3-细胞凋亡与免疫

N
PRK
MADD
N
DD
C
2．Cas蛋白酶级联反应

Caspase概述 Cas级联反应（DR-转接蛋白途径）
Cas活化的终末效应→细胞凋亡


(1) Caspase概述
* 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶
（cystein protease with aspartic acid specificity,Caspase） 指半胱氨酸在酶的活性中心、而其底物分 解作用位点都在天冬氨酸羧基端肽键、与 ced-3同源的一类蛋白酶。
主要内容
一、细胞凋亡概述
二、细胞凋亡的分子机制
三、细胞凋亡的胞内调控机制 四、细胞凋亡与免疫生理
五、细胞凋亡与免疫病理
一、细胞凋亡概述
* 细胞凋亡 (apoptosis): 乃一种由基 因控制的细胞自主性死亡方式。
２００２年诺贝尔生理学或医学奖分别授予了 英国科学家 悉尼· 布雷内、 美国科学家 罗伯特· 霍维茨、 英国科学家 约翰· 苏尔斯顿， 以表彰他们发现了在器官发育和“程序性 细胞死亡”过程中的基因规则。
电泳法检测凋亡—DNA Ladder
DNA细胞周期分析
G2
M
G1
G0
细 胞 数 量
DNA分析
G0G1
s
细胞周期
s
2N
200 400 600
G2 M
4N
800
DNA含量
1000
含量与凋亡关系
• DNA亚G1峰的检测：利用PI染色，检测具有 亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。 • 凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降 解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处 理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解 的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含 量减少，成为亚2倍体。
* 抑制凋亡的Bcl-2家族成员
Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Bfl-1、Brag-1、Mcl-1、A1
家族成员分类
* ICE亚类（1、4、5、13、14）：参与促炎因 子成熟等，在凋亡中起次要作用; •凋亡启动(起始）亚类（2、8、9、10）：参与 启动凋亡效应Cas，以Cas8为代表。 【N端具有DED（death effect domain）】 * 凋亡效应亚类（ 3 、 6 、 7 ）： 可剪切细胞结 构蛋白，介导凋亡。
5．末端转移标记技术
* 被切割的DNA片段含3-OH末端 →加入标记的核苷酸 * 特异性强，可进行定位及定量； 耗费大，混有较多坏死细胞时可影响结果。
凋亡的形态学检测
结果评判：细胞凋 亡过程中细胞核染 色质的形态学改变 分为三期：Ⅰ期的 细胞核呈波纹状 （rippled）或呈折 缝样（creased）， 部分染色质出现浓 缩状态；Ⅱa期细 胞核的染色质高度 凝聚、边缘化； Ⅱb期的细胞核裂 解为碎块，产生凋 亡小体[图1]。
Fas凋亡信号的传导 （death inducing signal complex）
Structure of FLIP
(2)TNFR/TNF途径
TNF与TNFR1结合
→TRADD（TNFR1 associated DD protein）聚集
→TRADD与FADD结合
→启动胞内信号传递 →细胞凋亡
C
环2
CRD空间结构 示意图 环3
环1
death domain
死亡结构域蛋白
TRADD （TNFR1 associated N
DD protein）
DD
N DED DD DD N CRAD DD
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C C C
FADD （Fas associated
protein with DD)
RIP CRADD
