欧蒙印迹法检测ANA抗核抗体 实验报告

实验1：抗ANA自身抗体的检测（欧蒙斑点法）

一、实验目的及原理

抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）是一组针对细胞核成分的自身抗体。ANA阳性提示患有自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、混合性结缔组织病、干燥综合症、全身性硬皮病、原发性胆汁性肝硬化等。

根据细胞内各分子的理化特性和分布部位，ANA可分为抗DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗非组蛋白抗体、抗核仁抗体和抗其他细胞成分抗体。

在本实验中，抗核抗体谱（IgG）检测试剂盒（欧蒙印迹法）的检测模条上平行包被了高度纯化的自身抗原。用于体外定性检测人血清或血浆中的抗nRNP/Sm、Sm、SS-A（天然SS-A和Ro-52）、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1)CENPB、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白和AMAM2共14种不同抗原IgG 类抗体。

欧蒙印迹法的实验原理如下：样本血清与包被抗原的检测膜条温育，如果标本为阳性血清，则血清中的自身抗体将与膜条相应位点上的自身抗原特异性结合。洗膜后添加碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗人IgG（二抗），将与结合在膜条相应抗原位点上的自身抗体（一抗）结合，形成抗原-1st Ab-2nd Ab复合物。最后，加入酶底物NBT/BCIP（四唑硝基苯胺兰/5-溴-4-氯啶-磷酸盐）显色，阳性血清在对应膜条抗原条带处原位可形成蓝紫色的化合物沉淀。

二、实验材料

1.包被抗原的检测膜条

2.nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、PMScl、Jo-1、CENP B、PCNA 、dsDNA、

核小体、组蛋白、核糖体P蛋白

3.阳性对照：人IgG，100 倍浓缩，1x0.02ml

4.酶结合物：碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG，10倍浓缩，1x3ml

5.样本缓冲液，直接使用，1x100ml

6.清洗缓冲液，10 倍浓缩，1x 50ml

7.底物液：NBT/BCIP（四唑硝基苯胺兰/5-溴-4-氯啶-3-吲哚-磷酸盐），直接使用，

1×30ml

8.温育盘2x8槽

三、实验步骤

（一）预处理

●试剂盒平衡至室温30分钟后使用，取出膜条。

●清洗缓冲液，10倍稀释：30mL 清洗缓冲液+270mL DW，50ml/支分装。

●血清样本，使用前101X稀释：No.1666血清210uL +21mL 样本缓冲液→

10mL/支，分装2支；按排一组作阳性对照：0.02ml 阳性对照+2ml 样本缓冲液。

●AKP-羊抗人IgG，使用前10倍稀释：AKP-羊抗人IgG 2.1 mL + 18.9mL样本缓

冲液→10mL/支，分装2支。

（二）正式处理

1.预处理5min

用镊子取出膜条，数字面朝上放入温育槽中，每槽中加入1.5ml 样本缓冲液；

常温摇床震荡5min。

2.抗原和血清（1st抗体）温育30min

枪头吸去槽内液体，在温育槽中分别加入1.5ml 已稀释血清，常温，摇床震荡30min。

3.清洗15min

用枪头吸去槽内液体，在摇摆摇床上用1.5ml 清洗缓冲液清洗膜条3次，每次5 min。

4.加10X稀释的酶结合物（二抗），抗原-抗体-羊抗人IgG（二抗）温育30min

吸去槽内液体，在槽内分别加入1.5 ml 酶结合物。常温摇床震荡30min。

5.清洗15min

用枪头吸去槽内液体，在摇摇床上用1.5ml 清洗缓冲液清洗膜条3次，每次

5 分钟。

6.加底物溶液，反应10min

吸去槽内液体，在槽内分别加入1.5 ml 底物液。常温，摇床震荡10min。7.蒸馏水终止反应

吸去槽内液体，用蒸馏水清洗3 次，1.5ml/次，1/次。风干15 min。

（三）判读结果

●膜条干后，肉眼观察条带颜色强度；对照膜条上包被抗原位置，决定阳性抗

体的种类。

●质控带出现强的颜色反应说明实验操作正确。膜条包被抗原的位置上出现的

白色条带应判为阴性；阳性反应在抗原包被区呈兰色或紫色条带。

●抗原带着色与质控带强度相同为强阳性、中到较强为阳性、非常弱为可疑、

无色为阴性。

四、实验结果

第8组条带如图1所示（从左至右数第一列）。结果判读示意图如图2所示。

图1. 本次实验膜条条带图2. 结果示意图

根据结果示意图，本次实验在质控带上出现了深紫色条带，位于从上往下数的第一区域，说明实验操作正确。

本组膜条上出现强阳性的条带有三条，分别位于从上往下数的第二区域（1条）和第九区域（2条），条带呈深紫色。对照结果示意图，说明本实验所用患者血清的抗SS-A、抗Ro-52以及抗核糖体P蛋白抗体为强阳性。

膜条上出现弱阳性的条带有一条，位于从上往下数的第八区域，条带呈淡蓝色。对应结果示意图，可知本实验所用患者血清的抗SS-B抗体为弱阳性。

另外，膜条从上往下数第四区域出现一条白色条带，所对应检测的抗体为抗dsDNA抗体。根据结果判读原则，应判为阴性。

五、分析与讨论

（一）实验结果分析

由上述结果判读发现，本实验所用患者血清的抗SS-A、抗Ro-52以及抗核糖体P蛋白抗体为强阳性，抗SS-B抗体为弱阳性。

SS-A抗原属于小核糖核酸蛋白，参与mRNA转变为有翻译活性分子。抗SS-A 抗体常见于干燥综合症、（阳性率40%-80%）、系统性红斑狼疮（30%-40%）、原发性胆汁性肝硬化（10-20%）。抗Ro-52是抗SS-A抗体的其中一类（抗SS-A包括抗Ro52和抗Ro60两种自身抗体），常见于干燥综合征、系统性红斑狼疮。抗Ro-52如果阳性则提示复发或者优先于其它指标预警，起到预防提示作用。SS-B抗原是细胞核中作为RNA多聚酶III的辅蛋白，研究表明SS-B抗原决定簇是SS-A抗原的一部分，故SS-B抗体常伴随SS-A抗体一起出现。抗SS-B抗体几乎仅见于干燥综合症（阳性率40%-80%）和系统性红斑狼疮（10%-20%）的女性患者中。抗核糖体P蛋白抗体（ARPA），则是系统性红斑狼疮的特异性抗体。SLE的活动性与ARPA 的效价不具有相关性，对于有中枢神经系统症状、肾炎或肝炎的SLE患者，ARPA 的阳性率与整个SLE人群基本相同。

因此，根据不同抗核抗体所提示的疾病，以及该患者的抗核抗体谱，初步推断该患者患有自身免疫疾病，并且可能是系统性红斑狼疮（SLE）。

若要明确诊断SLE，除了抗核抗体检测之外，还需要根据患者的临床表现（如皮肤狼疮、口鼻咽部溃疡），是否有肾脏、神经病变，是否有外周白细胞或淋巴细胞减少等信息，来进一步判断。在美国风湿协会（ACR）提出的SLE分类标准中，需同时根据临床分类标准和免疫学标准作出诊断。

（二）关于实验操作及结果判读的讨论