第七章 柠檬酸发酵机制
柠檬酸发酵的原理
柠檬酸发酵的原理柠檬酸是一种有机酸，化学式为C6H8O7。
它常见于柠檬、橙、柚子等柑橘类水果中，具有酸味和鲜味。
柠檬酸的发酵是指通过微生物在适宜环境条件下对柠檬酸底物进行代谢分解，产生新的化合物、气体或能量的过程。
柠檬酸发酵的过程可以分为两个阶段：引入柠檬酸菌和发酵反应。
首先，柠檬酸发酵的关键是引入柠檬酸菌。
柠檬酸菌是一类嗜酸性细菌，它们广泛存在于自然界中，常见于各种水果、土壤、植物等环境中。
这些细菌具有代谢柠檬酸的能力，并能分解柠檬酸为其他代谢产物。
在适宜的生长条件下，柠檬酸菌会在培养基中生长和繁殖。
柠檬酸菌需要一定的温度、pH值以及营养物质供应，如碳源、氮源、矿物盐等。
这些条件对于维持菌体生长和代谢活性都非常重要。
当柠檬酸菌引入培养基后，它们会开始与柠檬酸底物进行代谢，进而引发柠檬酸的发酵。
柠檬酸发酵可产生以下代谢产物。
首先，柠檬酸菌代谢柠檬酸的初始酶是柠檬酸酶，将柠檬酸分解为顺式-脱氢异柠檬酸。
柠檬酸酶存在于柠檬酸菌的细胞内。
随后，顺式-脱氢异柠檬酸经过酶促反应被还原为'顺式'脱氢酶异柠檬酸，再被脱氢酶反应转化为柠檬酸。
接下来，由于柠檬酸发酵过程中柠檬酸的分解和合成是相互竞争的，此时代谢产物多取决于柠檬酸菌生长条件的调节。
在有氧条件下（即有足够的氧气供应），柠檬酸将被完全代谢为二氧化碳和水，释放能量。
此时发酵的产物主要是气体，如二氧化碳。
这种情况下，柠檬酸发酵可以在其它微生物中应用。
然而，当在缺氧条件下进行柠檬酸发酵时（如在发酵罐中），由于氧气供应不足，柠檬酸菌会进一步代谢柠檬酸。
在此情况下，发酵的产物主要是有机酸，如乳酸、丙酸等。
这种发酵过程称为无氧呼吸。
结合柠檬酸菌自身特点和提供的环境条件，可以选择调控发酵过程中柠檬酸的转化路径，实现不同发酵产品的生产。
总结起来，柠檬酸发酵的原理是通过引入柠檬酸菌并在适宜条件下提供营养物质，利用柠檬酸菌的代谢能力，将柠檬酸转化为新的化合物。
柠檬酸发酵机制
柠檬酸发酵机制柠檬酸生产分发酵和提取两部分。
发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。
固态发酵是以薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的农副产品为原料，配好培养基后，在常压下蒸煮，冷却至接种温度，接入种曲，装入曲盘，在一定温度和湿度条件下发酵。
采用固态发酵生产柠檬酸，设备简单，操作容易。
液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。
发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。
深层发酵生产柠檬酸的主体设备是发酵罐。
微生物在这个密闭容器内繁殖与发酵。
现多采用通用发酵罐。
它的主要部件包括罐体、搅拌器、冷却装置、空气分布装置、消泡器，轴封及其他附属装置。
发酵罐径高比例一般是1:2.5，应能承受一定的压力，并有良好的密封性。
除通用式发酵罐外，还可采用带升式发酵罐、塔式发酵罐和喷射自吸式发酵罐等。
为了得到产柠檬酸的优良菌种，通常是从不同地区采集的土壤或从腐烂的水果中分离筛选，然后通过物理和化学方法进行菌种选育。
例如薯干粉深层发酵柠檬酸的菌种就是通过不断变异和选育得到的。
菌种适合在高浓度下发酵，产酸水平较高。
柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温度、通风量及pH值等条件。
一般认为，黑曲霉适合在28～30℃时产酸。
温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。
微生物生成柠檬酸要求低pH，最适pH为2～4，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。
柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量。
通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。
随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。
