荧光原位杂交
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
5～10min，使双链DNA探针变性。 2）标本变性 • ①将制备好的染色体玻片标本于50oC培养箱中烤片
2～3h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中 退色后再烤片）。 • ②取出玻片标本，将其浸在70～75oC的体积分数70 ％甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。 • ③立即按顺序将标本经体积分数70％、体积分数90 ％和体积分数100％冰乙醇系列脱水，每次5min，然 后空气干燥。
荧光原位杂交
• FISH技术包括下列几个步骤：
• 1）探针的制备和标记 • 2）探针及标本变性 • 3）杂交 • 4）洗脱 • 5）杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针） • 6）封片 • 7）荧光显微镜观察FISH结果
荧光原位杂交
探针的制备和标记
• 探针是一段带有荧光色素或（半）抗原的核苷酸序列。 其长度介于15至数千个核苷酸之间，但以250~650个核 苷酸杂交效果最好
染色体的着丝粒
异染色质区域
荧光原位杂交
简单重复序列探针
• 间期细胞遗传学的意义： 细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十分之一， 经细胞培养和相应处理才能获得染色体。人体的大部分细 胞并不进行分裂，很难通过培养获得中期染色体分裂相， 间期FISH为这一时期遗期传物质的研究提供了可能，而 且快速。
荧光原位杂交
染色体涂染探针
• 染色体涂染探针(chromosome painting probes) 整条染色体探针或染色体区带特异性探针
探针来源： （1）含有人单条染色体的人-啮齿类(human-rodent) 体细胞杂种组织融合的产物； （2）荧光激活的流式细胞仪(fluorescence-activated cell sorter,FACS)分离整条染色体DNA，并以载体克隆 /PCR扩增； （3）显微切割得到染色体或染色体片段，PCR扩增； • 应用 （1）染色体数目和结构异常分析；
荧光原位杂交
FISH的原理 FISH的操作及应用 FISH的展望
荧光原位杂交
FISH的原理
• FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针， 按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸 进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由 于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排 列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特 定的基因在染色体上定位。
FISH, M-FISH probes) 两种以上不同的非同位素标记，不同的 荧光检测系统，通过不同的滤光片组合 或极少数几种非同位素标记探针后，按 照不同的比例混合，可以显示多种颜色。
荧光原位杂交
多色复合染色体FISH探针
wenku.baidu.com
荧光原位杂交
探针及标本的变性
1）探针变性 • 将探针在75oC恒温水浴中温育5min，立即置0oC，
• 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、 染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前 诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。。
荧光原位杂交
原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每 次检验均 需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的 不稳定性，需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。 在观察结果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外， 由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数 上的误 差等。
单拷贝探针
FISH检测微小缺失
荧光原位杂交
单拷贝探针
FISH检测微小缺失
荧光原位杂交
染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1)
荧光原位杂交
简单重复序列探针
• 简单重复序列探针(simple repetitive probes) ——异染色质着丝粒探针(heterochromatic centromer probes)
• 与之比FISH的优点 • ①操作操作简便,探针标记后稳定,一次标记后可使用二年 • ②方法敏感,能迅速得到结果 • ③在同一标本上,可同时检测几种不同探针. • ④不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究,
而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究. 缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA 探针时效率明显下降。
荧光原位杂交
• 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH) • 荧光原位杂交是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上
发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素 标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子 (reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧 光染料.
