第三章 复习生态毒理学基本研究方法2 (1)

(二)烧杯水生微宇宙
烧杯水生微宇宙又称混合烧杯培养，是一种较小的 淡水水生微宇宙，体积大约为1L。经过6周的建立 稳定期后，进行12—14周的试验期。 与标准化的水生微宁宙相比，烧杯水生微宇宙通过 加入来自生态系统浸出液提供给微宇宙中生物群落 所必需的基质。 烧杯水生微宇宙为群落的共同发展和集群提供了足 够的时间，可以应用群落的共同发展和集群以及种 群密度的相互关系评价有毒物质的毒理学效应。

三、DNA损伤试验
(一)DNA断裂检测方法——单细胞凝胶电泳技术
1. 单细胞凝胶电泳技术的特点及原理 单细胞凝胶电泳实验能检测细胞群中DNA损 伤与修复在细胞间的差异。 被认为是低水平辐射等胁迫条件下检测DNA 损伤的快速、灵敏方法。 在检测诱变剂、射线、环境污染物等对生物 体DNA的损伤等方面具有广泛的应用价值。

(二)PCR—SSCP的基本过程
1.
PCR扩增 2. PCR产物单链凝胶电泳 3. 结果分析
PCR产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性
产生单链，单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不 同， 一般形成两条单链带。变性不彻底时，残 留双链亦可形成一条带，所以，PCR-SSCP分析 结果常可见到三条带。 如果与正常对照相比，两条单链形成的条带相对 位置有了改变，则表明有碱基突变存在。
细胞DNA受损愈严重，产生的断片亦愈多，
其断片也就愈小，在电场中移动的DNA量 多，移动的距离长，表现为尾长增加和尾部 荧光强度增强。 因此，通过测定彗星尾部DNA百分含量和 尾长就成了DNA断裂的重要定量参数，从 而即可定量地测定单个细胞DNA损伤的程 度。
2．细胞样品处理及单细胞凝胶电泳过程 (1)细胞样品处理 (2)单细胞凝胶电泳试验程序

(三)室外水生微宇宙
对于水生微宇宙来说，标准化微宇宙和烧杯水生微 宇宙仅仅是建立在实验室的小型微宇宙，其生物群 落中没有包括大型的捕食者如鱼类。 在20世纪80年代末和90年代初建立了比标准化微宇 宙更大的一种室外微宇宙系统，称之为室外水生微 宇宙(outdoor aquatic microcosm)，又被称为中 宇宙(mesocosm)。 中宇宙是规模较大的模型生态系统，结构复杂，功 能完善，是自然生态系统的缩影。 由于该宇宙系统最初建立是为农药登记制度服务， 评价农约对非靶生物的影响，因此又被称之为Fifra 微宇宙。
每个受损伤细胞在电泳时，其DNA从核
中向阳极伸展，形成一个亮光头部和尾 部，形似彗星．故又名彗星试验(comet assay) 如果细胞末受损伤，电泳时细胞核DNA 因其相对分于质量大停留在细胞核基质 中，荧光染色后呈现圆形的荧光团，无 拖尾现象。
若细胞受损，在中性电泳液中(PH＝8)中，
核DNA仍保持双螺旋结构，虽然偶有单 链断裂，但不影响DNA双螺旋大分子的 连续性。只有当DNA双链断裂时，其断 片进入凝胶中，电泳时断片向阳极移动， 形成荧光拖尾现象，形似彗星。 如果在碱性电泳液(PH>13)中，先是DNA 双链解螺旋且变性为单链，单链断裂的碎 片分子可进入凝胶中，电泳时碎片向阳极 移动，形成拖尾。
chromatide exchange test, SCE)。每条染色体是由两 个染色单体组成，一条染色体的两个染色 单体间DNA的相互交换，即同源位点复制 产物间的DNA互换，称姐妹染色单体互换， 它可能与DNA断裂和重联相关，但其形成 的分子基础仍然不明。
二、荧光原位杂交技术
(一)荧光原位杂交的原理及特点
细胞染色体畸变一 直是生态毒理学家广泛研究的热 点之一。随着分子生物学技术的发展，国内外正致 力于研究新的检测染色体畸变的方法，原位杂交(in situ hybridization, ISH)就是其中的一种，它是由 Gall等和John两个小组于1969年发明的。 原位杂交是利用标记探针与组织、细胞或染色体的 DNA进行杂交，对细胞中的待测核酸进行定位、定 性或相对定量分析。

