实验三药物血浆蛋白结合率测定ppt课件
血浆蛋白和尿微量蛋白检测及其临床应用ppt课件
尿微量蛋白是指用常规定性或定量方法难以 检出的一些蛋白质。尿微量蛋白的检测对早 期原发肾脏病及其他相关疾病引发的早期肾 脏病变的诊断和治疗 有着非常重要的价值， 尿微量蛋白的检测为临床上监测肾出的尿微量蛋白种类、数量较多，其各 自的理化特性、合成部位、生理功能都不尽 相同。我们科目前已开展检测的有：尿白蛋 白（AIb）、尿转铁蛋白（TRF）、尿IgG、 尿轻链（κ、λ）、尿β2微球蛋白（β2M）、尿 α1微球蛋白（α1 M）、尿NAG等。
（二） 电泳分离法 电泳法分离法，最初以滤纸作为支持物，后 来发展为醋酸纤维膜、琼脂糖凝胶、聚丙烯 胺凝胶作为支持物，对血清和体液中的蛋白 质进电泳分离，早期的滤纸和醋酸纤维膜作 支持物可将血清蛋白分为白蛋白，α1球蛋白、 α2球蛋白、β球蛋白和γ-球蛋白等。现在用 聚丙烯胺作为支持物的电泳方法，可分离 100 种以上的血清蛋白质，可对尿液中的蛋 白质进行分离。电泳法优点是可较好地分离 血清和体液中蛋白，其缺点是操作繁琐 ，试验时间长。
测试项目
血清/血浆 尿液 CSF
IgAp IgMp IgEs
Albumin 1-microglobulin 2-macroglobulin 2-microglobulin IgG Ig-light chain, kappa Ig-light chain, lambda Total protein Transferrin
（三 ）免疫测定法 1 免疫扩散法 其存在较多缺点，如操作繁琐，试验需要时 间较长（18-48小时），定量精确度差等。 2 免疫电泳法 虽有较高的分辩力，但蛋白质在图谱上定位 困难，且不能定量，临床应用范围不广，仅 用于异常蛋白成分检测。 3 免疫浊度法
血脂及血浆脂蛋白检验ppt课件
已有很多种，主要有LDL受体、残粒受体（remnant receptor） 及清道夫受体（scavenger receptor）其它有ApoE受体（CM） HDL受体和β-VLDL受体等。
.
16
各种脂蛋白受体功能
➢LDL受体： 分布于肝细胞、动脉壁平滑肌细胞等细胞膜表面 识别结合ApoB100、E的脂蛋白如LDL、VLDL等。 合成受体内胆固醇的负反馈调节
2.胆固醇与高铁 – 硫酸试剂产生稳定的紫红色
Zak反应： Zak提出用硫酸、醋酸和Fe3+等与胆固醇作用生成紫红色化合物 来测定胆固醇，称为Zak反应。 （比L-B反应的灵敏度高，呈色稳定不需要皂 化，反应特异性差）
Ⅱa Ⅱb 同上 Ⅱb
Ⅲ
以甘油三酯升高为主，可有轻度胆固醇升 高，VLDL明显增加。
Ⅳ
.
30
（二）低脂蛋白血症
定义：
一般将血清TC＜3.3mmol/L，或TG＜0.45mmol/L，或LDL-C＜ 2.1mmol/L者，称为低脂蛋白血症。脂质如TC和TG同时降低或脂蛋白 如HDL、LDL和VLDL同时降低多见。
蛋 白
－
＋
电
泳
原点 γ β α2 α1 清蛋白
血
浆
脂
蛋－
＋
白
电
泳
原点
β 前β α
（CM）
.
8
（二）血浆脂蛋白的组成与结构
脂类：甘油三酯、磷脂、胆固醇、胆固醇酯 血浆脂蛋白
蛋白质：载脂蛋白
.
