动物细胞培养ppt

2、复温速率
一般来说复温速度越快越好，37℃水浴中，1～2分 钟内要完成复温。
3、冷冻保护剂
冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的 物质，常被加到一定的溶液中进行配制，作为冷冻 保护液。红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺 乳类动物细胞悬浮在水或简单的盐溶液中而不加冷 冻保护剂，以最适的冷冻速率冷冻保存可获得活的 冻存物。
Thioglycocollate肉汤和血琼脂板适于广泛的细菌检 测；Sabouraud肉汤、YM肉汤和营养肉汤适于检 测真菌。 检测到阳性结果后，应高压灭菌处理污染的培 养物及其用具。
污染物的检测
2.支原体检测 支原体检测: 支原体检测
支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长， 改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染 色体改变，干扰病毒的复制，以及具有类病毒作 用。在培养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖 影响较小而往往被忽略。
完全相同时，细胞在体外培养后，一旦失去神经体液调节 和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生 变化则是必然。细胞最多见的表现是：返祖（Atavism） 现象，即失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、 细胞趋单一化、不死性、恶性状。
2.细胞增殖 分化：是细胞生命进化中所获得的基本 细胞增殖和分化 细胞增殖 分化：
的pH值有关，温度低时CO2溶解性增加，从而影响 pH。
培养液的物理性质
渗透压： 渗透压 培养液渗透压一般介于260~320 mosm/kg之
间。 人类血浆渗透压290mosm /kg，小鼠类为310mosm /kg。
粘度：由于血清的存在，直接影响培养液粘度。 粘度 表面张力： 表面张力 培养液的表面张力有利于培养物粘着于底
脱分化（ 脱分化（Dedifferentiation） ）
由于基因变异而使细胞失去分化能 力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基 酸转移酶的特性后，储存肝糖元的能力
培养细胞的分化
不适应和脱分化两个概念不同：不适应是 因为生存条件改变而使分化发生抑制；从 分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异 所致。
培养细胞的形态
支原体检测方法和处理
1）荧光技术检测 ） 2）直接培养法：实验室常用。 ）直接培养法： 3）放射自显影检测 ） 4）DNA分子杂交 ） 分子杂交 检测完毕后，所有实验用具均 应经过高压消毒处理。
支原体检测方法和处理
5）污染支原体后的处理： ）污染支原体后的处理：
抗生素处理：如加入泰乐菌素等。 共培养法：与巨噬细胞共培养。 重新克隆法：抗生素处理后，将细胞稀释后 传代，每周换2次含抗生素的新鲜培养液，4~5 周后，重复克隆2次。 过滤法：0.22µm孔径滤膜正压过滤。
3)停滞期（Stagnate phase）： 停滞期（ 停滞期 ） 即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液 的交换面积减少，代谢产物积累，PH下降细胞 停止增殖，进入停滞期。在此时应及时进行换液 传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡， 至少再传1-2代后，细胞才能恢复。
细胞培养的基本条件
1)仪器和设备 仪器和设备: 仪器和设备 常规的细胞培养设备：如CO2孵箱； 培养器材：如培养瓶，纯水设备，干燥消毒除 菌设备，清洗设备等。 2)培养液 培养液:目前常用的基础培养液均已商品化， 培养液 如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可根 据培养需求合理选择。
物上面。
细胞培养的基本方法
1.组织、细胞的解离方法 组织、 组织 1.1 解离组织：在无菌情况下采取动物的组织或器官， 放在含有抗生素的平衡盐溶液(BSS)中，然后尽快在 超净台或无菌室内进行解离处理。 解离时应注意: 解离时应注意 1) 尽可能将脂肪和坏死组织去除干净； 2) 剪碎组织时，避免损伤组织块； 3) 解离组织用的各种酶系，需要先进行低速离心。
1.贴附型： 贴附型： 贴附型 1）成纤维细胞：心肌细胞，血管内皮 细胞等 2）上皮型细胞：消化管外皮细胞，肝 脏上皮细胞等 3）游走型细胞：神经胶质细胞 4）多形型细胞：神经组织细胞 2.悬浮型：如癌细胞 悬浮型： 悬浮型
培养细胞的生长和增殖
1.原代培养 （ Primary Culture） 阶段 原代培养（ 原代培养 ） 阶段：或称 初代培养。从体内取出组织接种培养到第一次 传代，随不同的组织时间长短不一，一般为 1~4w 2.传代培养（Subculture）阶段 传代培养（ 传代培养 ）阶段：或称继代培 养。也就是细胞系（Cell line）阶段，细胞增 殖旺盛，一般细胞可传代10-50代）。
解离细胞
常用酶和鳌合剂 酶 鳌合剂 鳌合剂进行解离： 当实验室需要制备具有均匀细胞层的培养物； 从单个细胞出发获得细胞群体； 从一定量的组织中获得最多的细胞量时。
解离细胞的方法
1）胰蛋白酶解离细胞法 2）胶原酶解离细胞法 3）机械解离细胞法 4）螯合剂解离细胞法
原代细胞培养
1）外植块培养：外植块在一定限度内可保持 ）外植块培养： 其原有组织结构，有利于其适应体外培养环 境。短期培养的外植块成为细胞培养的材料 来源之一。 2） 单层细胞培养 ： 每隔1~3d换液一次，细 ） 单层细胞培养： 胞长成单层后传代培养。
