氨基酸的薄层层析剖析
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09年秋季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验原理
1.薄层层析法是色谱分析技术的一种
一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作 为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时， 由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基 酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合 氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以 彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反 复进行，而将样品各组分分离开来）
09年秋季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验材料
吸附剂：硅胶 粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠 氨基酸的异丙醇溶液 丙氨酸、精氨酸、甘氨酸 展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液） 分析样品：氨基酸混合液
09年秋季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
器材
层析板、尺子、铅笔 烧杯、量筒 喷雾器、吹风机 毛细管、层析缸 药匙 烘烤箱
09年秋季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验原理
2. 氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成的水合茚三酮在加热 时被还原，此产物与氨基酸加热分解产生的
氨结合，以及另一分子水合茚三酮缩合生成
蓝紫色化合物而使氨基酸斑点显色。
09年秋季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
茚三酮
水合茚三酮
Ninhydrin (2,2-Dihydroxyindane1,3-dione)
硅胶的吸附力与含水量的问题
吸附实验中吸附剂的选择根据
氨基酸纸层析，两者有何区别
09年秋季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
生物化学与分子生物学实验教学中心
如何分离鉴定氨基酸混合液？
生物化学与分子生物学实验教学中心
氨基酸的薄层层析
(Thin layer chromatography of amino acids)
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验目的
掌握薄层层析法的一般原理。 掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。 掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离 的物质（即氨基酸混合液）。
09年秋季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
层析技术
概念：是利用化合物中各组分的物理性质的差 别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、 分子极性等）使各组分在两相中的分布不同， 从而使各组分以不同速度随流动相向前移动而 达到分离的目的。 特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的 物质。不仅可用于少量物质的分离纯分，也可 用于大量物质的分离纯化和制备。
Mix
生物化学与分子生物学实验教学中心
结果计算
斑点至原点距离
Rf = 溶剂前缘至原点距离
小心量出斑点中心至原点中心距离， 再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算 出它们的 Ｒｆ值。 根据Ｒｆ值，鉴定出混合样品中氨基 酸的种类，并绘出层析图谱。
09年秋季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
The scan of TLC plate (silica gel G) with 10 essential oils(精油）
09年秋季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
层析法的分类
气相层析（以气体为流动相的层析法） 液相层析（以液体为流动相的层析法，此为生 物化学领域里常用的方法） 1.吸附层析：薄层吸附层析、吸附柱层析 2.分配层析：纸层析、柱层析、薄层层析 3.离子交换层析 4.凝胶层析：柱层析、薄膜层析 5.亲和层析
09年秋季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
注意事项
1.切勿用手直接接触薄层板面。 2.如果样品液太稀，需要重复点样时，点样过程 中必须在第一滴样品干后再点第二滴。 3.样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多， 易造成斑点过大，互相交叉或拖尾。
09年秋季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
复习思考题
09年秋季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
茚三酮反应（ninhydrin reaction)
09年秋季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验原理
3.混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对 迁移率—Rf值（rate of flow）来表示。 层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液 前沿的距离之比为Rf值。 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故 移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来 鉴定被分离的物质。
09年秋季学期
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操作步骤—
点样
1、位置：用铅笔距底边 2cm水平线上均匀确定4个 点。每个样品间相距1cm。 2、用毛细管分别吸取氨 基酸溶液，轻轻接触薄层 表面点样。 3、加样后原点扩散直径 不超过2mm。 4、待点样点干后再重复 点一次。
09年秋季学期
2cm
Ala Arg Gly Mix
1cm
生物化学与分子生物学实验教学中心
操作步骤—
展层、显色
将薄层板点样端浸入展 层-显色剂，展层-显色剂液 面应低于点样线。盖好层析 缸盖，上行展层。当展层剂 前沿离薄板顶端2cm时，停 止展层，取出薄板，用铅笔 描出溶剂前沿界线，用热风 吹干或在85℃下烘干，即可 显出各层斑点。
09年Байду номын сангаас季学期
Ala Arg Gly
09年秋季学期
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操作步骤—
薄层板的制备
1、调浆 称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素 钠8毫升，调成均匀的糊状。
2、涂布 取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。
3、干燥 将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。 4、活化 70℃烘干30分钟。切断电源，待玻璃板 面温度下降至不烫手时取出。