采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60%饱和度对产酸有利。
柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下降。
柠檬酸发酵机理
通过调整发酵温度和pH值，找到最适 宜的发酵条件，以提高柠檬酸的产量 和降低能耗。
产物的分离与纯化技术改进
分离技术
采用新型的分离技术，如超滤、纳滤、反渗透等，实现柠檬酸的高效分离和纯 化，降低分离成本。
纯化技术
采用结晶、离子交换、吸附等纯化技术，进一步提高柠檬酸的纯度，满足不同 应用需求。
细菌
某些细菌如柠檬酸杆菌、 氧化杆菌等也可以进行柠 檬酸发酵。
微生物的代谢途径
葡萄糖代谢
微生物将葡萄糖通过糖酵解途径 转化为丙酮酸，这是柠檬酸发酵 的起始步骤。
丙酮酸代谢
丙酮酸在丙酮酸羧化酶的作用下 转化为草酰乙酸，再经过三羧酸 循环转化为柠檬酸。
乙酰CoA的合成
在柠檬酸发酵过程中，乙酰CoA 是重要的中间代谢产物，可以用 于合成脂肪酸等物质。
厌氧发酵
微生物在厌氧条件下，将葡萄糖或其他糖类转化 为丙酮酸，再经过一系列反应生成柠檬酸。
3
好氧发酵
微生物在好氧条件下，通过糖酵解途径将葡萄糖 转化为丙酮酸，再经过氧化脱羧等反应生成柠檬 酸。
柠檬酸发酵的分类
黑曲霉发酵
黑曲霉在好氧条件下进行发酵，通过糖酵解途径将葡萄糖转化为 丙酮酸，再经过氧化脱羧等反应生成柠檬酸。
产物提取与精制
过滤分离
将发酵液进行过滤，分 离出菌体和未消耗的原
料。
离子交换
利用离子交换剂吸附柠 檬酸离子，与其他离子 进行交换，实现柠檬酸
的分离。
浓缩结晶
将分离出的柠檬酸溶液 进行浓缩和冷却，促使
柠檬酸结晶析出。
干燥与包装
将结晶的柠檬酸进行干 燥和包装，得到符合标
准的柠檬酸产品。
05 柠檬酸发酵的优化与改进
柠檬酸发酵机制
BY 白云仙 吴雪琴 廖文翡 邵文博 杨亚蓝 吕 佩 纪星浩
CONTENTS
• • • • 概述 柠檬酸的生物合成途径 柠檬酸生物合成的代谢调节 柠檬酸的积累机制归纳
一、概述
• 柠檬酸又名枸 橼酸，学名α羟基丙烷三羧 酸，是生物体 主要代谢产物 之一。
性质： 分子式C6H8O7，分子量192.12 有两种形式 水合物：100℃时融解，密度 1.542g/cm3(18℃) 无水物：无色晶体或粉末，熔点 153℃ 有强酸味。溶于水、乙醇和乙醚
但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是
黑曲霉TCA环的第一个特点。
• 顺乌头酸酶失活，阻断TCA环是柠檬酸积累的必 要条件，顺乌头酸水合酶需要Fe2＋。顺乌头酸酶、 异柠檬酸酶在pH2.0时失活，线粒体顺乌头酸酶在 催化时有柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7
的平衡，这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累
四、柠檬酸的积累机制归纳：
① Mn2+缺 乏 抑制蛋 白合成 NH4
+
有一条呼吸活力强的不产生ATP 的侧系呼吸链
解除磷酸果糖激酶 的代谢调节，促进 EMP途径的畅通
② 由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。
③丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2固定两个反 应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了 合成柠檬酸的能力。
生产历史
• 1784年瑞典化学家 Scheel 首次从柠檬汁中 提取出柠檬酸，并制成结晶。 • 1913年 Zahorski 首先利用黑曲霉生产柠檬酸。 • 1919比利时一家工厂成功的利用浅盘发酵 法实现了柠檬酸的工业化生产。 • 1952年美国 Miles 实验室公司采用深层发酵 法大规模生产柠檬酸获得成功，促进了柠 檬酸工业的发展，2005年世界柠檬酸产量 达到140万t左右。
柠檬酸发酵及产物提取