9
各种血浆脂蛋白的组成及功能
密度
脂 组类
成
蛋 白
质
主要生 理功能
CM 乳糜微粒
＜0.95
药物与血浆蛋白结合率
结合型药物暂时失去药理活性； 血浆蛋白结合率：反映药物与血浆蛋白结合的程度
D
+P
药物与血浆蛋白的结合的特点及意义
①结合型药物的药理活性暂 时消失，暂时“储存”于血 液中； ②蛋白结合是非特异性的， 而血浆蛋白结合点有限，两 个药物可能竞争与同一蛋白 结合而发生置换现象；
③有利于药物继续吸收，影 响被动转运；但不影响主动 转运过程。
2.影响药物分布的因素： ①药物的理化性质； ②药物与血浆蛋白结合率； ③组织血流量与药物和组织的亲和力，
药物再分布药物吸收后首先分布到血流量大的部位， 然后再分布到与其亲和力高的组织部位。
影响药物分布的因素： ④体液的pH ⑤屏障现象药物在血液与器官组织间转运受到的障碍: 血脑屏障 胎盘屏障
眼屏障
2、 结合 药物分子结构中的极性基团与体 内的葡萄糖醛酸、乙酰基、甘氨酸等成分共 价结合，生成易溶于水且极性高的代谢物排 出体外。
二、药物转化的肝药酶系统
生物转化的结果
灭活 活化
增毒、减毒
药物
药物 药物
亲脂
I相 无活性 活性或
II相 结合 结合 结合
排 泄
亲水
二、药物转化的肝药酶系统
1、专一性酶 胆碱酯酶、单胺氧化酶 2、非专一性酶 肝细胞微粒体的混合功能氧化酶系
第四节 排泄
指药物及其代谢物经机体的排泄器官或分泌 器官排出体外的过程。
器官：肾脏、胆囊、肺、肠道、汗腺、唾液腺和乳腺
一、经肾脏排泄
1、肾小球滤过 2、肾小管被动重吸收 3、肾小管的主动分泌 影响因素： A.药物的理化性质 B.尿液的pH值 C.尿量
二、经胆汁排泄
药物经肝脏转化生成的极性较强的水溶性代 谢物由肝细胞主动分泌，转运到胆汁，经胆道 排泄。
药物与血浆蛋白结合
药物与血浆蛋白结合药物与血浆蛋白结合率的变化通过影响游离型药物浓度，改变药物分布、代谢、排泄以及作用靶点的结合，从而影响药理效应及毒副作用。
对1500种常用药的研究表明，43%化合物的血浆蛋白结合大于90%。
血浆蛋白结合在不同的治疗领域没有显著差异：中枢神经系统、炎症和肾-心血管。
唯一的例外可能是抗炎药物，其高蛋白结合者（>99%)占较高的比例（26%），且其中大多数为酸类。
令人惊奇的是，许多中枢神经系统药物具有高血浆蛋白结合的特点。
该研究最惊人的发现是，化学治疗药物（包括抗生素、抗病毒药物、抗真菌药物和抗肿瘤药物）中有较高比例（77%)的低结合药物。
在设计化学治疗药物方面，低血浆蛋白结合似乎更有优势。
血浆蛋白结合的基本原理血液经抗凝处理后的全部血液为全血；血浆是血液（不包括细胞）的液体部分。
在存在抗凝剂（如肝素）的条件下采集新鲜血液，然后离心去除血细胞而得到用于体外研究的血浆，血浆蛋白仍然保留于液体部分。
血清是去除了凝血因子（如纤维蛋内原）的血浆，它是在不含抗凝剂条件下采集的。
药动学研究通常采集血浆，从而保留了蛋白结合型及游离型药物，但除去了与细胞结合的药物。
许多药物与血浆蛋白、组织蛋白或体内的大分子物质如白蛋白、DNA 等反应，生成药物大分子复合物。
药物与蛋白类高分子结合后，分子体积变大，不能透过血管壁向组织转运，不能由肾小球滤过，不能透过胎盘屏障，不能经肝代谢。
进人血液中的药物，一部分在血液中呈游离形式存在，一部分与血浆蛋白通过离子键、氢键、疏水键及范德华力可逆性结合，形成药物血浆蛋白复合物，是药物在血浆中的一种贮存形式，能降低药物的分布与消除速度，维持药物疗效。