• 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。 ➢ 间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联
有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以 利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放 大，从而可以检测500bp的片段。 ➢ 直接标记是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架 共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三 磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能 进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。
荧光原位杂交
单拷贝探针：
（1）种类：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， cDNA片段
（2）应用 （a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证； （b）确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。 （d）间期细胞染色体数目异常诊断。
荧光原位杂交
单拷贝探针
DNA片段的染色体定位
荧光原位杂交
（2）不同物种间的同源性比较； （3）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。
荧光原位杂交
染色体涂染探针
人类染色体结构分析
荧光原位杂交
染色体涂染探针：染色体结构异常分
析
荧光原位杂交
多色复合染色体 FISH探针
多色FISH（muti-color FISH) 多色复合染色体FISH探针(multiplex
• 其靶序列为α卫星DNA或卫星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色体的着丝粒和 异染色质区域，重复数百次至数千次。 特点：信号强 应用：(a)标记染色体识别 (b)染色体数目异常检测 (c)间期细胞遗传学研究和临床诊断
荧光原位杂交
简单重复序列探针
2～3h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中 退色后再烤片）。 • ②取出玻片标本，将其浸在70～75oC的体积分数70 ％甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。 • ③立即按顺序将标本经体积分数70％、体积分数90 ％和体积分数100％冰乙醇系列脱水，每次5min，然 后空气干燥。
荧光原位杂交
• FISH技术包括下列几个步骤：
• 1）探针的制备和标记 • 2）探针及标本变性 • 3）杂交 • 4）洗脱 • 5）杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针） • 6）封片 • 7）荧光显微镜观察FISH结果
荧光原位杂交
探针的制备和标记
• 探针是一段带有荧光色素或（半）抗原的核苷酸序列。 其长度介于15至数千个核苷酸之间，但以250~650个核 苷酸杂交效果最好
染色体的着丝粒
异染色质区域
荧光原位杂交
简单重复序列探针
• 间期细胞遗传学的意义： 细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十分之一， 经细胞培养和相应处理才能获得染色体。人体的大部分细 胞并不进行分裂，很难通过培养获得中期染色体分裂相， 间期FISH为这一时期遗期传物质的研究提供了可能，而 且快速。
荧光原位杂交
染色体涂染探针
• 染色体涂染探针(chromosome painting probes) 整条染色体探针或染色体区带特异性探针
探针来源： （1）含有人单条染色体的人-啮齿类(human-rodent) 体细胞杂种组织融合的产物； （2）荧光激活的流式细胞仪(fluorescence-activated cell sorter,FACS)分离整条染色体DNA，并以载体克隆 /PCR扩增； （3）显微切割得到染色体或染色体片段，PCR扩增； • 应用 （1）染色体数目和结构异常分析；
荧光原位杂交
FISH的原理 FISH的操作及应用 FISH的展望
荧光原位杂交
FISH的原理
• FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针， 按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸 进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由 于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排 列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特 定的基因在染色体上定位。
FISH, M-FISH probes) 两种以上不同的非同位素标记，不同的 荧光检测系统，通过不同的滤光片组合 或极少数几种非同位素标记探针后，按 照不同的比例混合，可以显示多种颜色。
荧光原位杂交
多色复合染色体FISH探针
wenku.baidu.com
荧光原位杂交
探针及标本的变性
1）探针变性 • 将探针在75oC恒温水浴中温育5min，立即置0oC，
• 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、 染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前 诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。。
荧光原位杂交
原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每 次检验均 需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的 不稳定性，需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。 在观察结果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外， 由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数 上的误 差等。
单拷贝探针
FISH检测微小缺失
荧光原位杂交
单拷贝探针
FISH检测微小缺失
荧光原位杂交
染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1)
荧光原位杂交
简单重复序列探针
• 简单重复序列探针(simple repetitive probes) ——异染色质着丝粒探针(heterochromatic centromer probes)
• 与之比FISH的优点 • ①操作操作简便,探针标记后稳定,一次标记后可使用二年 • ②方法敏感,能迅速得到结果 • ③在同一标本上,可同时检测几种不同探针. • ④不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究,
而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究. 缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA 探针时效率明显下降。
荧光原位杂交
• 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH) • 荧光原位杂交是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上
发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素 标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子 (reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧 光染料.
• 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。 ➢ 间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联
有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以 利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放 大，从而可以检测500bp的片段。 ➢ 直接标记是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架 共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三 磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能 进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。
荧光原位杂交
单拷贝探针：
（1）种类：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， cDNA片段
（2）应用 （a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证； （b）确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。 （d）间期细胞染色体数目异常诊断。
荧光原位杂交
单拷贝探针
DNA片段的染色体定位
荧光原位杂交
（2）不同物种间的同源性比较； （3）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。
荧光原位杂交
染色体涂染探针
人类染色体结构分析
荧光原位杂交
染色体涂染探针：染色体结构异常分
析
荧光原位杂交
多色复合染色体 FISH探针
多色FISH（muti-color FISH) 多色复合染色体FISH探针(multiplex
• 其靶序列为α卫星DNA或卫星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色体的着丝粒和 异染色质区域，重复数百次至数千次。 特点：信号强 应用：(a)标记染色体识别 (b)染色体数目异常检测 (c)间期细胞遗传学研究和临床诊断
荧光原位杂交
简单重复序列探针