综合实验：柠檬酸发酵及产物提取（一）柠檬酸发酵一、实验原理柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羟生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。
但就柠檬酸产生菌而言，由于其乌头酸流水作业事酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式：2 C6H12O6 +3 O2→2 C6H8O7 +4 H2O国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。
二、实验器材（一）材料1．菌种：黑曲霉2．蔗糖、硫酸铵等（二）主要仪器设备1．旋转式摇床、超净工作台、15L发酵罐等三、操作步骤1．种子培养基制备：马铃薯培养基配方:(1000ml)马铃薯（去皮）200g葡萄糖（或蔗糖）20g琼脂15~25g水1000ml自然pH2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。
3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。
4．发酵培养基制备：蔗糖15%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁7水0.025%。
5. 上罐灭菌（操作同实验一）5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的5%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、500转条件下发酵4天。
6.分别在0,24,48,72,96小时测定一下参数。
四、实验结果1．对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。
2．测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。
3．计算柠檬酸发酵的转化率，即每100克葡萄糖经转化所能生成的柠檬酸克数，柠檬酸酵的理论转化率按下列反应计算应为106.7%。
《柠檬酸发酵》课件
柠檬酸发酵的未来发展
生物技术进步
随着生物技术的不断发展，未来有望通过基因编辑和合成 生物学手段进一步提高柠檬酸发酵的产量和效率。
环保要求
随着环保意识的增强，开发低污染或无污染的柠檬酸发酵 工艺将成为未来研究的重要方向。
智能化发酵
借助物联网、大数据和人工智能等技术，实现柠檬酸发酵 过程的智能化监控和管理，提高生产效率和产品质量。
无水硫酸铵
作为氮源，提供菌种生长所需的氮元素。
玉米浆
含有丰富的维生素、氨基酸和生长因子，有 助于菌种的生长和代谢。
磷酸二氢钾
提供磷元素和钾元素，有助于菌种的正常代 谢。
菌种接种与发酵
菌种选择
选择高产柠檬酸的菌种，如黑曲霉、 青霉等。
接种量
根据发酵罐的大小和生产能力，确定 适宜的接种量，以保证发酵效率。
在缺氧条件下，菌体会进行厌氧呼吸，产生乳酸或乙醇等副产物，而不是柠檬酸 。因此，需要提供足够的氧来支持菌体的有氧代谢，从而获得高产量柠檬酸。
营养物质对柠檬酸发酵的影响
营养物质是柠檬酸发酵过程中的基础物质，包括碳源、氮源 、磷源和无机盐等。
不同的营养物质对柠檬酸发酵的影响不同。通过实验研究， 可以确定最佳的营养物质配比，以提高柠檬酸的产量。此外 ，添加一些生长因子或酶抑制剂也可以调节菌体的代谢途径 ，从而影响柠檬酸的产量。
柠檬酸发酵的控制策略
参数控制
通过控制温度、pH、溶氧浓度等关键 参数，保证发酵过程在最佳条件下进行
。
分离纯化
采用高效的分离纯化技术，如离子交 换、吸附、萃取等，将柠檬酸从发酵
液中提取出来。
补料控制
根据发酵过程的实时监测数据，适时 添加必要营养物质，避免因缺乏某些 关键成分而影响发酵。
7 麦明谦 柠檬酸的发酵
柠檬酸的发酵一．实验简介柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸或2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸，是水果中含量极为丰富的一种有机酸。
