地加载到预先平衡的凝胶柱或凝胶板上。
2. 洗脱:用缓冲液通过凝胶柱,洗去未结合的蛋白和其他杂质。
3. 洗脱物收集:收集洗脱液中的目标蛋白。
4. 分析和检测:对收集的蛋白样品进行分析和检测。
三、凝胶过滤层析的优点和适用范围1. 分辨率高:凝胶过滤层析能够分离不同分子量的蛋白,分辨率较高。
2. 操作简单:操作过程不需要高昂的设备和特殊技能,相对容易进行。
3. 适用范围广:适用于各种不同分子量和性质的蛋白质的纯化和分离。
四、对凝胶过滤层析的个人理解和观点凝胶过滤层析作为一种生物化学分离技术,在蛋白质纯化领域有着广泛的应用。
它的原理简单易懂,操作相对容易,且适用范围广,因此备受科研人员的青睐。
在生物制药和基因工程等领域,凝胶过滤层析也发挥着重要的作用,为蛋白质的纯化和分离提供了有效的技术手段。
总结:凝胶过滤层析作为一种重要的蛋白质纯化技术,具有分辨率高、操作简单、适用范围广等优点。
通过对凝胶过滤层析的深入理解和掌握,能够为生物化学研究和生物制药领域的发展提供有力支持。
通过本文的深度探讨,相信您对凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理有了更深入的了解。
希望本文能够帮助您更全面、深刻和灵活地理解这一主题。
凝胶过滤层析属于分子量分馏技术,是一种物理性质分离方法。
它基于蛋白质在凝胶柱内孔隙中的迁移速度的差异,可以将混合物中的不同分子量的蛋白质分离开来。
对于高分子量的蛋白质来说,凝胶柱内的孔隙会成为一个障碍,从而使它们在柱内停留的时间更长,而低分子量的蛋白质会更容易通过孔隙,因此在经过相同时间的洗脱后,不同分子量的蛋白质就可以被有效地分离开来。
四种蛋白纯化的有效方法
![四种蛋白纯化的有效方法](https://img.taocdn.com/s3/m/e8d48be1294ac850ad02de80d4d8d15abe230002.png)
四种蛋白纯化的有效方法四种蛋白纯化的有效方法在进行蛋白质研究和酶工程等领域的实验过程中,常常需要将目标蛋白从复杂的混合物中纯化出来。
蛋白纯化的目的是获取高纯度的目标蛋白样品,以便进一步进行结构和功能研究。
然而,由于蛋白质的复杂性以及其在混合物中的低浓度,蛋白纯化常常面临一系列的挑战。
为了克服这些挑战,科学家们开发了多种蛋白纯化的方法。
在本文中,我们将介绍四种常见而高效的蛋白纯化方法,并探讨其原理和适用性。
1. 亲和层析法:亲和层析法是一种利用目标蛋白与配体之间的特异性结合进行纯化的方法。
这种方法基于目标蛋白与配体之间的亲和力,通过设计具有高亲和性的配体来选择性地结合目标蛋白。
在实验中,我们可以将配体固定于固相材料上,例如琼脂糖或石蜡烃树脂,并将载有目标蛋白的混合物与这些固定化的亲和基质进行接触。
随后,非特异性蛋白质被洗脱,而目标蛋白则被保留下来。
目标蛋白可以通过改变条件(例如改变pH值或添加竞争性配体)来洗脱。
亲和层析法的优点在于具有高选择性和高纯度的优势。
然而,由于亲和剂的设计和合成需要具有相关专业知识,并且选择适当的配体是关键。
亲和层析法在不同的纯化过程中的适用性会有所不同。
2. 凝胶过滤层析法(Gel Filtration Chromatography):凝胶过滤层析法是通过分子量的差异将混合物中的蛋白质分离的一种方法。
凝胶过滤层析法是利用凝胶材料,例如琼脂糖或琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶,通过分子在凝胶孔隙中的渗透性而将蛋白分离开来。
较大的蛋白分子无法进入凝胶孔隙,因此会在凝胶的表面留下。
较小的蛋白分子则能够渗透进入凝胶孔隙中,因此会相对于较大的蛋白分子更早地溢出。
凝胶过滤层析法的优点在于操作简单、速度快,且可以对蛋白进行某种程度的分离。
然而,该方法的分离效果受到蛋白质在凝胶中的体积效应的限制,因此对于体积较大的蛋白分子,凝胶过滤层析可能无法实现理想的分离效果。
3. 离子交换层析法:离子交换层析法是一种基于蛋白与离子交换材料之间的电荷相互作用进行纯化的方法。
“凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质”生化实验报告
![“凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质”生化实验报告](https://img.taocdn.com/s3/m/318e4b125e0e7cd184254b35eefdc8d376ee14f5.png)
凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质操作人:XXX 时间:XXXX 地点:XXXX 温度:20℃实验目的:①理解凝胶过滤层析的原理。
②掌握装柱、平衡、上样、柱效检验的方法。
③学会分析洗脱峰峰型。
试验方法与过程:1.装柱①固定层析柱,柱内装1/2双蒸水,双蒸水下降到1/4时,关闭出口。
②搅拌凝胶浆液,用玻璃棒引流缓慢倒入层析柱,打开出口,让凝胶沉降。
③装至柱内有2/3凝胶,上层保留至少0.5cm的水。
2.平衡双蒸水平衡柱,管口上接恒流泵、下管接检测仪入口,控制流速。
观察紫外检测仪平衡后A280应小于0.01.然后调整流速为2ml/min,暂停恒流泵。
3.加样吸取5%丙酮溶液500ul,沿柱壁缓慢加入,控制出水口管的高度使使样品缓缓进入胶内,用1ml双蒸水冲洗壁上的样品,在加入3-4ml双蒸水后关闭盖子。
4.洗脱凝集打开恒流泵开关,监视紫外检测仪的情况,待丙酮全部流出后加入,加入蛋白质混合物,监视紫外检测仪情况,开始出现上升即开始收集流出液。
蛋白质样品全部流出后,用双蒸水冲洗凝胶。
原始数据:图一:从左到右第一个峰为丙酮,第二第三个峰分别为混合物中的两种蛋白质。
结果处理与分析:①根据图像得As略大于1,说明装柱压力不足,可能滤网内有空气进入。
②由于是先加入丙酮再打开色谱分析软件,所以不能分析到分配系数Kd。
③在图一黑色箭头所指处色谱曲线出现了抖动,可能是因为在丙酮洗脱过程中打开了层析柱上口,导致空气进入。
④加入样品后出现两个峰,说明混合样品中有两种大小不同的物质被分离出来。
讨论:1.注意事项:一定要保证凝胶柱上层有液体覆盖,不能使之暴露于空气中;保证所灌凝胶中没有气泡,当有气泡和凝胶有明显分层时3,应在灌胶过程中及时用玻璃棒搅拌去除气泡及使不均匀的凝胶重悬后重新沉淀。
2.经验和心得:用滴管向凝胶柱内加入双蒸水和样品时,一定要沿管壁边旋转边缓慢加入,防止加入时产生压力太大,使凝胶柱上表面不平整;用滴管比用移液枪加样品好,因为滴管产生的压力小。
分离纯化蛋白质的方法
![分离纯化蛋白质的方法](https://img.taocdn.com/s3/m/4645b971814d2b160b4e767f5acfa1c7aa0082ca.png)
分离纯化蛋白质的方法分离纯化蛋白质是生物学研究中的重要一环。
蛋白质是生命活动的基础,它们参与了许多生化反应和细胞功能的调节。
因此,研究蛋白质的结构和功能对于理解生命活动的本质具有重要的意义。
然而,蛋白质的分离纯化是一项复杂的工作,需要利用不同的方法和技术。
本文将介绍一些常用的方法和技术,以帮助读者更好地理解蛋白质的分离纯化过程。
一、离心法离心法是最常用的分离蛋白质的方法之一。
它利用不同蛋白质的沉降速度差异,将混合物中的蛋白质分离开来。
离心法可以分为低速离心和高速离心两种方式。
低速离心的转速通常在500-5000 rpm之间,可以用来分离细胞器和细胞碎片。
高速离心的转速通常在20000-40000 rpm之间,可以用来分离蛋白质和病毒颗粒等微小颗粒。
二、凝胶过滤法凝胶过滤法是一种按分子量大小分离蛋白质的方法。
它利用凝胶的孔隙大小将蛋白质分离开来。
分子量大的蛋白质无法进入凝胶的孔隙,只能在凝胶表面停留,而分子量小的蛋白质可以进入凝胶的孔隙中,被分离出来。
凝胶过滤法常用于分离分子量相近的蛋白质。
三、离子交换色谱法离子交换色谱法是一种利用蛋白质和离子交互作用分离的方法。
它利用带电离子交换树脂将混合物中的蛋白质分离出来。
蛋白质的带电性质与树脂表面的带电离子相互作用,从而实现分离。
离子交换色谱法常用于分离带正电荷或带负电荷的蛋白质。
四、亲和层析法亲和层析法是一种利用蛋白质与某种特定分子之间的亲和力分离的方法。
它利用固定在树脂表面的特定分子与混合物中的蛋白质发生亲和作用,从而分离出目标蛋白质。
亲和层析法常用于分离具有特定结构或功能的蛋白质。
五、透析法透析法是一种利用半透膜将混合物中的小分子物质和大分子物质分离的方法。
它利用半透膜的选择性通透性将小分子物质透过膜外,而将大分子物质留在膜内。
透析法常用于分离蛋白质和其他小分子物质。
六、电泳法电泳法是一种利用蛋白质的带电性质和电场作用进行分离的方法。
它将混合物中的蛋白质置于电场中,通过电泳移动的速度将蛋白质分离出来。
凝胶层析法分离蛋白质实验报告
![凝胶层析法分离蛋白质实验报告](https://img.taocdn.com/s3/m/843ec738591b6bd97f192279168884868662b857.png)