Caspase非依赖性途径 颗粒酶B直接剪切Bid →产生tBid →tBid与Bax转位于线粒体 →释放细胞色素C →形成凋亡体apoptosome →激活Caspase-9及其下游的Caspase-3 →细胞凋亡
（四）死亡忽略途径
免疫应答末期抗原刺激逐渐消失 →活化的T细胞IL-2及IL-2R表达水平↓ （细胞因子撤离） →高表达致凋亡蛋白Bax、Bak、Bim等 生理学意义 在免疫应答末期，随抗原量逐渐降低，及 时清除对外源性抗原特异性的T细胞，从而维 持免疫自稳状态。
2）FasL
* 主要表达于激活的T细胞表面。
3）可溶性Fas和sFasL
*
sFas可同膜型Fas竞争与FasL结合，调节Fas功能。
* sFasL可以自分泌或旁分泌形式作用于自身或旁邻活化Fas+细胞， 介导凋亡。
4）胞内信号传导
FasL与Fas结合 →Fas三聚体化（及DD多聚化） →FADD氨基端DD与Fas的DD结合； FADD羧基端DED与Cas8的DED结合 →形成death inducing signal complex （DISC，Fas/FADD/ pro-Caspase-8或10) →激活下游的pro-Caspase →细胞凋亡
Apoptotic pathways
细胞色素C
cyto-c+Apaf1(apoptosis protease activating factor1 )+pro-Cas9 →结合为凋亡体（apoptosome) →Cas9酶原被酶切为有活性的Cas9 →酶切Cas3酶原 →Cas3激活 →细胞凋亡
TNFR1的 信号传导
(二)线粒体-细胞色素C途径
生理或病理性刺激 (放射线、化学药物、氧化剂、钙超载等） →线粒体外膜通透性↑ →内膜电化学梯度↓ →释放cyto-C至胞浆 →与凋亡相关因子（Cas9、Apaf-1等）结合 →形成凋亡体（apoptosome) →激活Cas级联反应 →细胞凋亡
•剪切凋亡抑制因子（Bcl-2等）；
•剪切RNA和DNA功能相关蛋白；
•降解细胞基因组DNA
3．不同死亡受体的信号转导途径
(1)Fas/FasL途径 1）Fas（Apo-1或CD95）
* 胞浆区含有death domain； * 表达于多种细胞(尤其活化T)表面; * FasL/抗Fas抗体与Fas结合后，可诱导Fas+细胞凋亡。
末端转移标记技术检测细胞凋亡
凋亡—基础与临床
一、细胞凋亡概述
二、细胞凋亡的分子机制
三、细胞凋亡的胞内调控机制 四、细胞凋亡与免疫生理
五、细胞凋亡与疾病
免疫相关的凋亡信号转导
(一)死亡受体途径 (二)线粒体-细胞色素C途径
(三)颗粒酶B途径 （四）死亡忽略途径
免疫相关的凋亡信号转导
(一)死亡受体途径 1．死亡受体(death receptor,DR)
Casepase-8在死亡受体介导的凋亡中的作用
Fas TNFR1
FADD
FADD TRADD
Casepase-8 活化的Casepase-8 Casepase级联反应 细胞凋亡
(3)Cas活化的终末效应→细胞凋亡
•细胞骨架蛋白（肌动蛋白、肌球蛋白等）结构改变
→细胞凋亡的形态学改变 裂解层粘蛋白→核膜破裂 →促进染色质凝聚→凋亡小体形成；
㈠ 细胞凋亡的形态学特点
㈡ 细胞凋亡的生化改变 ㈢ 细胞凋亡的诱导剂和抑制剂
㈣ 细胞凋亡常用检测方法
（一）细胞凋亡的形态学特点
淋巴细胞凋亡各期形态学变化
坏死
诱导因素 生化特点 细胞形状 形态变化 染色质 DNA电泳 炎症反应 基因调控 潜伏期 强烈刺激，随机发生 被动过程，无新蛋白合 成，不耗能 破碎成碎片 细胞结构全面溶解、破 坏、细胞肿胀 稀疏、松散、呈絮状 弥散性降解，电泳呈均一 DNA片状 溶酶体破裂，局部炎症反 应 无 无
* 活性氧（超氧阴离子、超氧化物、脂质过氧化物）
→激活Apaf-1、Cas3、Cas9 →细胞凋亡
死亡受体与线粒体途径的关系
Cas8
→切割Bid →Bid羧基末端转位至线粒体 →激活线粒体途径
Receptorinitiated death pathway
(三)颗粒酶B途径
CTL释放颗粒 →颗粒与靶细胞表面M6P-R（mannose-6phosphate receptor）结合而被内吞 →穿孔素作用下，颗粒酶从颗粒中释放 (Cas依赖途径） →直接剪切并激活Caspase-3 →启动Caspase级联效应 →介导细胞凋亡