目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸，黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径为：首先将玉米中的淀粉转变为葡萄糖，葡萄糖经过酵解途径（EMP）和HMP途径转变为丙酮酸，丙酮酸再由氧化酶氧化成乙酸和二氧化碳，继而经乙酰磷酸形成乙酰CoA,然后在柠檬酸合成酶的作用下生产柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰离子等金属离子的条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的a-酮戊二酸脱氢酶受到阻遏，TCA循环变成“马蹄形”代谢汇集于柠檬酸处，使柠檬酸大量积累，达到生产的目的。
二．实验的试剂和材料玉米淀粉、黑曲霉、a-淀粉酶、水、碳酸钙、无菌水、0.1429mol/LNaoH、酚酞指示剂三．实验仪器及设备三角瓶300ml 、玻璃棒、电子称、摇床、水浴锅、高压灭菌移液管、带塞的三角、接种环四．实验步骤1.黑曲霉孢子悬液的制备:(1)培养基的配制①配方：硝酸钠1.5g 磷酸氢钾0.5g 硫酸镁0.25g 氯化钾0.25g 硫酸亚铁0.005g 蔗糖15g 琼脂10g 蒸馏水500ml PH 5.0-6.0②称量：按照培养基配方，依次准确地称取药品，放入烧杯中。
③熔化：量取自来水，加入所需水量的一部分至上述烧杯中，用玻璃棒搅拌，待药品溶解后，加入琼脂，倒入余下的水，在电热板上加热熔化。
④定容：将加热后的培养基倒入量筒中，用自来水进行定容，至500ml。
⑤调PH：待培养基稍冷却后，用精密的PH试纸测量培养基的原始PH，若偏酸，用1mol/LnaoH边滴边加边搅拌，使之达到PH5.0-6.0；若偏碱，则用1mol/L调节。
⑥分装：用分装装置将培养基装入培养皿中，高度在培养皿高度的三分之一左右。
⑦灭菌：将培养皿用牛皮纸包扎好，放在0.1Mpa，121℃，20min 高压蒸汽灭菌。
柠檬酸发酵机制
一、柠檬酸合成途径
Hale Waihona Puke 葡 EMP途径氧化脱羧 丙
乙酰-CoA
柠
萄 糖
酮 羧化 酸
草酰乙酸
檬 酸
•
1953年，Jagnnathan等证实了黑曲霉
中存在EMP途径的所有酶；
• 1954年，Shu提出葡萄糖分解代谢中约80
％走EMP途径；
• 1958年，MeDomough等发现黑曲霉还 存在HMP途径的酶，但HMP途径主要存在于
孢子形成阶段；
• 1954－1955年，Ramakrishman和 Martin研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环；
淀粉
葡萄糖
6-磷酸果糖
1，6-二磷酸果糖
• （3）TCA循环的阻断微弱，导致循环 中间代谢物积累。由于各种酶处于平衡 状态，使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超 过一定水平时，就通过抑止异柠檬酸脱 氢酶活力来提高自身的积累。
柠檬酸的积累机制归纳：
①Mn2+ 缺乏
抑制蛋白
合成
NH﹢4
有一条呼吸活力强的不产生ATP 的侧系呼吸链
解除磷酸果糖激酶 的代谢调节，促进 EMP途径的畅通
抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有 激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果 糖激酶的抑制作用。
• 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是 由于细胞内浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积 累的大量柠檬酸不敏感。
淀粉
葡萄糖
Pi
+ NH4
K+
6-磷酸果糖
柠檬酸发酵原理
去除阳离子杂质： 树脂进行离子交换，当有pH的溶液流出时，表示已有柠 檬酸流出，开始收集。 浓缩： 减压浓缩 结晶： 缓慢搅拌 缺点： 劳动强度大，设备易腐蚀，提取率仅70%左右，同时造 成环境污染。
谢 谢！
柠檬酸发酵工艺流程
主要内容
柠檬酸简介 菌种制备过程 黑曲霉发酵柠檬酸的机制 柠檬酸的发酵生产 柠檬酸的分离 提取
柠檬酸简介