凝胶层析法分离蛋白质实验报告实验目的:通过凝胶层析法对不同分子量的蛋白质进行分离纯化,掌握凝胶层析的基本原理和操作方法,并熟悉蛋白质纯化过程中的注意事项和常见问题。
实验原理:凝胶层析法是一种蛋白质纯化方法,其基本原理是利用凝胶的三维结构和孔径大小对不同分子量的蛋白质进行分离纯化。
常用的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、硅胶凝胶等。
在实验中我们采用了聚丙烯酰胺凝胶,其孔径大小是可以控制的,所以利用不同孔径大小的凝胶对不同分子量的蛋白质进行分离。
通常,具有较大分子量的蛋白质被排除在凝胶顶端的孔径较小的区域,而具有较小分子量的蛋白质则可以渗透入较小孔径的凝胶中,因此存在于较深的凝胶层中。
实验步骤:1.准备干燥的聚丙烯酰胺凝胶片,并将其装入凝胶层析柱中。
2.通过密封顶部的小孔,加入显色剂和柠檬酸盐缓冲液制成试样,注意不要将试样直接滴入凝胶中。
3.将制备好的样品通过重力作用,缓慢流经凝胶柱,待所有样品渗透完毕后,收集洗脱出来的蛋白质。
4.将收集得到的蛋白质样品通过SDS-PAGE电泳分析其分子量和纯度。
实验结果:在本次实验中,我们以三种分子量不同的蛋白质作为样品,分别是Bovine Serum Albumin(分子量为66kDa)、Egg Albumin(分子量为44kDa)以及Cytochrome C(分子量为12.4kDa)。
结果显示,我们的分离纯化效果较好,三个分子量不同的蛋白质在凝胶中得到了良好的分离。
而通过SDS-PAGE电泳也证实了每个样品的分子量与预期相符,并且纯度较高。
1.凝胶层析柱和样品的pH值要一致,避免蛋白质发生脱变性。
2.样品加入凝胶层析柱后,立即加入缓冲液,避免样品直接流入凝胶中。
3.收集洗脱出来的蛋白质时要注意,不要将不同分子量的蛋白混杂在一起,否则会影响后续的分析结果。
本次实验还让我们掌握了SDS-PAGE电泳的原理和操作方法,并通过其分析了凝胶层析后的蛋白质纯度和分子量,这对我们的研究工作和生物科学的进一步探索起到了重要的作用。
实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐
![实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐](https://img.taocdn.com/s3/m/25842816777f5acfa1c7aa00b52acfc789eb9fbb.png)
学习凝胶过滤法分离纯化蛋白质的原 理与操作技术
【实验原理】
凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析或 凝胶过滤,是以凝胶为载体,根据蛋白质的 大小和形状,即蛋白质的相对分子质量进行 分离和纯化。
该方法广泛用于生物大分子的分离、纯 化、浓缩等。
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凝胶是一类具有多孔立体网状结构的不溶 性珠状颗粒。多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂 糖)类物质,用它来进行物质分离,主要是根据 多孔凝胶对不同相对分子质量的物质具有不同 的排阻效应实现的。
脱液(去离子水),将凝胶 浆液沿玻棒缓慢倾入柱中 (注满)。凝胶自然沉积约 1~2cm 高度后打开下端出 水口,待凝胶床面上升到约 3/4柱高停止。关闭出水口, 静置。
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2.洗柱 通过细乳胶管小心地将烧杯中的洗脱液与层
析柱接通,然后拧松螺旋夹,让洗脱液滴下冲洗 层析柱,以除杂质并使柱床均匀密实(此步也称 作平衡)。适当时间后(流下的洗脱液体积一般
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葡聚糖凝胶的商品名称为 Sephadex,它具有三维空实验用G-25使蛋白质与(NH4)2SO4分离,当 蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时,小分子的 (NH4)2SO4扩散进入G-25的网孔中,而大分子的 蛋白质因颗粒直径大,不能进入网孔中,被排阻 在凝胶颗粒的外面。加入洗脱液洗脱时,因大分 子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动, 首先被洗脱下来,而小分子的(NH4)2SO4可以扩散 进出凝胶颗粒的网孔之中,随洗脱液移动时受到 阻滞力较大,在层析柱中移动较慢,这样蛋白质 与(NH4)2SO4很容易地分离开,从而达到对蛋白质 样品脱盐的目的。
