肾小管重吸收白蛋白的分子机制及病理意义_鲍浩

M egalin /Cub ilin在肾小管上皮细胞重吸 收 A lb 过 程 中 的 作 用 Christensen 和 W illnow 通 过 对 M egalin基因敲除小鼠的研究 , 发现小鼠尿液中蛋白 质排泄量显著增加 , 近端小管上皮细胞表面质膜内 陷小窝和内吞泡减少 , 但水 、电解质 、葡萄糖 、氨基酸 等物质的排 泄量 未发 生变化 [ 11] 。 同 样在 D ent 病 (Dent’ s disease)患者也发现肾小管上皮细胞 M egalin表达量的减少和内吞障碍 。
M egalin胞 浆内尾巴 与细胞内 多个配体 结合 。
尿中 A lb等物质与 M egalin 结合后 , M egalin空间构 型发生改变 , 可以启动细胞内多条信号通路 , 包括剂 量依赖性上调肾小管上皮细胞 F as(CD95)和 F as相 关死 亡域 (FADD)的表达 , 增加半胱氨酸蛋白酶 8 (caspase 8)的活性 , 同时 NF-κB 的 DNA 结 合活性 也呈浓度依赖性增加 。 随之会诱导上皮细胞表达许 多促炎和促纤维化因子 , 包括 RANTES、单核细胞趋 化蛋白 1(MCP-1)、白介素 8(IL-8)、F racta lkine、肿 瘤坏死因子 α(TNF-α)、转化生长因子 β (TGF -β )、 胶原蛋白等 ;并导致上皮细胞表面整合素表达量改 变 , 诱导上皮细胞凋亡 , 促进上皮细胞向间充质细胞 转化 , 间质 发生慢性 纤维化 [ 18] 。 有研究 者还 发现 A lb尿诱发的 TGF -β 可反馈性促进肾小球 A lb的滤 过 , 最终导致尿 A lb排泄量进一步增加[ 19] 。
M egalin基因在人体中定位于 2q24-q31, 最早可 在受精后第 4日的胚泡中表达 。细胞内翻译后加工 过程依赖于受体相关性蛋白 (RAP )。 RAP 主要起
肾脏病与透析肾移植杂志 第 15卷 第 4期 2006年 8月
3 51
分子伴侣作用 , 它有助于 M ega lin空 间折叠结构的 形成 , 并且可以防止 M egalin与胞内配体过早结合 。
M egalin是一种多功能的内吞受体 , 它可以和许 多不同结构的配体蛋白相结合 。 包括 :(1)维生素 结合 蛋 白 :内 因子 (IF )-B12 、维 生 素 D 结 合 蛋白 (DBP )、视黄醇结合蛋白 (RBP);(2)脂蛋白 :脂蛋 白 B、E、J、H ;(3)低分子量蛋白及激素 :甲状旁腺素 (PTH)、胰岛 素 、β2 微球蛋 白 (β2-MG )、免疫 球蛋 白 ;(4)药物 :氨基糖甙类 、多粘菌素 B等 ;(5)其它 : A lb、RA P、甲状腺球蛋白 (Tg)[ 8] 。 其中大多数配体 蛋白分子净电荷为负 。 而研究发现 M egalin 与大多 数配体蛋白之间的结合都存在钙离子依赖性和正电
基因突变类型和 Cub ilin分子功能受影响的程度有 关 。 此外 , 在 AMN 基因发生变异的实验狗体内 , 由 于 Cubilin定位异常 , 通过荧光示踪法同样可以发现 肾小管上皮细胞表面白蛋白内吞障碍 [ 14] 。
Cub ilin分子结构上缺少跨膜结构域 , 因此在和 配体分子 A lb结合后 , 需要在 M egalin的协同下才能 完成配体内吞 、信号转导过程 。 免疫胶体金技术可
肾小球 A lb的滤过
A lb占血浆总蛋白量的 60%, 分子量 69 kD, 半 径约 3.6 nm , 是一种带有负电荷的大分子蛋白质 。 正常情况下 , 由于肾小球滤过膜的孔径屏障和电荷 屏障 , A lb 很难通 过肾小 球滤过 膜 , 滤过系 数仅为 0.0002[ 3] 。 M aack通过 微穿 刺法 测定 小鼠原 尿中 A lb浓度仅为 1 ～ 50 μg /m l;M ogensen等则通过赖氨 酸阻断法测定人体 A lb 的排泄率约为 281 μg /m in。 此外最近有研究者通过放射标记和 高效液相色谱 法 , 发现尿液中含有许多 A lb的代谢片断 , 并且不能 被放射免疫测定 (RIA)等常规方法检测 。利用这种 新的方法 , Gudeh ith lu等测定正常小鼠肾脏 A lb的滤 过率约为 6.5 mg /100g h[ 4] 。
当 A lb和 M ega lin /Cub ilin受体结合后 , 质膜发 生内陷 , 然后分离形成内吞泡 。 小的内吞泡会相互 融合 , 或者与已经存在的大内吞泡融合 。由于内吞
352
J N eph rol D ialy Transp lant V o.l 15 N o. 4 A ug. 2006
W oh lfarth等[ 17] 曾证实重吸收活性低的肾小管 上皮细 胞 , A lb 所 激 发 的 胶 原 合 成 水 平 也 较 低 。 Gbu rek则证实 M ega lin表达缺陷的细胞对血红蛋白 诱导的细胞坏死敏感性低 。提示 M ega lin /Cubilin所 介导的 A lb重吸收可能在小管间质慢性化病变中发 挥了作用 。