•柠檬酸是一种重要的有机酸，又名枸橼酸，无色晶体， 常含一分子结晶水，无臭，有很强的酸味，易溶于水。
用途： • 用于香料或作为饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多 价螯合剂，也是化学中间体。 • 柠檬酸与钙离子结合则成可溶性络合物，能缓解钙离子 促使血液凝固的作用，可预防和治疗高血压和心肌梗死。 所以可以起抗凝血作用。所以柠檬酸钠和草酸钠被称为抗 凝血剂。柠檬酸促进脂肪分解，快速实现减肥。
柠檬酸钙的生成： 发酵结束后滤去菌丝，滤液按总酸量的70% 加入碳酸钙 粉进行中和，随后煮沸柠檬酸钙沉淀出来，在95℃以上 高温时柠檬酸钙 溶解度低，而其他有机酸的钙盐溶解度 高，热水洗涤干净。
硫酸置换反应： 将洗净的柠檬酸加水搅成糊状，在搅拌下加入浓硫酸，温 度80℃以上，硫酸与钙离子形成硫酸钙沉淀下来，将柠 檬酸置换出来。硫酸的用量约为加入碳酸钙的85%-90%。 严格控制温度。
菌种制备过程
工业生产几乎都是用黑曲霉作为生产菌 黑曲霉产酸量高，转化率也高。且能利用 多种碳源，因而是柠檬酸生产的最好菌种。 菌源、平板涂布分离、挑选单菌落 、单菌落 小试管（6天）、鉴定（测酸、镜检）、制作 一代小试管、一代鉴定、制作二代茄子瓶、二 代鉴定、制作麸[fū]曲、鉴定、储藏
柠檬酸酒精等的发酵生产
19
1. 淀粉质和纤维质原料的水解
淀粉的糊化、液化
淀粉在水中经加热会吸收一部分水而 发生溶胀。如果继续加热至一定温度（ 一般60～80℃）,淀粉粒即发生破裂,造 成黏度迅速增大,体积也随之迅速变大, 这种现象称为淀粉的糊化
1. 淀粉质和纤维质原料的水解
不同种类淀粉糊化温度有所不同, 苷薯、马铃薯、玉米和小麦淀粉的 糊 化 温 度 分 别 为 70 ～ 76℃ 、 59 ～ 67℃ 、 64 ～ 72℃ 和 65 ～ 68℃ 。 发 生 糊化现象称为淀粉的溶解，或称为 液化。马铃薯、小麦和玉米支链淀 粉 完 全 液 化 的 温 度 为 132℃ 、 70 ～ 80℃、136～141℃和146～151℃。
24
淀粉质原料酒精生产工艺流程
•
大米 曲霉菌 麸皮 淀粉质原料
酵母
•
↓
↓
米曲霉→米曲
固体试管酵母
•
↓
↓
•
米曲汁→试管培养→三角瓶培养 粉碎
三角瓶液体酵母
•
↓
↓
ห้องสมุดไป่ตู้
↓
•
曲种
蒸煮
卡式罐酒母
•
↓
↓
↓
•
糖化曲液 糖化→酒母糖化醪→小酒母
•
↓
↓
•
发酵
大酒母
•
↓
•
蒸馏
•
↓
•
•
酒糟废液 酒精 杂醇油
米曲汁
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淀粉颗粒→淀粉分子→可发酵性糖→酒精→95％乙醇 (C6H10O5)n+nH2O→nC6H12O6→2nC2H6O+2nCO2+2nATP
现在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌”（大肠杆菌） 高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的先锋霉素（头孢菌 素类）、氨苄青霉素，就是这类半合成抗生素类药物。
柠檬酸发酵的原理及应用
柠檬酸发酵的原理及应用原理介绍柠檬酸（C6H8O7）是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、饮料、医药等领域。
柠檬酸可以通过发酵过程来生产，其发酵原理主要包括以下几个方面：1.发酵菌种选择：柠檬酸发酵常用的菌种包括柠檬酸杆菌、黄曲霉等。
这些菌种具有较高的柠檬酸产量和较短的发酵周期，适合用于大规模生产。
2.基质选择：发酵过程中的基质是维持菌种生长和柠檬酸产量的关键因素。
常用的基质包括糖类（如葡萄糖、果糖）、淀粉、甘油等。
不同基质的选择会对柠檬酸的产量和品质产生影响。
3.发酵条件调控：发酵条件的调控对柠檬酸发酵的效果起着重要作用。
包括温度、pH值、搅拌速度、氧气供应等参数的调节，可以影响菌种生长和柠檬酸产量。
应用领域柠檬酸作为一种重要的食品和工业原料，在多个领域有广泛的应用。
以下列举了柠檬酸几个主要的应用领域：1. 食品和饮料工业•柠檬酸作为酸味调节剂，广泛用于饮料、果汁、果酱、糖果等食品的制作中，能够增加食品的酸味，提升口感。