。
为柱床体积的2~3倍),再拧紧螺旋夹。 洗柱过程中注意调整流速约2ml/min。
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3.加样与洗脱
凝胶层析纯化蛋白的原理
![凝胶层析纯化蛋白的原理](https://img.taocdn.com/s3/m/49fb55955122aaea998fcc22bcd126fff7055dc5.png)
凝胶层析纯化蛋白的原理凝胶层析是一种常用的蛋白纯化方法,它基于蛋白质在凝胶中的分子大小差异而进行分离。
在凝胶层析中,蛋白质会根据其分子大小在凝胶中以不同的速率迁移,从而实现分离纯化的目的。
本文将介绍凝胶层析纯化蛋白的原理及其应用。
首先,凝胶层析的原理是基于蛋白质在凝胶中的分子大小差异而进行分离。
凝胶层析的凝胶通常是由聚丙烯酰胺或琼脂糖等材料制成,其孔隙大小可以根据需要进行调整。
当混合物中的蛋白质样品加载到凝胶柱或凝胶板上时,由于分子大小的不同,蛋白质会在凝胶中以不同的速率迁移。
大分子的蛋白质会在凝胶中迁移较慢,而小分子的蛋白质则会迁移较快。
通过这种方式,可以实现对蛋白质的分离和纯化。
其次,凝胶层析的原理还涉及到蛋白质在凝胶中的分配系数。
分配系数是指蛋白质在凝胶和流动相(如缓冲液)之间的分配比例。
根据蛋白质的分子大小和亲和性,可以调整凝胶的孔隙大小和流动相的成分,从而实现对蛋白质的精确分离。
这种方法不仅可以根据蛋白质的分子大小进行分离,还可以根据蛋白质的亲和性进行选择性分离,具有较高的分离效率和分辨率。
此外,凝胶层析还可以结合其他技术进行联合应用,如离子交换层析、亲和层析等,以实现更精确的蛋白质纯化。
通过这种联合应用,可以根据蛋白质的电荷性质、亲和性质等进行选择性分离,从而获得更纯净的蛋白质样品。
总之,凝胶层析是一种基于蛋白质分子大小差异进行分离的方法,其原理简单而有效。
通过调整凝胶的孔隙大小和流动相的成分,可以实现对蛋白质的精确分离和纯化。
此外,凝胶层析还可以与其他技术联合应用,以实现更精确的蛋白质纯化。
因此,凝胶层析在生物化学和生物技术领域具有广泛的应用前景,对于蛋白质的纯化和分析具有重要意义。
凝胶层析纯化蛋白的原理
![凝胶层析纯化蛋白的原理](https://img.taocdn.com/s3/m/46f550bd7d1cfad6195f312b3169a4517723e538.png)
凝胶层析纯化蛋白的原理凝胶层析是一种常用的蛋白质纯化方法,它基于蛋白质在凝胶柱中的分配行为进行分离和纯化。
这种方法适用于从复杂混合物中纯化蛋白质,并且可以根据蛋白质的分子大小、电荷、亲疏水性等特性进行选择性分离。
本文将介绍凝胶层析纯化蛋白的原理及其应用。
首先,凝胶层析的原理是基于蛋白质在凝胶柱中的分配行为。
凝胶柱是由交联聚丙烯酰胺或琼脂糖等材料制成,具有一定的孔隙结构。
当样品溶液通过凝胶柱时,不同大小、电荷和亲疏水性的蛋白质将以不同的速率通过柱体,并在柱体中产生不同的分离效应。
大分子蛋白质会在柱体表面被阻滞,小分子蛋白质则会进入柱体内部,从而实现了对蛋白质的分离。
其次,凝胶层析的原理还包括了分配系数的影响。
分配系数是指蛋白质在固定相和流动相之间的分配比例,它受到蛋白质分子大小、电荷、亲疏水性等因素的影响。
在凝胶柱中,蛋白质会根据其分配系数在固定相和流动相之间进行平衡分配,从而实现了蛋白质的分离和纯化。
最后,凝胶层析的原理还涉及了柱体的选择性。
不同类型的凝胶柱具有不同的孔隙大小和化学性质,因此可以选择性地分离不同特性的蛋白质。
例如,大小排阻柱适用于分离大分子蛋白质,离子交换柱适用于分离带电蛋白质,亲和层析柱适用于分离特定亲和键的蛋白质等。
通过合理选择凝胶柱,可以实现对特定类型蛋白质的高效分离和纯化。
总之,凝胶层析纯化蛋白的原理是基于蛋白质在凝胶柱中的分配行为、分配系数的影响以及柱体的选择性。
这种方法可以根据蛋白质的特性实现高效的分离和纯化,是一种重要的蛋白质分离技术。
在实际应用中,可以根据样品的特性选择合适的凝胶柱,优化分离条件,从而实现对目标蛋白的高效纯化。
希望本文的介绍对您了解凝胶层析纯化蛋白的原理有所帮助。
凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质
![凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质](https://img.taocdn.com/s3/m/93638efa250c844769eae009581b6bd97f19bc61.png)
凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质实验六凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。
2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤,是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中,然后用缓冲液洗脱。
大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中,只留在凝胶颗粒之间的流动相中,因此以较快的速度首先流出层析柱,而小分子则能自由出入凝胶颗粒中,并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡,因此就要花费较长的时间流经柱床,从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致,且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外,而对某些小分子化合物则不能排阻,但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav(被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系)表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积(Vt)、外水体积(Vo)及分离物本身的洗脱体积(Ve)有关,即:Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 在限定的层析条件下,Vt和Vo都是恒定值,而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大,Kav值小;反之,则Kav值增大。
Ve(洗脱体积)为某一成分从加入样品算起,到组分的最大浓度(峰)出现时所流出的体积。
Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。
一般相对分子质量较小的溶质,它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。
该物质分子量大(为200万),呈蓝色,它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻,并可借助其本身颜色,采用肉眼或分光光度仪检测(210nm或260nm或620nm)洗脱体积(即Vo)。
但是,在测定激酶等蛋白质的分子量时,不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积,因为它对激酶有吸附作用,所以有时用巨球蛋白代替。
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【操作方法】
一、凝胶的处理
Sephadex G-100干粉经蒸馏水室温充 分溶胀48h,或沸水浴中煮沸2h,冷却至 室温后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。
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二、装柱
关闭出口,向柱内加入洗脱液约1cm高, 将浓浆状的凝胶缓慢地倾入柱中,使之自然 沉降,凝胶沉降约1㎝高度后打开出水口, 继续加入凝胶浆,直到凝胶沉积至一定高度 即可。装柱要求连续,均与,无气泡,无 “纹路”。
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五、收集与测定
用部分收集器收集洗脱液。紫外检测仪 280nm处检测,将检测信号输入色谱工作站 系统,绘制洗脱曲线。
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六、凝胶柱的处理
凝胶用过后,反复用蒸馏水通过柱 (2~3倍床体积)即可。
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注意事项
