第12章 反应分离技术
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
生物分子间的亲和识别包括 抗体-抗原、酶-底物、激素-受体 等亲和作用。
影响亲和作用的因素
1. 离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完全破坏。 2. pH：在适当的pH下，亲和结合作用较高，在其它pH下，亲和作用
减弱或完全破坏。 3. 抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用 4. 温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是，疏水性相
混合蛋白 样品
平衡液
带有配体的树 脂珠或胶粒
含配体溶液
洗下未结合的蛋白
收集目的蛋白
免疫亲和色谱的原理
利用抗原与抗体的高亲和力、高专一性和 可逆结合的特点以及色谱技术的差速迁移理 论而建立的一种新型色谱技术。
就是将被测物的特异性抗体固定在适当的固相载 体上，制备成免疫亲和色谱的固定相（免疫亲和色 谱柱），根据被测物的反应原性、抗原抗体结合的 特异性记忆，抗原抗体复合物在一定条件下能够可 逆解离的特性进行色谱分离。
生物工业中最常用的交换剂为离子交换树脂。 几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带 电，所以离子交换法已广泛用于生物大分子的分离 纯化。
离子交换树脂的结构组成
a:交联的具有三维空间立体结构的网源自文库骨架，
通常不溶于酸、碱和有机溶媒，化学稳定性 良好；
b:联接在骨架上的功能基（活性基）及可交
换离子。
（一）、离子交换树脂分类
（二）离子交换过程
装载树脂及平衡; 吸附样品; 样品淋洗(解吸、分离) 树脂再生。
离子交换分离的一般流程
（1）原料液的预处理(离子化)，使得流动相易于被 吸附剂吸附；
（2）装载，上样，使原料液和离子交换树脂的充分 接触，以利于吸附进行；
（3）淋洗离子交换树脂，以去除杂质； （4）把离子交换树脂上的有用物质解吸并洗脱下来； （5）离子交换树脂的再生。
多糖类骨架的离子交换树脂。
常用的离子交换树脂
强酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SO3H（磺酸基） 和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）； 弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有-COOH,
C6H5OH等弱酸性基团； 强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如 三甲胺基或二甲基-ß -羟基乙基胺基； 弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺， 碱性较弱；
随着新的合成基质和偶联化合物的出现以及对免疫 亲和色谱研究的深入, 必将使免疫亲和色谱在工业性 生产纯化蛋白质的应用上逐渐得到发展。
免疫亲和色谱的应用模式
非在线IAC模式 在线IAC模式
高效免疫亲和色谱柱的应用 联用技术的应用
免疫亲和技术制药领域的应用
➢天然药物粗提物活性成分的筛选 ➢真菌毒素的检测
离子交换机理及选择性
离子交换机理：
A+＋RB
RA＋B+
待分离的A+自溶液中扩散到树脂表面；
A+从树脂表面进入树脂内部的活性中心；
A+与RB在活性中心上发生复分解反应；
解吸附离子B+自树脂内部扩散至树脂表面；
B+离子从树脂表面扩散到溶液中；
交换速度的控制步骤是扩散速度，由离子进 入树脂内部的扩散（膜扩散）和在树脂内部 的扩散（粒扩散）控制。
按活性基团分类:
阳离子交换树脂(cation exchange)（含酸性基 团），对阳离子具有交换能力； 阴离子交换树脂(anion exchange)（含碱性基团）， 对阴离子具有交换能力； 具体又可以分为：强阳、弱阳、强阴、弱阴。
离子交换树脂分类
根据离子交换剂的树脂材料分：
以苯乙烯和二乙烯苯共聚而成的合成树脂聚苯乙烯 树脂为基质的离子交换树脂；
互作用增强 5. 液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱 6. 螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失