2．内源性核酸内切酶激活
Ca2+/Mg2+依赖性内源性核酸内切酶激活 →DNA核小体连接处被水解 →形成180～200bp（X）片段
3．生物大分子的合成
* 凋亡的发生依赖于新的RNA和蛋白质合成。
(三)细胞凋亡 的诱导剂和抑 制剂
(四)细胞凋亡常用检测方法
1．形态学方法
难以判断结果。
* 定性、定位；组织成分及细胞死亡类型复杂的情况下 ,
凋亡的形态学检测
结果评判：凋亡细胞体 积变小，细胞质浓缩。 凋亡Ⅰ期（proapoptosis nuclei）的细 胞核内染色质高度盘绕， 出现许多称为气穴现象 （cavitations）的空泡 结构[图2]；Ⅱa期细胞 核的染色质高度凝聚、 边缘化；细胞凋亡的晚 期，细胞核裂解为碎块， 产生凋亡小体
线粒体途径调控机制
*Bcl-2 →阻止线粒体释放cyto-C→抑制凋亡 *Ｂax →促进线粒体释放cyto-C→促凋亡 * AIF(apoptosis-induced factor) AIF →激活Cas3，核染色质凝聚、DNA断裂
↓→促进线粒体释放cyto-c * IAP(inhibitor of apoptosis protei) →抑制线粒体活化
凋亡
较弱刺激，非随机发生 主动过程，有新蛋白合 成，耗能 形成凋亡小体 胞膜及细胞器相对完整细 胞皱缩，核固缩 致密、固缩、边聚或中聚 DNA片段化（180-200bp） 电泳呈“梯”状条带 溶酶体相对完整，局部无 炎症反应 有 有
（二）细胞凋亡的生化改变
1．胞内Ca2+浓度增高
* 胞内Ca2+浓度增高凋亡启动因素之一。
2．电泳法
* 凋亡细胞基因组DNA电泳见“梯状”(ladder)条带；
* 定性及定量；无法显示组织细胞形态结构,不能反映 凋亡细胞与周围组织关系。
3．免疫学方法
*裂解的DNA片段含组蛋白，可用抗组蛋白及抗 DNA抗体 与之反应。 *定性、定量，不能定位。
4．流式细胞术
*可对典型凋亡定性和定量; 可间接判断凋亡细胞所处的周期时相; *不典型凋亡或混有大量坏死细胞时可影响结果。
2．Cas蛋白酶级联反应
3．不同死亡受体的信号转导途径
1．死亡受体(death receptor,DR)
* 与相应配体结合可诱导凋亡的一类跨膜受体
（1）成员
1）FasL/Fas（CD95/APO-1） 2）TNF-α/TNFRI 3）TRAIL（TNF-related apoptosis inducing ligand）/ DR4,DR5（DD contain receptor） 4）APO-3L/DR3
DRL+DR →DR的DD聚集 →FADD募集（Fas associated protein with DD) →通过 FADD N 端的 DED （ death effect domain ） 与pro-Cas-8的N端（ DED ）结合 →pro-Cas-8自身水解 →Cas-8 →依此水解其他pro-Cas →Cas-3活化→细胞凋亡
• Cas3 与ced-3具有最大同源性； 在体内分布最广、活性最强； 可被Fas/FasL、颗粒酶或凋亡启动Cas激活； 活化的Cas3可激活其他亚类Cas成员。
Caspase家族
Caspase家族成员的同源分析
(2) Cas级联反应（DR-转接蛋白途径）
[DRL-DR-转接蛋白（adaptor）-Cas]
Neglect pathway
Bcl-2 Family Members Regulate Mitochondrial Integrity
凋亡-基础与临床
一、细胞凋亡概述
二、细胞凋亡的分子机制
三、细胞凋亡的胞内调控机制 四、细胞凋亡与免疫生理
五、细胞凋亡与疾病
三、细胞凋亡的胞内调控机制
（一）Bcl-2家族
（2）共同的结构特点
1）均属TNFR家族成员； 2 ）胞外区 N 端含 2-4 个富含半胱氨酸的结构域 （cysteine rich domain,CRD）； 3 ）胞内区含 1 个由 60-80 个 aa 组成的死亡结构域 （death domain,DD）,其可与胞浆死亡结构域蛋白 （ DD protein， DDP）中的 DD同源结合，启动并 传递凋亡信号。 * DDP ：分子中含 DD 的凋亡信号蛋白。包括 TRADD、FADD、RIP、CRADD、MADD等。