2) 指 数 生 长 期 （ Logarthmic growth phase）： ） 细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指 数（Mitotic index，MI）表示，即细胞群中每 1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂 指数介于0.1~0.5%，且受细胞种类培养液成分、 pH、温度等影响。
细胞培养的基本条件
3)血清 血清：一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)， 血清 人血清和其它动物血清。 4)平衡盐溶液 平衡盐溶液: 平衡盐溶液 常用的有PBS，Hank’s等。 5)抗生素 抗生素:常用为青霉素（每毫升培养液50~100 抗生素 单位）和链霉素（每毫升培养液50~100微克）悬浮细胞培养：使细胞成悬浮状态在培养液 ）悬浮细胞培养 中连续生长。 由于细胞本身是不粘附的，如小鼠白血病细 胞和腹水肿瘤细胞； 通过机械搅动使细胞保持悬浮状态； 通过选择培养得到能悬浮生长的细胞进行悬 浮培养。
培养细胞的污染问题及检测
细胞培养的污染问题十分重要， 一旦发生污染，将导致前功尽弃。所 以细胞培养一定要建立无菌观念。遇 到培养污染要分析原因，及时处理。
培养液的物理性质
pH值：大多数细胞在pH7.4时生长最好，一般不 值
低于6.8，不高于7.6。酚红是常用的指示剂，用来检 测PH的变化：红色--pH7.4，橙色--pH7.0，黄色-PH --pH7.4 --pH7.0 -pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。
温度： 温度 温度除直接影响细胞生长外，还与培养液
细胞保存
在体外培养工作中，常要将体外培养物 进行冷冻保存，在需要时再复温融解进行体 外培养（复苏）。要获得好的冻存与复苏效 果，必须了解如下几个问题：冷冻速率、复 温速率、冷冻保护剂，冷冻保存温度。
细胞保存
1、 冷冻速率
冷冻速率是指降温的速度，是活细胞能否被冷冻到一 个能永久保存的温度的一个主要因素。冷冻速率太快或 太慢都会造成细胞的损伤，只有以最适的冷冻速率冷冻 细胞，才能获得最佳的冷冻保存效果。 不同细胞最适冷冻速率的值也有所不同，所以一种细 胞冷冻保存之前要测试出其最适冷冻速度，拟保证获得 最高冷冻存活率。
细胞保存
对大多数有核哺乳类动物细胞来说，在不加冷冻保护 剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的 冻存物。 目前冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。 具有渗透性的冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是 一些小分子的物质，主要有甘油、DMSO、乙二醇、 丙二醇、乙酰胺、甲醇等，。 非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大 分子物质，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、 聚乙二醇、羟乙基淀粉等。
动物细胞培养学习（ 动物细胞培养学习（一）
前 言
1885年Roux最早尝试使组织离体培养， 材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养 液，并首次采用组织培养这个术语。 1907年Harrison 和1912年Carrel开始把 组织培养作为一种方法，用于研究离体动 物细胞的培养。
组织培养中热门的研究领域
6)其它添加成分 其它添加成分： 其它添加成分
缓 冲 系 统 ， 常 用 为 HEPES （ N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’ethanesulfonic acid），缓冲效能(pKa)在20℃时为7.55，37℃为 7.31； HEPES不是起维持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快 速pH变化的，所以调整pH常常用NaHCO3溶液。 有机补充物， 有机补充物，如丙酮酸钠， 谷胺酰氨等。 促细胞分裂因子， 促细胞分裂因子，如生长因子类的FGF(成纤维细胞生长因子)， EGF(表皮生长因子)。 贴壁和铺展因子， 贴壁和铺展因子，如胶原蛋白，纤粘蛋白等。 可根据培养细胞的特殊要求进行添加。
细胞污染的种类和判定
1) 培养液的酸碱度发生异常的改变。 2)培养液出现混浊。 3)光镜观察到菌丝和颗粒。 4)细胞出现死亡或增殖缓慢等。
污染物的检测
1.细菌和真菌污染的检测 细菌和真菌污染的检测： 细菌和真菌污染的检测 1）涂片染色镜检； 2 ） 接 种 培 养 ： Trypticase 大 豆 肉 汤 、 BHI 、
1)细胞内部的活动，如DNA的复制和转录、 蛋白质合成、能量代谢； 2)细胞内部的流动，如RNA从细胞核向细 胞质方向运转，激素受体复合物的易位等； 3)生态学，如营养、感染、病毒或化学诱 变、药物作用； 4)细胞与细胞之间的相互作用，如胚胎诱 导、细胞群体的动力学等。
组织培养的分类及基本概念
分类: 分类
污染病毒的检测
1）致细胞病变效应（CPE）或集落 的检测：采用相差显微镜检测 2）血细胞吸附试验； 3）鸡胚接种。
细胞间交叉污染
为避免细胞间交叉污染，应注意： 为避免细胞间交叉污染，应注意： 1. 2. 3. 4. 5. 了解各细胞系的特征； 了解各细胞系的特征； 培养各细胞系的操作手续要快速； 培养各细胞系的操作手续要快速； 培养各细胞系不用同一瓶的培养液和酶等； 培养各细胞系不用同一瓶的培养液和酶等； 吸过培养液和细胞悬液的吸管， 吸过培养液和细胞悬液的吸管，不能放回储存培养液和 酶的瓶内； 酶的瓶内； 经常检查培养物特征，注意任何突然的形态学改变， 经常检查培养物特征，注意任何突然的形态学改变，通 过染色体或同工酶谱分析，检查是否有交叉污染。 过染色体或同工酶谱分析，检查是否有交叉污染。