利用生物分子之间的专一性识别或特定的相互作用进行分离 的技术为亲和分离技术
亲和配基是对生物分子具有专一性识别或特定的相互作用的 物质
亲和色谱(Affinity Chromatography，AC)是利用生物大分子 具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特性而建立起 来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲 和色谱。
免疫亲和色谱的特点
选择性，专属性强
因为IAC是利用抗原抗体的特异性反应，所以只有与色谱固定相 抗原决定簇相吻合的被测物才能被结合。
可通过制备高纯度的抗体以及有多个活性位点的抗体来尽可能地提
纯化、高抗浓原集的效选择果性好和专属性。
本方法灵敏度高，分析时间短，分析效率高。 既可作为样品的制备技术，也可作为样品的分离手段，还可用于样品的浓 缩纯化。
利用免疫亲和色谱法，特别是以单抗为配基的免疫亲和 色谱法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。
分离过程概述
当含有待测物的样品粗提液经过免疫亲和柱 时，粗提液中对抗体有特殊亲和力的待测物 就会结合到抗体上，通过淋洗去除非目标分 析物后，再采用适当的方法将结合在抗体的 目标物洗脱下来，从而使被测物选择性的提 取和浓缩。
离子交换的选择性是分离纯化的基础
当溶液中同时存在着很多种离子时，树脂对离子有选择吸附 作用。 一般来说，离子和树脂间亲和力越大，就越容易吸附； 对无机离子，离子的化合价越高，就越容易被吸附； 离子交换反应受溶液的pH影响很大。对强酸、强碱树脂来说， 任何pH下都可进行交换反应，而弱酸、弱碱树脂的交换反应 则分别在偏碱性、偏酸性或中性溶液中进行； 离子交换树脂在水和非水体系中的行为是不同的。有机溶剂 的存在会使树脂脱水收缩，结构紧密，降低吸附有机离子的 能力，而相对提高吸附无机离子的能力。
第12章 反应分离技术
(离子交换 免疫亲和)
反应分离技术：将化学反应与物理分离过程一体化， 使反应与分离操作在同一设备中完成。
反应分离操作：利用反应体的分离和不利用反应体 的分离。
反应体：再生型反应体、一次性反应体和生物体反 应体
➢离子交换 ➢免疫亲和反应
一. 离子交换技术
概念
离子交换法是应用合成的离子交换剂作为吸附剂， 将溶液中的物质，依靠库仑力吸附在交换剂上，然 后用合适的洗脱剂将吸附物质从交换剂上洗脱下来， 达到分离、浓缩、提纯的目的。
二 免疫亲和色谱
一种将免疫反应与色谱分析方法相结合的分析方法。 高效、简便的样品前处理技术，大大简化了提取、净化、衍 生化等复杂的前处理过程，在食品分析中属于痕量检测，检 测线非常低（达10-12数量级）。
Immunoaffinity Chromatography IAC
概述
生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性 地与其中某一种分子相结合，生物分子间的这种特异性相互 作用称为亲和作用。
离子交换纯化策略
对生物大分子进行分离纯化，可采用两种方式： ①正吸附： 将目标产物离子化，再交换到介质上，杂质不被吸 附而从柱流出，称为正吸附。 ②负吸附： 将杂质离子化后被交换，而目标产物不被交换直接 流出，这种方式称为负吸附。
离子交换树脂在天然产物分离中的应用
离子交换树脂用于生物碱的纯化 离子交换树脂纯化氨基酸 离子交换树脂对皂苷类产品的脱色精制
抗体与基体的偶联
活化 偶联方式：随机偶联与定向偶联
洗脱方式
冲洗液 洗脱液（酸性，碘化钠，有机改性剂，降低K） 抗体再生
单抗制备复杂，成本高，但也具有很多优点。
单抗问世后, 不少生物技术公司在研制适宜于培养杂 交瘤细胞的生物反应器及其培养基。这些大规模生 产单抗技术的建立和不断完善, 将降低免疫亲和色谱 吸附剂的价格。
可重复（再生）使用
与传统的固相萃取技术相比，免疫亲和柱可在适当的缓冲液冲洗后再生
重复使用。
免疫亲和色谱技术的要点
抗体的制备
抗体作为固定相的配体，直接影响目标测定物的特异性亲和力， 是IAC建立的关键因素
制成IAC基体
基体的基本要求 低效基体，不能在HPLC系统使用 开发新型基体材料，高效能+机械稳定性，能在HPLC系统使用
中药中的黄曲霉毒素
实际检测中常与HPLC、质谱、荧光分光方 法联合使用
思考题
在离子交换色谱操作中，怎样选择离子交 换树脂？