•柠檬酸还可以作为乳化剂、稳定剂，用于调制乳制品、冷饮、糕点等，具有增加食品的稳定性和保质期的作用。
2. 医药和化妆品行业•柠檬酸作为医药中间体，可以用于制备多种药物，如抗生素、止血剂、解热药等。
•在化妆品制造中，柠檬酸可以作为调节剂、抗氧化剂等，用于调整pH值、抑制细菌生长，并起到保湿、美白等作用。
3. 清洁和生活用品•柠檬酸可作为有机酸性清洁剂，可去除水垢、油脂等，并且具有良好的环境友好性。
•在洗涤剂和洗衣粉中，柠檬酸可以作为增白剂，提升洗涤效果。
4. 金属清洁和锈蚀保护•柠檬酸可以与金属表面形成络合物，在清洁金属表面时起到去污、去锈蚀的作用。
•柠檬酸也可以用于金属防锈处理，形成覆盖层来阻止金属进一步生锈。
总结柠檬酸的发酵原理和应用领域涉及多个方面，其发酵原理包括酵母菌选择、基质选择和发酵条件调控等。
在食品、医药、清洁和金属保护等领域，柠檬酸具有广泛的应用，是一种重要的有机酸。
发酵机制7-8
乙醛酸循环 利用乙醇、乙酸和 烃类发酵生成柠檬酸 实际产率是理论产率 的50%。 乙醛酸循环和乙酸
发酵说明,黑曲霉、酵母等微生物都可进行柠檬酸发 酵，生成产物的菌种不同，带来的代谢途径也不同, 生物的多样性为我们提供了选择的机会。
1，从书上的研究过程发现，柠檬酸调控机制 是漫长的时间和技术进步的过程，希望我们能 够理解代谢调控的意义和实现的艰难。 2，任何代谢都有其机制以及相应的控制措施 。这对传统发酵产业的改进和技术升级意义重 大。及重大技术突破或技术创新的用武之地； 同时也为我们工程技术人员提供了用武之地。
氧对发酵的影响。 为什么黑曲霉进行柠檬酸发酵时，短时间中断供氧 会导致柠檬酸产率的急剧下降，但不影响生长？ 因为：黑曲霉发酵柠檬酸时有2条呼吸链，一条标准 呼吸链，产生ATP；一条侧呼吸链，不产生ATP，受 水杨酰异羟肟酸（SHAM）的强烈抑制。
氧对发酵的影响。 当缺氧时，EMP途径和丙酮酸脱氢生成的NADH2无 法氧化而积累SHAM，导致侧呼吸链受阻；同时， 经过标准呼吸链氧化时，生成的ATP又反馈抑制磷 酸果糖激酶(PFK)，从而导致柠檬酸产率显著下降 ，而减弱的葡萄糖消耗和ATP产生，是能够满足菌 体生长的需要，故不会影响生长。
重点：了解柠檬酸生物合成的基本原理，
并掌握其发酵调控手段。
葡萄糖 ↓① 6-磷酸葡萄糖 ↓② 1,6-二磷酸葡萄糖→磷酸二羟丙酮→甘油
↓③ 丙酮酸 → – CO2 → 乙酰CoA↘
↙↘ ↘ + 乳酸 ↓
柠檬酸
关键酶: ①己糖激酶, ②磷酸果糖激酶 ③丙酮酸激酶. 注: 乙酰CoA+草酰乙酸=柠檬酸
柠檬酸发酵的原理及工艺流程
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柠檬酸发酵的原理
柠檬酸发酵的原理
柠檬酸发酵是一种微生物发酵过程，利用某些特定菌种的代谢途径，将特定底物转化为柠檬酸。
该过程的原理涉及以下几个方面：
1. 底物选择：柠檬酸发酵的底物通常选择糖类物质，如蔗糖、葡萄糖等。
这些底物能够被发酵菌种代谢利用，产生有机酸。
2. 菌种选择：柠檬酸发酵常用的菌种是柠檬酸杆菌（Aspergillus niger）和柠檬酸假单胞菌（Yarrowia lipolytica）等。
这些菌种具有良好的柠檬酸合成能力。
3. 代谢途径：柠檬酸发酵的代谢途径主要包括三个关键步骤：
- 糖类底物酵解：底物被菌种内的酵解酶作用下分解为各种代谢物，如丙酮酸和乳酸等。
- 柠檬酸产生：丙酮酸在菌种内经过一系列酶催化反应，被转化为柠檬酸。
柠檬酸亦可通过川崎循环途径合成。
- 转运和排泄：合成的柠檬酸会通过菌体内部的膜通道或转运蛋白被转运至菌体外，最终被释放出来。
4. 发酵条件：柠檬酸发酵的条件包括温度、pH值、底物浓度和氧气供应等。
适宜的发酵条件能够提高菌种的活性和产酸效率。
综上所述，柠檬酸发酵利用特定菌种的代谢途径，将糖类底物转化为柠檬酸。
这一过程涉及底物的酵解、柠檬酸的合成以及其转运和排泄等关键步骤。
发酵条件的调控对于柠檬酸发酵过程的效果具有重要影响。
《柠檬酸发酵机制》课件
发酵在食品、饮料、药品和生物能源等领域具有重要的应用价值。
柠檬酸发酵的概述
柠檬酸
柠檬酸是一种有机酸，广通过微生物参与的发酵过程产生，这个过程复杂 而多样。
柠檬酸发酵的微生物参与者
1 Aspergillus niger