药物的蛋白结合不仅影响药物的体内分布，而且还影响药物的代谢和排泄。
药物在机体内最重要的结合就是蛋白结合，且主要是血浆蛋白结合。
血脂及血浆脂蛋白的检验 ppt课件
第二节 血清总胆固醇测定
一、原理 二、试剂与器材
三、实践步骤
四、参考范围
五、注意事项
六、临床意义
（一）胆固醇增高
（二）胆固醇降低
七、说明
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13
第三节 血清酸三酯酰甘油测定
1、化学测定法： (1)抽提:甲醇、乙醇、正庚烷、氯仿。吸附剂取出干扰。
(2)皂化：氢氧化钾做皂化剂。
(3)氧化：过碘酸做氧化剂。 (4)显色 ：紫红色化合物 或黄色化合物(乙酰丙酮法)。
ppt课件 21
琼脂糖凝胶电泳分析
一、原理 二、试剂与器材
三、实践步骤
四、结果判断
五、计算
六、参考范围
七、注意事项
八、说明
九、临床意义
ppt课件
22
•谢谢
ppt课件
23
Байду номын сангаас
• 脂蛋白电泳的基本原理与蛋白电泳相同，各种脂 蛋白在一定的pH条件下，电场中可以在琼脂糖凝 胶上被分离开来。按照迁移率递增的次序，分别 为：乳糜微粒、LDL.+VLDL和HDL。乳糜微粒分子 较大，甘油三酯含量高，与血清出现乳白色有关 ，通常它们停留在加样点处。LDL通常迁移到β： 球蛋白位置处。VLDL比LDL体积大并且较轻，可 能引起血清的浑浊，它们更容易迁移到β球蛋白 的位置。HDL迁移最快，可到达α2球蛋白的位置 。
血脂及血浆脂蛋白的检验
ppt课件
1
第一节 概述
ppt课件
2
ppt课件
3
ppt课件
4
载脂蛋白的生理功能
• • 一、维持脂蛋白的结构 二、调节脂蛋白代谢的关键酶
•
三、识别脂蛋白受体
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实验三药物血浆蛋白结合率测定
操作步骤
1. 血浆的制备：兔心脏采血（鸡翼静脉采血）， 肝素抗凝，以3000rpm离心10min，上清液即 为血浆。
2. 将管状半透膜一端折叠，用纱线扎紧，保留结 扎线段10cm左右，以调节袋内外液面在同一水 平，加血浆样品2.0ml于上述半透膜袋内，并扎
10 紧口袋另一端。注意：袋口不得污染血医学浆ppt 。
✓ 贮存标准液 取标准品0.125g溶于蒸馏水中，并 稀释至1000mL。如不溶于水，可先溶于0.1 mol/L氢氧化钠25mL中，再加4mol/L硫酸175 mL，用蒸馏水稀释至1000mL。
✓ 应用标准液 精确吸取贮存标准液3mL，置100 9 mL容量瓶中，用3%三氯醋酸稀释至刻医学度ppt 。
实验三 药物血浆蛋白结合率测定
1
医学ppt
测定方法
平衡透析法
超过滤法
分配平衡法
稳定同位素-GC-MS法
凝胶过滤法
光谱技术
2
医学ppt
平衡透析法
基本原理
将蛋白置于一个隔室内，用半透膜将此隔室
与另一隔室隔开。蛋白等大分子不能通过此半
透膜，但系统中游离配基可自由通过。当达到
平衡时半透膜两侧自由配基的浓度相等。若系
4
医学ppt
材料与试剂
➢ 药物 10%磺胺嘧啶钠注射液
➢ 试剂
• 15%三氯醋酸溶液
• 0.1%亚硝酸钠溶液
• 0.5%氨基磺酸胺溶液
• 0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液
• 磺胺嘧啶钠贮存标准液
