石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法

1、组织的采集、固定和保存：

采取组织后，

方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4 C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜

方法二：采用bouin ' s 固定RT2h（6-8d tesis ）or RT 过夜（成年tesis ）

PBS缓冲液洗三次，每次5min, 4 C保存于70%乙醇中。

2、组织的包埋、切片、展片及保存：：

固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54 C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10 m,贴于处理过的干净载玻片上，37 C烤片过夜，之后收集于载片

盒中，RT密封保存。

石蜡包埋：

保存于 4 C 70%乙醇中的组织样品

80% 乙醇15 min

95%乙醇15 min

100%乙醇15min 2

1/2 乙醇1/2 二甲苯15 min

二甲苯透明5-10 min

1/2 二甲苯1/2 石蜡30 min

石蜡（1） 1.5hr

石蜡（2） 1.5-2.5hr

石蜡（3）包埋

RT保存

3、石蜡组织切片的免疫组化方法：

密封保存于RT的组织切片

二甲苯（1） 20 min

二甲苯（2） 20 min

100% 乙醇20min

95% 乙醇10 min

切片在PBS 中浸泡5 min*3 3%H2O ) 80% 乙醇 10 min

通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈

切片在PBS 中浸泡5 min*2

0.4%Trit onx RT 10 min 切片在PBS 中浸泡5 min*3 3%H2O2 RT 10min 切片在PBS 中浸泡 5 min*3 卩.25% 胰酶 RT 10min PBS) RT 60min

Block ing buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Trito nx-100 in DAB

倾去 blocking buffer ，勿洗 一抗 4 C overnight in blocking buffer 取出切片复温1h ，切片在PBS 中浸泡5 min*3 二抗 in blocking buffer GAR1 200 ( GAM1 100)，RT1h 显色5-10min ( 50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升

在PBS 中浸泡5 min*3

如果是增强型DAB只要1min即可。

切片浸入PBS终止显色，HE衬染1s，

玻片架放入泡沫盒，流水冲洗15min，肉眼看到淡淡的紫色

即可停止。

若颜色太深，可用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1〜2秒钟（或更久）

脱水85%^醇5 min

95% 乙醇5 min

无水乙醇5 min

无水乙醇5mi n 二甲苯（1） 10min 二甲苯（2） 10min

中性树胶封片，室温干燥保存

4、石蜡组织切片的免疫荧光方法:

密封保存于RT的组织切片

二甲苯⑴20 min

二甲苯(2) 20 min

100% 乙醇20mi n

95% 乙醇10 min

80% 乙醇10 min

通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈

切片在PBS中浸泡5 min*2

0.4%Trit onx RT 10 min

切片在PBS中浸泡5 min*3

切片在PBS中浸泡5 min*3

卩.25% 胰酶RT 10min

PBS中浸泡5 mi n*3

Blocki ng buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Trito nx-100

in PBS) RT 60min

倾去 blocking buffer ，勿洗 一抗 4 C overnight in blocking buffer 取出切片复温1h ，切片在PBS 中浸泡5 min*3 荧光二抗 in blocking buffer GAR-cy3 1: 1000, GAM-4881:

切片在PBS 中浸泡5 min*3 封片，避光4 C 保存 1000RT 1h DAPI

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