• 各接头不能漏气,连续用的小乳胶管不要有破损, 否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应 无液体,并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产 生,则表示恒压瓶不漏气。操作过程中,层析柱 内液面不断下降,则表示整个系统有漏气之处, 应仔细检查并加以纠正。
单个凝胶珠本身象 “筛子”。不同类型凝 胶的筛孔的大小不同。
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带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内,经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层可编析辑pp过t 程示意图
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凝胶 凝胶基质 珠
小分子 大分子
凝胶过滤层可析编辑过ppt 程示意图
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总结:
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 阻在孔外,只能在凝胶颗粒外的空间向下流动,因此流程 较短,移动速度快;所以首先流出。
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三、平衡
将洗脱液与恒流泵相连,恒流泵出口端与 层析柱入口相连,用2~3倍柱床体积的洗脱 液平衡,流速为0.5ml/min。
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四、加样与洗脱
将柱中多余的液体放掉出,使液面刚好 盖过凝胶,关闭出口,将1ml样品沿层析柱 管壁小心加入,加完后打开底端出口,使液 面降至与凝胶面相平时关闭出口,加洗脱液 至液层4cm左右,接上恒流泵,开始洗脱 ( 0.5ml/min)。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔,可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔,在向下移动过程中,因此流程 较长,移动速率慢;所以最后流出。
中等大小的分子,它们在凝胶颗粒内外部分渗透,渗透的
程度取决于它们分子的大小,所以它们流出的时间介于二
者之间,这样分子大的组分先流出,分子小的组分后流出。
这样样品经过凝胶层析后,各个组分便按分子从大到小的
顺序依次流出,从而达到了分离的目的。
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【实验器材】
层析柱 恒流泵 紫外检测仪 部分收集器 试管等普通玻璃器皿
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【实验试剂】
待分离样品 葡聚糖凝胶 Sephadex G-100 洗脱液:0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液
凝胶层析法分离纯化蛋白质
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【目的】
掌握凝胶层析的基本原理
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【原理】
凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。 是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用, 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离的技术。
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凝胶过滤层析
凝胶层析是按照蛋 白质分子量大小进行分 离的技术,又称之凝胶 过滤、分子筛层析或排 阻层析。
• 始终保持柱内液面高于凝胶表面,否则水分挥发, 凝胶变干。也要防止液体流干,使凝胶混入大量
气泡,影响液体在柱内的流动,导致分离效果变 坏,不得不重新装柱。
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