这个真菌物种可以产生大量的柠檬酸，并被广泛用于柠檬酸生产。
2 Yarrowia lipolytica
这个酵母菌也具有较高的柠檬酸产量，适用于工业规模生产。
柠檬酸发酵的反应过程
1
底物准备
选择适合的有机物作为柠檬酸发酵的底物。
2
发酵培养
将底物与适宜的微生物共同培养，提供适宜的温度和氧气条件。
3
柠檬酸生成
底物被微生物分解，生成柠檬酸和其他副产物。
柠檬酸发酵的影响因素
温度
适宜的温度可以促进柠檬酸生成的速率和产量。
营养物质
提供足够的营养物质，如糖类、氮源和微量元素， 有助于增加柠檬酸产量。
pH 值
不同微生物对 pH 值的要求不同，酸碱度对柠檬酸 发酵具有影响。
氧气供应
有些菌株需要适量的氧气参与发酵过程，而有些则 能在无氧条件下进行发酵。
柠檬酸发酵的应用领域
食品生产
柠檬酸在食品加工中用作风味调剂 剂和酸味调节剂。
药品工业
柠檬酸被用作制药过程中的溶剂和 酸化剂。
清洁剂生产
柠檬酸被用于生产清洁剂，具有溶 解和去污的作用。
结论和总结
1 柠檬酸发酵在许多领域具有广泛的应用 2 微生物是柠檬酸发酵的关键参与者
柠檬酸发酵技术在食品、医药和清洁剂等行业有 着重要的地位。
不同的微生物物种对柠檬酸发酵具有不同的产量 和效率。
《柠檬酸发酵机制》PPT 课件
《柠檬酸发酵机制》课件
厌氧条件
微好氧条件
在微好氧条件下，微生物通过好氧糖 酵解途径将葡萄糖转化为丙酮酸，再 经过一系列生物化学反应生成柠檬酸 。
在厌氧条件下，微生物通过糖酵解途 径将葡萄糖转化为丙酮酸，再经过一 系列生物化学反应生成柠檬酸。
柠檬酸发酵的原理
01
糖酵解途径
在厌氧条件下，微生物通过糖酵解途径将葡萄糖转化为丙酮酸的过程。
医药行业
用于生产抗生素、解热镇痛药等。
其他领域
如环保、化妆品等。
柠檬酸发酵的发展趋势
高效发酵技术
环保生产
通过优化发酵工艺和提高菌种性能，提高 柠檬酸产率。
减少柠檬酸生产过程中的环境污染，实现 绿色生产。
生物工程技术的应用
市场需求变化
利用基因工程和代谢工程手段，改良菌种 性能，提高发酵效率。
随着人们对健康和环保意识的提高，对天 然、健康的食品添加剂需求增加，柠檬酸 作为天然食品添加剂的市场前景广阔。
实验操作步骤与注意事项
菌种接种与培养
按照规定的操作步骤，将菌种接种到培 养基中，控制好温度、湿度、pH等培 养条件。
取样与检测
在发酵过程中按规定时间间隔取样， 检测柠檬酸含量等指标，记录数据。
发酵罐操作
启动发酵罐，控制好罐内压力、温度 、溶氧等参数，确保发酵过程顺利进 行。
异常情况处理
如发现异常情况，如菌种退化、发酵 异常等，应及时采取措施处理，并记 录实验过程。
营养物质的消耗
随着菌体生长和产物生成，发 酵液中的营养物质如葡萄糖逐 渐被消耗。
代谢产物的积累
在适宜的条件下，柠檬酸等代 谢产物在发酵液中积累。
发酵过程控制的方法和策略
温度控制
保持适宜的发酵温度，有利于菌体生 长和产物生成。
第七章柠檬酸发酵机制
黑曲霉走不产ATP的侧系呼吸链，解除了对磷酸果糖激酶的抑 制，促进EMP途径畅通。
丙酮酸羧化酶不被调节控制，源源不断提供草酰乙酸。
丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA和两个CO2固定反应的平衡，
及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。
顺乌头酸水合酶催化建立柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：
3：7的平衡，造成柠檬酸最初的积累。
柠檬酸的积累使pH值下降，抑制了异柠檬酸脱氢酶和顺乌头
酸水合酶的活力，促进了自身进一步积累。
调节措施（总结）
1、菌种
选育优良菌株
2、发酵条件
锰离子缺乏 有氧 控制Fe2+含量 pH值2.0-2.5左右
课后思考题
柠檬酸的生物合成途径图 黑曲霉生产柠檬酸，有那些特有的优势？ 柠檬酸为什么能过量积累？ 柠檬酸生产调节措施？
磷酸二羟丙酮 ← 1，6-二磷酸果糖 → 3-磷酸甘油醛
磷酸烯醇式丙酮酸
↓
EMP途径
草酰乙酸 ← 丙酮酸 → 乙酰-CoA
↑
↓
苹果酸 ↑
延胡索酸
TCA循环
柠檬酸
↓
顺乌头酸
↑
↓
琥珀酸 ← α -酮戊二酸 ← 异柠檬酸