实验原理
1.薄层层析法是色谱分析技术的一种
一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作 为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时， 由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基 酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合 氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以 彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反 复进行，而将样品各组分分离开来）
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实验材料
吸附剂：硅胶 粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠 氨基酸的异丙醇溶液 丙氨酸、精氨酸、甘氨酸 展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液） 分析样品：氨基酸混合液
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器材
层析板、尺子、铅笔 烧杯、量筒 喷雾器、吹风机 毛细管、层析缸 药匙 烘烤箱
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实验原理
2. 氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成的水合茚三酮在加热 时被还原，此产物与氨基酸加热分解产生的
氨结合，以及另一分子水合茚三酮缩合生成
蓝紫色化合物而使氨基酸斑点显色。
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茚三酮
水合茚三酮
Ninhydrin (2,2-Dihydroxyindane1,3-dione)
硅胶的吸附力与含水量的问题
吸附实验中吸附剂的选择根据
氨基酸纸层析，两者有何区别
09年秋季学期
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如何分离鉴定氨基酸混合液？
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氨基酸的薄层层析
(Thin layer chromatography of amino acids)
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验目的
掌握薄层层析法的一般原理。 掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。 掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离 的物质（即氨基酸混合液）。
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层析技术
概念：是利用化合物中各组分的物理性质的差 别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、 分子极性等）使各组分在两相中的分布不同， 从而使各组分以不同速度随流动相向前移动而 达到分离的目的。 特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的 物质。不仅可用于少量物质的分离纯分，也可 用于大量物质的分离纯化和制备。
Mix
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结果计算
斑点至原点距离
Rf = 溶剂前缘至原点距离
小心量出斑点中心至原点中心距离， 再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算 出它们的 Ｒｆ值。 根据Ｒｆ值，鉴定出混合样品中氨基 酸的种类，并绘出层析图谱。
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The scan of TLC plate (silica gel G) with 10 essential oils(精油）
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层析法的分类
气相层析（以气体为流动相的层析法） 液相层析（以液体为流动相的层析法，此为生 物化学领域里常用的方法） 1.吸附层析：薄层吸附层析、吸附柱层析 2.分配层析：纸层析、柱层析、薄层层析 3.离子交换层析 4.凝胶层析：柱层析、薄膜层析 5.亲和层析
09年秋季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
注意事项
1.切勿用手直接接触薄层板面。 2.如果样品液太稀，需要重复点样时，点样过程 中必须在第一滴样品干后再点第二滴。 3.样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多， 易造成斑点过大，互相交叉或拖尾。
09年秋季学期
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复习思考题
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茚三酮反应（ninhydrin reaction)
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实验原理
3.混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对 迁移率—Rf值（rate of flow）来表示。 层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液 前沿的距离之比为Rf值。 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故 移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来 鉴定被分离的物质。
09年秋季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
操作步骤—
点样
1、位置：用铅笔距底边 2cm水平线上均匀确定4个 点。每个样品间相距1cm。 2、用毛细管分别吸取氨 基酸溶液，轻轻接触薄层 表面点样。 3、加样后原点扩散直径 不超过2mm。 4、待点样点干后再重复 点一次。
09年秋季学期
2cm
Ala Arg Gly Mix
1cm
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操作步骤—
展层、显色
将薄层板点样端浸入展 层-显色剂，展层-显色剂液 面应低于点样线。盖好层析 缸盖，上行展层。当展层剂 前沿离薄板顶端2cm时，停 止展层，取出薄板，用铅笔 描出溶剂前沿界线，用热风 吹干或在85℃下烘干，即可 显出各层斑点。
09年Байду номын сангаас季学期
Ala Arg Gly
09年秋季学期
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操作步骤—
薄层板的制备
1、调浆 称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素 钠8毫升，调成均匀的糊状。
2、涂布 取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。
3、干燥 将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。 4、活化 70℃烘干30分钟。切断电源，待玻璃板 面温度下降至不烫手时取出。