CHO细胞表达系统

CHO细胞表达系统原理分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。

在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。

它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。

本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。

CHO细胞表达体系及其特点诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。

1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。

各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。

基因工程药物研究与开发的主要环节包括：①基因的克隆和基因工程菌的构造；②重组细胞的培养；③目的产物的分离纯化等。

针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。

随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。

大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。

此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。

真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点：①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；③具有重组基因的高效扩增和表达能力；④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高；⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的分离。

但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。

目前已有越来越多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达(表2)，其中部分药物已投放市场，倒如EPO、GCSF等。

CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。

也可以悬浮生长。

目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。

近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。

另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中加入转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM中生长良好。

与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。

且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。

表1 用于生产基因工程药物的表达系统CHO细胞表达系统常见问题及解析1．问：请问有人养过CHO细胞吗？文献报道说用DMEM培养基来养，但我不太清楚具体是高糖还是低糖？参考见解：CHO细胞用高糖DMEM养就可以了，比较好养，10%血清，小牛和胎牛都可以，长得比较慢，跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。

在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在玻璃板上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。

2．问：要转染钾通道pcDNA3.1入细胞，是选cho细胞呢还是hek293细胞？cho 细胞转染效率高吗？参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白表达出问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。

所以在做任何功能性实验之前，必须要先确认蛋白的表达，通常的实验有：1.采用免疫荧光法。

由于需要荧光二抗，比较贵。

但直观，可以确定转染效率，采用好的显微镜时，可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。

2.WESTERN-BLOT。

可以确认表达的蛋白分子量，以及表达的量。

但不直观。

3.构建一个N或C端带荧光蛋白的质粒。

这样比较费时间，同时携带的荧光（通常使用GFP）有可能干扰蛋白的正常功能。

但好处是转染后可以很方便的观察转染效率，蛋白在细胞中的位置等。

当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变，所以如果你的蛋白有表达但没有功能，首先要做一个DNA测序确认你的序列没有问题。

事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多！3．问：由于我要用CHO细胞生产基因工程抗体，用什么培养基能够很好的使之良好的生长参考见解：培养CHO细胞最好用F12，并且由于F12中加入了一些微量元素与无机离子，因此可以在血清很少的情况下应用，是无血清培养中常用的基础培养基，特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。

我们的前辈曾用F12在无血清的条件下成功的克隆出CHO细胞。

无血清培养CHO细胞有两种方法：一种是直接向试剂公司购买只适用于培养CHO细胞的无血清培养基（好像HyClone就有）；第二种方法实际上是有血清培养，只不过血清浓度很低罢了，可以近似的认为无血清。

在第二种方法里，又可以分出两条途径：你可以分步进行，也可以一步到位。

分步法是，CHO细胞先在含10％血清的常规培养基里培养，再到含5％血清的培养基里培养，再到含2.5％血清的培养基里培养，依此类推，培养基里的血清不断下降，直到一个能让CHO细胞良好生长的最低血清浓度。

一步到位法就是省去中间的步骤，直接由起点的血清浓度到终点浓度。

4．问：我要做稳定转染，表达融合蛋白并将蛋白质纯化来检测其功能。

仅仅把目的基因插入pcDNA3.1，没有插入其他的基因或者tag。

现准备转染CHO细胞。

就相关问题想问问：1.有的文献上没有署名K1或是DHFR,普通所写的CHO细胞是指那种？野生型CHO细胞又是指的哪种？2. 这三种细胞是不是因为CHO-K1和CHO/DHFR-有扩增基因GS 和DHFR,可以更为有效的扩增进而表达，比野生型CHO在转染中更起作用？3.如果就我的实验要求，CHO-K1或者CHO/DHFR-更加适合，那么转染CHO-K1是不是可以直接转染？而转染CHO-DHFR-需要和携带DHFR-的标记质粒共转染？参考见解：做稳定表达是需要把目的基因克隆到一定的载体上的，这个载体同时可以过表达一个抗性基因，如果载体整和到基因组上，这个抗性已经能够克服筛选压力，而这个时候你的目的蛋白也得到了有效的表达。