葡萄糖 → 6-磷酸葡萄糖 → 6-磷酸果糖
已糖激酶
磷酸果糖激酶
磷酸二羟丙酮 ← 1，6-二磷酸果糖 → 3-磷酸甘油醛
磷酸烯醇式丙酮酸
丙酮酸羧化酶 ↓ 丙酮酸激酶
关键酶
→
草酰乙酸 ← 丙酮酸 → 乙酰-CoA
↑
↓
苹果酸
柠檬酸合成酶
柠檬酸
↑
延胡索酸α-酮戊二酸脱氢酶
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顺乌头酸
→
第三节 柠檬酸代谢调节机制
自主学习并讨论以下问题（P63-69)：
柠檬酸和ATP抑制磷酸果糖激酶，柠檬酸过量积累与EMP途 径的畅通存在尖锐的矛盾，这个矛盾如何解决？ 柠檬酸要过量积累，三羧酸循环的大部分必然被阻断，那 么草酰乙酸从何而来？
黑曲霉生产柠檬酸，有那些特有的优势？
柠檬酸为什么能过量积累？
丙酮酸羧化酶不被调节控制，源源不断提供草酰乙酸。
丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA和两个CO2固定反应的平衡，
及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。
顺乌头酸水合酶催化建立柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：
3：7的平衡，造成柠檬酸最初的积累。
柠檬酸的积累使pH值下降，抑制了异柠檬酸脱氢酶和顺乌头
温故知新
1、糖酵解与巴斯德效应的三个关键酶均是
、
和
。
2、葡萄糖经EMP途径生成 在酵母菌作用下继续生成 下继续生成 。
，在厌氧条件下， ，在乳酸菌作用
第七章
柠檬酸发酵机制
第一节
柠檬酸生物合成途径
第二节
柠檬酸代谢调节机制
第一节
研究历程
柠檬酸生物合成途径
黑曲霉能够利用糖类、乙醇和醋酸等发酵生成柠檬酸 柠檬酸是由草酰乙酸和醋酸合成的
已糖激酶 磷酸果糖激酶
磷酸二羟丙酮 ← 1，6-二磷酸果糖 → 3-磷酸甘油醛 磷酸烯醇式丙酮酸
丙酮酸羧化酶 ↓ 丙酮酸激酶
关键酶
↓
草酰乙酸 ← ↑
苹果酸 ↑
延胡索酸
α-酮戊二酸脱氢酶 异柠檬酸脱氢酶
↓ ↑ 琥珀酸 ← α -酮戊二酸 ← 异柠檬酸
→
檬酸
↓ 顺乌头酸水合酶
柠檬酸过量积累与EMP途径畅通 的矛盾如何解决？
锰离子缺乏抑制蛋白质合成，导致细胞内NH4+浓度升高，
解除了柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制。
有氧时黑曲霉走不产ATP的侧系呼吸链，解除了ATP对磷酸
果糖激酶的抑制。
草酰乙酸从何而来？
丙酮酸羧化酶 PYR（丙酮酸）+CO2→→→→→→→草酰乙酸+ADP+Pi（Keq=0.818）
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 PEP （磷酸烯醇丙酮酸）+CO2→→→→草酰乙酸+ADP+ATP（Keq=0.049）
其中以第一个反应为主，为什么
黑曲霉生产柠檬酸的优势
柠檬酸为什么能过量积累
锰离子缺乏，抑制蛋白质合成，导致NH4+浓度升高，有氧时
黑曲霉走不产ATP的侧系呼吸链，解除了对磷酸果糖激酶的抑 制，促进EMP途径畅通。
酸水合酶的活力，促进了自身进一步积累。
调节措施（总结）
1、菌种
选育优良菌株
2、发酵条件
锰离子缺乏
有氧 控制Fe2+含量 pH值2.0-2.5左右
课后思考题
柠檬酸的生物合成途径图
黑曲霉生产柠檬酸，有那些特有的优势？
柠檬酸为什么能过量积累？ 柠檬酸生产调节措施？
葡萄糖 → 6-磷酸葡萄糖 → 6-磷酸果糖 磷酸二羟丙酮 ← 1，6-二磷酸果糖 → 3-磷酸甘油醛 磷酸烯醇式丙酮酸
↓
EMP途径
草酰乙酸 ← ↑
苹果酸 ↑ 延胡索酸
丙酮酸
→
乙酰-CoA
↓
柠檬酸 TCA循环
↓
顺乌头酸
↓ ↑ 琥珀酸 ← α -酮戊二酸 ← 异柠檬酸
葡萄糖 → 6-磷酸葡萄糖 → 6-磷酸果糖
黑曲霉中存在EMP途径的所有酶
黑曲霉中80%的葡萄糖分解代谢走EMP途径 黑曲霉中存在TCA的酶系
第一节
柠檬酸生物合成途径
葡萄糖经过EMP途径生成丙酮酸，一方面丙酮酸氧化脱羧 生成乙酰 -COA；另一方面丙酮酸羧化作用生成草酰乙酸， 草酰乙酸与乙酰-COA缩合生成柠檬酸。
复习EMP途径与TCA循环，画出柠檬酸生物合成途径图。