• 磺胺嘧啶钠应用标准液
5
医学ppt
➢ 透析液 （PBS） pH7.4的 0.02M 磷酸盐缓冲液
统中自由配基的总量已知，测定不含蛋白隔室
平衡透析法测定血浆蛋白结合率原理(一)
平衡透析法测定血浆蛋白结合率原理(一)平衡透析法测定血浆蛋白结合率一、引言•简介平衡透析法的基本原理和应用范围，引出血浆蛋白结合率测定的必要性及其应用领域。
二、平衡透析法基本原理•介绍平衡透析法的定义和原理：–平衡透析法是一种测定蛋白结合率的常用方法，通过利用半透性膜将游离分子与蛋白结合的复合物分离，使两者达到平衡，进而计算蛋白结合率。
三、血浆蛋白结合率的意义•指出血浆蛋白结合率对于药物吸附、传递和释放等药代动力学过程的影响，以及对药物的药效、毒副作用的评估都具有重要的意义。
四、平衡透析法测定血浆蛋白结合率的步骤•说明平衡透析法测定血浆蛋白结合率的具体步骤：1.准备透析袋和透析膜2.加入血浆和待测药物3.实施透析操作4.分析透析液和静态样品5.计算血浆蛋白结合率五、影响血浆蛋白结合率的因素•列举并详细解释影响血浆蛋白结合率的各种因素，如药物特性、蛋白特异性、溶液条件等：–药物特性：药物的分子量、极性、脂溶性等–蛋白特异性：不同的蛋白结合位点、结合亲和力等–溶液条件：pH值、离子强度等六、平衡透析法测定血浆蛋白结合率的应用案例•介绍血浆蛋白结合率测定方法在药物开发、药物评价和临床用药个体化等方面的具体应用，并列举相关案例。
七、总结•总结平衡透析法测定血浆蛋白结合率的原理、步骤及应用，强调其在药物研究中的重要性和发展前景。
以上是关于平衡透析法测定血浆蛋白结合率的一份简要文章，通过逐步深入地解释相关原理和应用，帮助读者理解该方法的基本原理和操作步骤，以及其在药物研究领域的重要性。
平衡透析法测定血浆蛋白结合率一、引言平衡透析法是一种用于测定血浆蛋白结合率的常用方法。
血浆蛋白结合率是指药物与血浆中的蛋白结合形成的复合物所占总药物浓度的比例。
血浆蛋白结合率的测定对于了解药物在体内的药效、毒副作用以及药代动力学过程具有重要的意义。
本文将介绍平衡透析法的基本原理和步骤，并解释影响血浆蛋白结合率的因素以及该方法在药物研究中的应用案例。
平衡透析法测定血浆蛋白结合率实验原理及注意事项
平衡透析法检测血浆蛋白结合率原理及注意事项药物血浆蛋白结合率（Plasma Protein Binding, PPB）即血液中与蛋白结合的药物占总药量的百分数，可以反映药物与血浆蛋白结合的程度。
药物血浆蛋白结合率是药物在动物体内重要的药理学参数之一，影响着药物体内游离浓度进而影响药物的分布与排泄。
药物在进入血液后与血浆蛋白会有不同程度结合，血液中游离药物的比例会影响其在体内吸收、分布、代谢和排泄的过程，与血浆蛋白结合的药物可能会有更长的半衰期和更慢的清除速率，因此测定血浆蛋白结合率对于理解化合物的活性以及组织分布有很重要的参考意义。
1 结合蛋白类型血浆蛋白主要作为载体负责各类外源性和内源性分子在循环系统内的转运。
其中参与小分子药物结合的主要有白蛋白、α-1-酸性糖蛋白（AAG）、球蛋白和脂蛋白，主要以白蛋白和α-1-酸性糖蛋白（AAG）为主。
药物与蛋白的结合强弱主要与药物-蛋白亲和力、蛋白丰度相关。
2 血浆蛋白结合率常用测定方法目前常用于药物血浆蛋白结合率测定的常用方法包括平衡透析法（Equilibrium Dialysis），超滤法（Utrafiltration Method），超速离心法（Ultracentrifugation Method），凝胶过滤法（Gel filtration）等。
