农杆菌转化原理及技术

Ti质粒结构示意图
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农杆菌侵染过程
❖ 损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号;
❖ 这些化学诱导物透过农杆菌的细胞膜,活化virA和 virG 基因,再诱导Vir区的其他基因;
❖ Vir基因的活化,作用于T-DNA的加工及T-DNA的转移;
❖ T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上;
愈伤诱导
NB培养基为基本 培养基加入相应 植物生长调节剂
共培养
整个操作过 程约需8天
第一天（预培养） 第三天（划菌） 第五天（侵染、共培养) 第八天（脱菌、筛选）
抗性愈伤的筛选与 再生成完整植株
技术关键：诱导与培养“状态良好”的胚性愈伤组织；用于转化的胚性愈伤的继 代次数不超过8代；高密度根农杆菌液侵染与共培养；干燥处理；共培养后有效 去除农杆菌或者抑制农杆菌生长（合精适品的课抗件生素及其浓度）；快速筛选（2-3次 筛选）；迅速分化再生。
❖ T-DNA在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素;
❖ 农杆菌Ti质粒上有专一性的冠瘿碱分解酶基因(ocs),该 基因启动合成各种酶,分解植物细胞产生的冠瘿碱作为惟 一的碳源和氮源;
❖ 冠瘿碱促进农杆菌的附着及激活tra基因有利于Ti质粒的 接合转移,扩大侵染范围
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根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基 因导入植物细胞并整合到核DNA上。
农杆菌介导的水稻遗传 转化原理及技术
颜静宛
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水稻遗传转化已成为水稻分子生物学
研究和遗传改良的重要技术基础
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几种常用植物基因转化方法的比较
转化方法 受体材料
农杆菌法 PEG法 电击法 微针注射法 基因枪法 花粉管通道法 完整细胞 原生质体 原生质体 原生质体 完整细胞 卵细胞
宿主范围
有
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农杆菌介导遗传转化的原理
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❖ 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，分为发根农杆菌 （导致毛状根的发生）和根癌农杆菌（导致冠瘿瘤， 冠瘿瘤细胞可产生正常细胞不能产生的冠瘿碱）。
❖ 根癌农杆菌含有可向植物转移并使植物致瘤的质粒 （Ti质粒）。
❖ 根癌农杆菌的Ti质粒包括毒性区（Vir区）、结合区 （Con区）、复制起始区（Ori区）和T-DNA区四个部分， 其中与冠瘿瘤生成有关系的是Vir区和T-DNA区。
❖ 选取自然分散、颜色鲜黄、直径约为2-3mm的颗粒状 愈伤，转接到预培养培养基中，置于27℃暗培养4天。
30-50 mg·L-1 ，pH 5.8-5.9。
❖ 5.分化培养基：NB+KT10mg·L-1+ NAA0.4 mg·L-1；pH 5.8-5.9。 ❖ 6.生根培养基：1/2MS ；pH 5.8-5.9。
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二、胚性愈伤组织的诱导及继代
❖ 取水稻授粉后15-20d的未成熟穗，将未成熟种子
剥壳，用75%乙醇浸泡1min，再转入25％的次氯酸
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Biology of A. tumefaciens
Well known to induce crown gall tuBaidu Nhomakorabeaor
A.tumefaciens lives around root surfaces (in rhizosphere where it using nutrients that leak from the root tissu
无
无
无
无 有性繁殖植物
组培条件
简单
复杂
复杂
复杂
简单
无
嵌合体比例
有
无
无
无
多
无
操作复杂性 简单
简单
复杂
复杂
复杂
简单
设备要求
便宜
便宜
昂贵
昂贵
昂贵
便宜
工作效率
高
低
低
低
高
低
单子叶植物
少
应用
可行
可行
可行
广泛
广泛
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农杆菌介导法的优点
❖ 操作简便 ❖ 外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝 ❖ 转移DNA片段明确 ❖ 可转移大片段DNA ❖ 可直接用不同的植物组织进行基因转移
钠溶液中振荡灭菌25min，于超净工作台中无菌水
冲洗3-5次，将消毒后种子的幼胚挑出并接种于诱
导培养基中，每皿约30粒，于28℃暗培养7d，切
除胚根，继续培养7d，待愈伤长大后进行继代培
养。从第三代开始可以选择适当的胚性愈伤用于
农杆菌转化。
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胚性愈伤
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三、农杆菌介导转化水稻
❖ 1. 愈伤组织的预培养
Produce callus transform callus stimulate shooting by cytokinin
addition
+ cytokinin
This procedure is easy for dicotyledone plants
(legumes etc)
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Agrobacterium tum efaciens
infects only through wound sit and actively chemotactic to th
Bacterial T-plasmid produces receptors for acetosyringone
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Plant wound produces acetosyringone
一、 培养基
❖ 基本培养基为NB培养基，愈伤诱导、转化及分化等 培养基配方如下：
❖ 1.诱导培养基：NB+2,4-D2 mg·L-1 ；pH 5.8-5.9。 ❖ 2.预培养培养基：NB+2,4-D2 mg·L-1 ；pH 5.8-5.9。 ❖ 3.共培养培养基：NB+2,4-D2 mg·L-1 +AS100 µM·L-1 ；pH 5.2。 ❖ 4.选择培养基：NB+2,4-D 2mg·L-1 + 羧苄青霉素 250mg·L-1 + Hyg
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❖ T-DNA区左右边界各有25bp的重复序列，其中14bp是核 心，分10bp（CAGGAATATAT)和4bp（GTAA)不连续的两 组，是完全保守的。
❖ Vir区为30Kb,由 VirA、VirB、VirC、VirD、VirG、 VirH等七个操纵子共24个基因起共调控作用。
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Ti plasm id w ith the new gene
+
cell’s DNA
A g ro b a cteriu m
Plant cell
Transform ation
The new gene
Transgenic plant
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C ell division
农杆菌介导转化水稻的方法
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水稻（籼稻）根癌农杆菌转化技术流程