1.野生型CHO就是ＣＨＯ－Ｋ１2. CHO－DHFR-是指ＤＨＦＲ缺陷型细胞，ＤＨＦＲ作为筛选标记．3.你用pcＤＮＡ3.1的话,可以直接转染CHO-K1,加G418筛选即可. 5．问：最近作试验需要用到CHO细胞，老师从广西带回两瓶，本来用的是DMEM培养液，由于我没有接触过细胞这方面的知识，上网查了下培养液，说1640就可以，就仓促用了1640，两天过去了贴壁很不好，估计是要完了，求救。

参考见解1：1。

带回来的细胞瓶汇合度大概多少？一般送人的细胞汇合度大概80－90％，且瓶里加满培养液，再包装。

细胞生长旺盛，便于处理。

加满培养液的目的是防止运输过程中倒置，细胞接触不到培养液而死亡或活力下降。

培养时应该分瓶培养。

我想你应该分瓶了吧，我们一般1:3分瓶。

不分瓶培养可想而知了。

2。

如果上述没错的话，准备好正确的完全培养液，将生长不好的细胞瓶中的细胞消化收集，合并一下，铺底大概30％。

正常培养。

3。

关键掌握住起始细胞的密度和严格的操作。

因为这细胞已很常见。

方法正确不存在长不好的问题。

除非你的老师带回来的细胞存在问题。

参考见解2：37度预热胰酶，吸除培养瓶中的培养液，PBS（无钙镁）洗涤细胞1次后，加入少量胰酶，覆盖细胞即可。

轻轻摇动（前后左右）。

镜下观察细胞状态，一旦出现细胞回缩形态变圆即停止消化（防止过渡消化）。

加入完全培养液（必须含胎牛血清）终止消化反应。

湾头吸管顺序吹打细胞，小心避免产生气泡（对细胞有害）。

镜下观察细胞，细胞分散即可后续操作。

如果是新手，保留上清以防不测，别倒掉。

6．问：最近要养CHO细胞,要作些准备,但不知道其培养也是什么,谢谢参考见解：这是一篇已发表的CHO细胞培养的方法.CHO细胞培养：CHO细胞株置于RPMI 1640 培养基中，内含10%灭活小牛血清，青霉素100 IU/mL，链霉素100 IU/mL，置于37℃，5%CO2的培养箱（德国Heraeus）中培养。

每隔48 h换培液，当单层培养细胞汇合以后，用0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。

将培养瓶中的CHO细胞按1×105/mL传代移入培养板中，待进入对数生长期后（约24 h）加药。

这是细胞的供给源:CHO细胞由中科院上海生物化学和细胞生物学研究所提供。

7．问：这两个月，CHO细胞在反应器上总是在前两天很难密度长上去，同期转瓶生长正常，基本排除细胞及培养基的问题，换罐做也出现同种现象，可排除反应器问题。

与曾经在此罐上正常生长的一批相比，只是接入培养液体积由1.5升改为0.8升，其他条件均相同，反应器控制系统无异常。

不知问题到底出在什么地方参考见解：根据我自己的经验，如果你的种子细胞和培养基都确保没问题的话，试试一下几点：1.接种时留一些细胞悬液，种回到方瓶或转瓶中，用与大罐相同的培养基同时培养，观察48小时内的生长情况，如果方瓶长势良好而罐子有问题，那就是操作的问题了2.不知道你的罐子800mL能否确保搅拌、通气等参数的控制效率，只看仪表显示是不够的，有时液位太低可能探测到的不是真实值，你可以在接种前用水试试，把各种条件设的极端一些，容易发现问题3.有可能的话再做一次1.5L培养，看能否重现6月的结果，因为你说所有条件都一样可能是不准确的，有疏漏的地方。

8．问：我培养的cho细胞,在塑料基质的方瓶中贴壁和生长情况很好,形态也很正常,但是接入转瓶后贴壁情况很差,不伸展或伸展需要的时间很长.请问这主要是什么原因?参考见解：我觉得可能的原因有如下几点：1 细胞本身贴壁生长的能力较弱，一般细胞在塑料器皿上的贴附能力强于玻璃器皿，这样的话，就选择塑料器皿好了。

其实塑料培养瓶等也是可以重复使用的，清洗干净，泡酸，冲洗干净，凉干之后，射线照射消毒或者就是紫外消毒也行，我们实验室就这样重复用培养板，没有什么问题。

当然，太旧的还是扔了好了。

2 培养液PH不好也会影响贴壁，配的时候加好缓冲试剂，不嫌麻烦的话调定PH在7.2左右。