以清楚显示 Cub ilin和 M egalin在肾脏中的分布基本 一致 , 主要位于近端小管上皮细胞刷状缘 。 体外实 验也证实 , M egalin和 Cubilin能够高亲和力结合 , 结 合位点可能在 CUB1-2上 ;同时还发现抗 M ega lin抗 体和抗 M egalin 寡核苷酸片断 可以抑制转铁蛋 白 、 载脂 蛋 白 (Apo )A -I /HDL 等 Cubilin 配 体 的 重 吸 收[ 14] 。 当然也 有研 究 者通 过琼 脂 糖层 析 法发 现 M egalin可以和 A lb直接结合 , 所以不能排除 M egalin在体内单独发挥内吞作用 。
基酸构成的跨膜区以及 213个氨基酸构成的胞浆内 尾巴 (图 1)[ 6] 。胞膜外区又包括 4个由低密度脂蛋 白受体 A 样重复序列组成的配体结合结构域 、17个 表皮生 长因 子 (EGF )样 重复 序 列 以及 8 个 含 有 YWTD重复 序 列 的 间 隔 区 。 胞 浆 区则 包 含 2 个 NPXY 基序 、数 个 SH 3 结构域 和 1 个 SH 2 结构 域 等 。 NPXY 基序可以通过和相应的衔接蛋 白结合 , 介导受体 -配体复合物向由笼形蛋白包被的小窝区 聚集 , 并激活细胞内信号通路 。
Cub ilin在肾小管上皮细胞重吸收中的作用 , 最 初则是在 “ Im erlund – G rä sbeck 综合征 ”患者体内 发现 。这类患者由于 Cub ilin功能缺陷 , 在出现肠粘 膜上皮细胞 IF -B12吸收障碍 、巨幼 细胞性贫血的同 时 , 往往伴 有明 显的 蛋白 尿[ 12] 。 W ah lsted t-F roberg 等[ 13] 就报道两个芬兰家族 , 一个因 CU B8 处单个氨 基酸发生置换 , 临床可出现轻重不一的蛋白尿 ;另一 个因 CUB6处点突变产生新的剪切位点 , 临床则均 表现为大量蛋白尿 。所以临床蛋白尿的水平可能与
对 A lb的重吸收主要发生在近曲小管 , 只有少量在 亨利 袢和远 端小管 完成 。而 Cub ilin M/ ega lin-笼形 蛋白途径是 A lb重吸收的主要通道 [ 5] 。
M egalin结构和功能 M egalin属于低密度脂蛋 白受体家族成员 , 分子量 600 kD, 其结构分为三个 部分 , 包括 4 400个氨基酸构成的胞膜外区 、22个氨
配体的主要结合位点 。 Cub ilin和 A lb结合的 kd值 约为 0.6 μM 。 研究表明 IF -B12可以竞争性抑制 A lb 和 Cubilin的结合 , K i值约为 1.7mM ;两者的结合位
点都在 CUB 结构域和 EGF 样 结构域相 连接 处的 113个氨基酸残基中 , 但并不完全一致 。此外 IF-B12 还可与 CUB5-8相结合 。
荷依赖性 , 故配体分子空间电荷的分布在结合中起 着重要作用 。
Cubilin结构和功能 Cubilin分子量约 460 kD, 无跨膜区 , 主要通过氨基末端的 110 个氨基酸残基 锚定在质膜表面 , 故一般 需在 M ega lin 的协同下才 能完成配体内吞过程 。分子其它部分包括 8个 EGF 样结构域和 27个 CUB 结构 域 (C lr /C ls、Uegf、Bone m o rphogenic prote in-1)[ 9] 。
图 2 M egalin /Cub ilin介导的白蛋白重吸收过程 [ 22]
M egalin /Cubilin对 A lb 的重 吸 收具 有 低 亲和 力 、高容量的特点 , 重吸收速率主要取决于受体表达 量和受体循环速率 。 所以肾小管中液体流速和小管 长度对 A lb重吸收尤为重要 。研究证实 , 在小鼠和 实验兔体内 , 近端小管越短 , 流速越 快 , A lb重吸收 率就越低[ 16] 。 同样由于其高容量的特点 , 大量蛋白 尿时 , 由于 受体循 环加速 , A lb 重吸 收量会 显著增 加 , 可以在尿液中只检测出 A lb分子少量增加 。 A lb重吸收的病理意义
Cubilin基因在人体中定位于 10p12.33 – p13, 最早可以在受 精后第 6 日的原始内 胚层细胞中表 达 。该分子在细胞中的正常定位依赖于一种分子量 约 45kD 的跨膜蛋白 AMN。 AMN 通过和 Cubilin的 EGF 样重复序列相作用形成 Cubilin-AMN 复合物 , 在 Cubilin从内质网向质膜移位以及内吞过程中 , 发 挥了重要作用 。 Im erslund 等[ 10] 曾报道三个挪威家 族 , 由于 AMN 基因单个核苷酸缺失 , 导致 Cubilin定 位异常 、肾小管上皮细胞重吸收障碍 , 家族中多个成 员出现病理性蛋白尿 。
Cubilin体内的 分布范围明显较 M egalin 窄 , 主 要见于肾脏 、卵黄囊 、小肠 、胎盘滋养层等处的上皮 细胞表面 。 配体分子包括 :A lb、 IF-B12、RAP、免疫球 蛋白轻链 、血 红蛋白 、维 生素 D 结合 蛋白 、钙离子 (C a2+ )、M egalin等 。 分子结构中的 CUB 结A lb的滤过速率远远超过肝脏 A lb的合 成速率 , 所以肾小管对滤液中 A lb的重吸收 , 对于维 持机体蛋白质的平衡尤为重要 。 研究表明 , 肾小管