离子交换分离的一般流程 举例说明离子交换树脂在天然产物分离中
的应用 免疫亲和色谱原理，特点，要点
影响亲和作用的因素
1. 离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完全破坏。 2. pH：在适当的pH下，亲和结合作用较高，在其它pH下，亲和作用
减弱或完全破坏。 3. 抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用 4. 温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是，疏水性相
混合蛋白 样品
平衡液
带有配体的树 脂珠或胶粒
含配体溶液
洗下未结合的蛋白
收集目的蛋白
免疫亲和色谱的原理
利用抗原与抗体的高亲和力、高专一性和 可逆结合的特点以及色谱技术的差速迁移理 论而建立的一种新型色谱技术。
就是将被测物的特异性抗体固定在适当的固相载 体上，制备成免疫亲和色谱的固定相（免疫亲和色 谱柱），根据被测物的反应原性、抗原抗体结合的 特异性记忆，抗原抗体复合物在一定条件下能够可 逆解离的特性进行色谱分离。
生物工业中最常用的交换剂为离子交换树脂。 几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带 电，所以离子交换法已广泛用于生物大分子的分离 纯化。
离子交换树脂的结构组成
a:交联的具有三维空间立体结构的网源自文库骨架，
通常不溶于酸、碱和有机溶媒，化学稳定性 良好；
b:联接在骨架上的功能基（活性基）及可交
换离子。
（一）、离子交换树脂分类
（二）离子交换过程
装载树脂及平衡; 吸附样品; 样品淋洗(解吸、分离) 树脂再生。
离子交换分离的一般流程
（1）原料液的预处理(离子化)，使得流动相易于被 吸附剂吸附；
（2）装载，上样，使原料液和离子交换树脂的充分 接触，以利于吸附进行；
（3）淋洗离子交换树脂，以去除杂质； （4）把离子交换树脂上的有用物质解吸并洗脱下来； （5）离子交换树脂的再生。
多糖类骨架的离子交换树脂。
常用的离子交换树脂
强酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SO3H（磺酸基） 和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）； 弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有-COOH,
C6H5OH等弱酸性基团； 强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如 三甲胺基或二甲基-ß -羟基乙基胺基； 弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺， 碱性较弱；
随着新的合成基质和偶联化合物的出现以及对免疫 亲和色谱研究的深入, 必将使免疫亲和色谱在工业性 生产纯化蛋白质的应用上逐渐得到发展。
免疫亲和色谱的应用模式
非在线IAC模式 在线IAC模式
高效免疫亲和色谱柱的应用 联用技术的应用
免疫亲和技术制药领域的应用
➢天然药物粗提物活性成分的筛选 ➢真菌毒素的检测
离子交换机理及选择性
离子交换机理：
A+＋RB
RA＋B+
待分离的A+自溶液中扩散到树脂表面；
A+从树脂表面进入树脂内部的活性中心；
A+与RB在活性中心上发生复分解反应；
解吸附离子B+自树脂内部扩散至树脂表面；
B+离子从树脂表面扩散到溶液中；
交换速度的控制步骤是扩散速度，由离子进 入树脂内部的扩散（膜扩散）和在树脂内部 的扩散（粒扩散）控制。
按活性基团分类:
阳离子交换树脂(cation exchange)（含酸性基 团），对阳离子具有交换能力； 阴离子交换树脂(anion exchange)（含碱性基团）， 对阴离子具有交换能力； 具体又可以分为：强阳、弱阳、强阴、弱阴。
离子交换树脂分类
根据离子交换剂的树脂材料分：
以苯乙烯和二乙烯苯共聚而成的合成树脂聚苯乙烯 树脂为基质的离子交换树脂；
互作用增强 5. 液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱 6. 螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失
利用生物分子之间的专一性识别或特定的相互作用进行分离 的技术为亲和分离技术
