硝酸还原酶

植物体内硝酸还原酶活力的测定

P56—59

硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键美，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：NO3—＋NADH＋H+ →NO2—＋NAD++H2O产生的亚硝酸盐与对—氨基苯磺酸（或对—氨基苯磺酰胺）及α—萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。

生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度计法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即ug·g—1·h—1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性好。

一、离体法

仪器与用具：

冷冻离心机；分光光度计；天平；冰箱；恒温水浴锅；研钵；剪刀；离心管；具塞试管（10ml）；移液管（5、2、1ml）；洗耳球。

试剂：

亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO2 0.9857g溶于去离子水定容至1000ml，然后再吸收5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug/ml的标准溶液；

0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O 30.0905g与NaH2PO4·2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1000ml；

1%（W/V）溶液：1.0g对氨基苯磺酸溶于100ml 3mol/L HCl中（25ml浓盐酸加水定容至100ml即为3mol/L HCl）；

0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml去离子水中，贮于棕色瓶中；

0.1mol/L KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液中；

0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液：8.8640g Na2HPO4·12H2O ，0.0570g K2HPO4·3H2O加去离子水溶解后定容至1000ml；

提取缓冲液：0.1211g半胱氨酸，0.0372g EDTA溶于100ml 0.025mol/L PH8.7的磷酸缓冲液中；

2mg/ml NADH溶液：2mg NADH溶于1ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液（临用前配置）。

方法：

1. 标准曲线制作

取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表15—1顺序加入试剂，配成0—2.0ug 的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀在25℃下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。

2. 样品中硝酸还原酶活力测定

⑴酶的提取：称取0.5g鲜样，于研钵中剪碎置低温冰箱冰冻30min，取出置冰浴中加少量石英砂及4ml提取缓冲液，研磨匀浆，转移于离心管中在4℃4000r/min下离心15min，上清掖即为粗美提取液。

⑵酶的反应：取粗酶掖0.4ml于10ml试管中，加入1.4ml 0.1mol/L KNO3磷酸溶液和0.2ml NADH溶液，混匀，在25℃水浴中保温30min，对照不加NADH 溶液，而以0.2ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液代替。

⑶终止反应和比色测定：保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应，再加1ml萘基乙烯胺溶液，显色15min后于4000r/min下离心5min，取上清液在540nm 下比色测定。根据标准曲线计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量（ug）

3. 原始数据的记载

4. 结果计算：

样品酶活性（ug·g—1·h—1）=（X×V1/V2）/[W×t（h）]

式中：X——反应液酶催化产生的亚硝态氮总量（ug）

V1——提取酶时加入的缓冲液的体积（ml）

V2——酶反应时加入的粗酶体积（ml）

W——样品重量（g）

t——反应时间（h）。

二、活体法

仪器与用具：

真空抽气泵；抽器用真空干燥器；50ml三角瓶；玻璃瓶塞（其他用具同离

体法）

试剂：

亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO2 0.9857g溶于去离子水定容至1000ml，然后再吸收5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug/ml的标准溶液；

0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O 30.0905g与NaH2PO4·2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1000ml；

1%（W/V）溶液：1.0g对氨基苯磺酸溶于100ml 3mol/L HCl中（25ml浓盐酸加水定容至100ml即为3mol/L HCl）；

0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml去离子水中，贮于棕色瓶中；

0.1mol/L KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液中；

30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸，水溶后定容至100ml。

方法：

1. 标准曲线制作

同离体法

2. 酶反应及活性测定

⑴取样称取作物叶片1.0—2.0g共4份，剪成1cm左右的小段，放于4只三角瓶中，其中1份作对照，另外3份做酶活性测定用。

⑵反应先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入9ml 0.1mol/L KNO3溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气1min再通入空气，再抽真空。反复几次，以排除组织间隙的气体，至叶片完全沉入瓶底，以便底物溶液进入组织。最后通入氮气密封后，在25℃黑暗中反应0.3h，分别向测定瓶（对照瓶除外）加入1ml 30%三氯乙酸终止酶反应。

⑶比色测定将各瓶摇匀静置2min后，各取2ml反应液，加入1ml磺胺和1ml 萘基乙烯胺，摇匀显色15min后，于4000r/min下离心5min，取上清液于540nm 处测其吸光值。根据标准曲线计算出反应液中生成的亚硝态氮总量（ug）。

3. 原始数据记录。

4. 结果计算同离体法

注意事项：

1. 硝酸还原酶容易失活，离体法测定时，操作应迅速，并且在4℃下进行。

2. 取样宜在晴天进行，最好提前一天施用一定量的硝态氮肥，取样部位应一致。