室外水生微宇宙的每个试验单元为6m3，除浮游植 物、浮游动物和细菌外，生物群落还包括鱼类、大 型水生植物和无脊椎动物，其设计条件列入表3.6。 室外水生微宇宙的设计具有较大的弹性，它可以是 一个小型池塘。 在室外水生微宇宙的设计中，控制试验重复组达到 统一温度的基本方法有两个：

一是把试验装置设置在地下，以土壤作为温度调控器，
此方法被广泛地采用； 二是以水作为温度调控器，把试验装置设置在一个池塘 中，有些试验装置设置了遮棚，以防止试验溶液蒸发过 快。
Leabharlann Baidu
室外水生微宇宙不仅可以研究有毒物质对水
生态系统的影响，而且可以研究化学毒物在 水环境中的迁移、转化、归宿和生态系统结 构、功能影响，以此评价污染物在生态系统 水平上的整体效应。 尽管室外水生微宇宙有许多优点，但也存在 一些缺陷：
assay)是近 期较常用的DNA加合物的半定量检测方法， 它由Randerath于1981年建立。该法的基本 原理是，与外源性物质形成加合物的单核苷 酸，可抵制酸酶的降解，并被标记上32P，从 而通过放射性的定量分析检测所形成的DNA 加合物。
(二)姐妹染色单体交换试验
姐妹染色单体交换试验(sister
2．荧光法
该法的原理是通过某些化合物DNA加合物具
有荧光特性而进行定量。 常见的技术有同步荧光法、低温激光法和激 光—发射荧光法。 荧光法的长处是不破坏DNA链，并可区分出 加合物的不同立体异构体及DNA链不同位点 上的加合物。
3．32P-后标记法
32P后标记法(32P-postlabeling

(四)PCR—SSCP技术在毒理学研究中的应用
如Maino等在1992年将该项技术引入化学致
癌分子机制的研究领域，在化学制癌剂诱变 的小鼠鳞状癌细胞中检出了特异性H-ras基因 第13位密码子的点突变。 谭明家等于1997年以甲基丙烯酸环氧丙酰 (GMA)体外诱导人胚肺成纤维细胞，分离转 化细胞克隆，应用PCR扩增P53基因第5和第 8外显子的DNA片段，银染单链构型多态分 析，发现经三次GMA处理后，p53基因第8外 显子发生突变。

微宇宙既可以被应用于研究自然生态系统的
结构和功能，也可以被应用于污染物生态系 统。 对污染生态系统的研究，
可以研究污染物对生物和非生物组成的影响；
污染物在生物和非生物组成中的分布；
研究污染物对生物—生物和生物—非生物之间相
互作用。 研究的污染物包括有毒化学污染物如杀虫剂，营 养元素如氮、磷等。
(二)DNA-加合物的测定
污染物如多环芳烃等，被生物体吸收后，
经过代谢转化为活性的亲电物质。这些亲 电化合物能与DNA共价结合形成DNA结合 物，从而引起DNA结构的改变。 DNA加合物的形成是生物体对外源物质的 吸收、代谢等诸多过程的综合结果，它一 旦逃避自身的修复，就可能成为化学致癌、 致畸、致突变性的最小因子。

(二)模拟农田生态系统
这类生态系统是模拟农田条件，而没有陆地动物。 应用最广泛的是纳什等发展的农业生态系统，它是 为同时测定农药在土壤、植物、水溶液和空气中的 残留而设计的。 该系统由容积为0.75m3的矩形玻璃室组成，内装厚 度为15cm以上的土壤层。设有收集土壤沥滤液和 地表水的小孔、水管口和空气出口，以及一些喷水 装置和测试探讨的小孔。系统内各种作物可以从生 长到成熟。
(三)PCR—SSCP分析技术的特点
1．PCR—SSCP的优点
PCR—SSCP技术的原理明确，操作简单，不需要 特殊仪器，技术容易掌握； 试验步骤少、速度快、周期短； 检测灵敏度高，一般无假阳性结果； 可运用于大样本筛选； 可有效检测PCR产物中两侧引物间的基因变异，既 可检出单碱基置换，又可检出多碱基插入或缺失等。
1)制片； 2)裂解细胞； 3)电泳； 4)染色； 5)图像分析。
3．单细胞凝胶电泳技术在生态毒理学研究中的 应用 (1)DNA损伤与修复的研究 己对多种化学物质诱导的DNA损伤作用作 过检测，如金属化合物、氧化剂、烷化剂和 交联剂等。 (2)遗传毒性评价 (3)生物监测 SCGE首先应用于放射监测，目前多以人 外周血淋巴细胞作为材料。 (4)细胞凋亡的研究
所有数据分析用华盛顿大学化学品研究、发
展和工程中心开发的数据分析计算机软件进 行(macintosh compatible data analysis system, SAMA)， 计算的参数包括溶解氧、溶解氧增加和损失、 营养物的浓度、光合作用与呼吸作用比率 (P/R)、pH值、藻类的密度、水蚤繁殖率和 藻的生物体积，对每次采样测定数据进行统 计差异比较。