亲和配基是对生物分子具有专一性识别或特定的相互作用的 物质
亲和色谱(Affinity Chromatography，AC)是利用生物大分子 具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特性而建立起 来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲 和色谱。
免疫亲和色谱的特点
选择性，专属性强
因为IAC是利用抗原抗体的特异性反应，所以只有与色谱固定相 抗原决定簇相吻合的被测物才能被结合。
可通过制备高纯度的抗体以及有多个活性位点的抗体来尽可能地提
纯化、高抗浓原集的效选择果性好和专属性。
本方法灵敏度高，分析时间短，分析效率高。 既可作为样品的制备技术，也可作为样品的分离手段，还可用于样品的浓 缩纯化。
利用免疫亲和色谱法，特别是以单抗为配基的免疫亲和 色谱法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。
分离过程概述
当含有待测物的样品粗提液经过免疫亲和柱 时，粗提液中对抗体有特殊亲和力的待测物 就会结合到抗体上，通过淋洗去除非目标分 析物后，再采用适当的方法将结合在抗体的 目标物洗脱下来，从而使被测物选择性的提 取和浓缩。
离子交换的选择性是分离纯化的基础
当溶液中同时存在着很多种离子时，树脂对离子有选择吸附 作用。 一般来说，离子和树脂间亲和力越大，就越容易吸附； 对无机离子，离子的化合价越高，就越容易被吸附； 离子交换反应受溶液的pH影响很大。对强酸、强碱树脂来说， 任何pH下都可进行交换反应，而弱酸、弱碱树脂的交换反应 则分别在偏碱性、偏酸性或中性溶液中进行； 离子交换树脂在水和非水体系中的行为是不同的。有机溶剂 的存在会使树脂脱水收缩，结构紧密，降低吸附有机离子的 能力，而相对提高吸附无机离子的能力。
第12章 反应分离技术
(离子交换 免疫亲和)
反应分离技术：将化学反应与物理分离过程一体化， 使反应与分离操作在同一设备中完成。
反应分离操作：利用反应体的分离和不利用反应体 的分离。
反应体：再生型反应体、一次性反应体和生物体反 应体
➢离子交换 ➢免疫亲和反应
一. 离子交换技术
概念
离子交换法是应用合成的离子交换剂作为吸附剂， 将溶液中的物质，依靠库仑力吸附在交换剂上，然 后用合适的洗脱剂将吸附物质从交换剂上洗脱下来， 达到分离、浓缩、提纯的目的。
二 免疫亲和色谱
一种将免疫反应与色谱分析方法相结合的分析方法。 高效、简便的样品前处理技术，大大简化了提取、净化、衍 生化等复杂的前处理过程，在食品分析中属于痕量检测，检 测线非常低（达10-12数量级）。
Immunoaffinity Chromatography IAC
概述
生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性 地与其中某一种分子相结合，生物分子间的这种特异性相互 作用称为亲和作用。
离子交换纯化策略
对生物大分子进行分离纯化，可采用两种方式： ①正吸附： 将目标产物离子化，再交换到介质上，杂质不被吸 附而从柱流出，称为正吸附。 ②负吸附： 将杂质离子化后被交换，而目标产物不被交换直接 流出，这种方式称为负吸附。
离子交换树脂在天然产物分离中的应用
离子交换树脂用于生物碱的纯化 离子交换树脂纯化氨基酸 离子交换树脂对皂苷类产品的脱色精制
抗体与基体的偶联
活化 偶联方式：随机偶联与定向偶联
洗脱方式
冲洗液 洗脱液（酸性，碘化钠，有机改性剂，降低K） 抗体再生
单抗制备复杂，成本高，但也具有很多优点。
单抗问世后, 不少生物技术公司在研制适宜于培养杂 交瘤细胞的生物反应器及其培养基。这些大规模生 产单抗技术的建立和不断完善, 将降低免疫亲和色谱 吸附剂的价格。
可重复（再生）使用
与传统的固相萃取技术相比，免疫亲和柱可在适当的缓冲液冲洗后再生
重复使用。
免疫亲和色谱技术的要点
抗体的制备
抗体作为固定相的配体，直接影响目标测定物的特异性亲和力， 是IAC建立的关键因素
制成IAC基体
基体的基本要求 低效基体，不能在HPLC系统使用 开发新型基体材料，高效能+机械稳定性，能在HPLC系统使用
中药中的黄曲霉毒素
实际检测中常与HPLC、质谱、荧光分光方 法联合使用
思考题
在离子交换色谱操作中，怎样选择离子交 换树脂？
离子交换分离的一般流程 举例说明离子交换树脂在天然产物分离中
的应用 免疫亲和色谱原理，特点，要点