该系统能用于测量下列变化：

1)单次或重复多次使用后，测定农药从植物或 土壤中的挥发性。 2)模拟下雨对农药迁移的影响。 3)农药在土壤中的残留。 4)农药被植物摄入和在植物体内的滞留。
第三节 分子及细胞生态毒理方法
生物在受害致死以前，其行为、生理、生化
已发生反应，可以选择这些在分子和细胞水 平上的指标测定污染物对生物的影响。 由于这些指标具有测定周期短、灵敏的特点， 故亦可对化学品的筛选及其可能造成的环境 影响作出更为准确的预测。
一、PCR-SSCP技术
(一)PCR-SSCP的基本原理
单链DNA由于有链内碱基配对而具有一定的空间结 构，当DNA链上的碱基 (即使是一个碱基)发生改变 时，单链DNA会形成不同的构象，称为单链构象多 态性(single strand conformation polymorphism， SSCP)。 PCR-SSCP是PCR技术与SSCP的结合，是将被检 出的DNA事先经有标志物的引物或参与PCR反应， PCR扩增产物经加热变性后，单链产物经中性聚丙 烯酰胺电泳，靶DNA中如有突变存在(如单碱基置 换、碱基插入或缺失等)，它们因迁移率变化而出现 泳动变位。
一、微宇宙法简介
微宇宙法是研究污染物在生物种群、群落、生态系 统和生物圈水平上生物效应的一种方法，又被称为 模型生态系统法(model ecosystem)。 微宇宙是自然生态系统的一部分，包括有生物和非 生物的组织及其过程，能提供自然生态系统的群落 结构和功能。 但又不完全等于自然生态系统，没有自然生态系统 庞大和复杂，不能包含自然生态系统的所有组成， 例如大树、大的食草动物、食肉动物和鸟类，也不 能包括自然生态系统的所有过程，例如，岩石的风 化作用、土壤的侵蚀过程等。
试验方法和重复组间的方差较大； 由于试验设置在特定地区的室外，因而受地区的
环境因素(如温度)的影响较大； 试验生物大多数是地方种．其结果仅能表明有毒 物质在一个地区的生物效应和归宿。
三、土壤微宇宙毒性试验
(一)土壤核心微宇宙
土壤核心微宇宙(soil microcosm, SCM)是用于研 究外源性化合物对农业生态系统及其中生长的植物、 土壤无脊椎动物和微生物影响的一种陆生微宇宙， 其基本试验设计条件列入表3.7。 土壤核心微宁宙是采自野外环境的土壤核心，将其 设置在环境条件控制的实验室中。土壤核心微宇宙 可以研究化学物质和营养元素对农业生态环境的影 响及其环境归趋。
DNA的这种加合损伤是DNA化学损伤的主
要形式之一。定量测定DNA加合物即可初 步判定样品的遗传毒性。 DNA加合物测定方法除各种层析法及DNA 指纹技术(如RAPD)外，主要有以下三大 类。
1．免疫法
基本原理是先通过免疫的方法获得特定的
DNA加合物的单克隆或多克隆抗体，然后 将血清中得到的抗体包被于微孔板中，最 后通过酶联免疫（ELISA）的方法，将样 品与所包被的DNA加合物抗体竞争性地结 合，进而分析所产生的DNA加合物。
二、水生微宇宙毒性试验
(一)标准化水生微宇宙
标准化水生微宇宙(standardized
aquatic microcosm, SAM)是由Frieda Taub和他的 同事发展和建立，用于在实验室测定有毒物 质在多种水平对淡水生态系统的影响。 该试验时间为64天。试验设计的条件见表3.4。 试验容器为4L的玻璃广口瓶