其中，平衡透析法是基于药物结合的平衡原理来测定药物游离浓度最常用的方法，也是研究药物血浆蛋白结合率的经典方法。
超滤法使用滤膜分立自由的药物和结合蛋白的药物，时间短，但确定点是药物容易结合到超滤过程使用的器械上，从而影响检测结果。
平衡透析法虽然比超滤法耗时多一些，但它使用teflon镀层的平衡装置，能大大减少药物的非特异性结合，得到更精确的结果。
目前，平衡透析法已有96孔板的高通量测试形式，可以实现同时测试大量候选药物的蛋白结合率。
平衡透析法常用种属血浆：大鼠血浆，小鼠血浆，比格犬血浆，猴血浆，人血浆分析方法：HPLC，LC-MS/MS，GC-MS等各种药物以一定的比率与血浆蛋白结合之后，在血浆中会同时存在结合型与游离型两种类型，游离性药物具有药物活性。
第三章药物的蛋白结合ppt
• 药物相互作用
ａ．其他物质在蛋白结合部位与药物的 竞争
ｂ．其他药物使蛋白发生变化，从而改 变药物和蛋白的亲和力。例如，阿斯匹林 可使清蛋白上的赖氨酸乙酰化。
• 患者病理生理状况
例如，肾患者和肝患者的药物蛋白结 合可能减少。年龄差异，新生婴儿蛋白浓 度低。
二．血浆中药物蛋白结合与分布
及消除的关系
• 例题：
血液表观分布容积等于体重的8%，对于 70Kg受试者则为5.6L，组织表观分布容积 等于36.4L。由于血液蛋白结合,药物突然游 离，其结合率从97%降为95%。试计算药 物总分布容积的变化。假设组织游离药物 浓度等于开始时血液游离药物浓度。
• 对于高度血浆蛋白结合的药物，游离药物 的微小变化会引起总分布容积的显著变化。
土霉素
35.4
9.2
98.6
70
四环素
64.6
8.5
73.5
60
去甲金霉素 90.8
12.7
36.5
45
强力霉素 93.0
15.1
16.0
45
• 结合强、主动分泌的药物，t1/2短
当血液流经肾脏时，主动分泌可将药 物从蛋白中移去或脱离。
药物蛋白结合与药物作用持续时间
• 药物有强且可逆的蛋白结合
强力霉素和血清蛋白结合率为93%，清除 t1/2是15.2h;
土霉素和血清蛋白结合率为35.4%，清除t1/2 是9.2h.
表2. 四环素类似物iv.后它们的血清蛋白结
合、t1/2、肾清除率和尿复得率
四环素类似物 血清结合 t1/2 (h) 肾清除率 尿复得率 （ml/min） （％）
七. 药物蛋白结合的临床意义
• 从血浆蛋白浓度的变化推测游离药物浓度 药物结合分数可以随血药浓度和给药
分布容积血浆蛋白结合率课件
2/17/2021
分布容积血浆蛋白结合率
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力量
血液侧
血液侧
透析液
对流方式（血滤）
2/17/2021
弥散方式（血透）
分布容积血浆蛋白结合率
9
分子量、电荷及蛋白结合率 （二）
由于膜在血液侧对阴离子蛋白（如白蛋白）的 吸附，减少了阳离子的清除，增加了阴离子的 清除。
概念2：尽管庆大霉素与蛋白质结合率低，分 布容积小、分子量不大，但由于其携带多价阳 离子，血液透析时仍有部分药物被潴留
药物分子量、电荷及蛋白结合率对药物的清除 有影响
其中，药物分子量对药物清除的影响取决于 药物的转运方式 概念1：当药物以对流方式（血滤）转运时， 药物分子量小于膜的截留量，与药物分子量大 小无关；当药物是以弥散方式转运时，药物的 清除与分子量大小呈反比。 大部分药物的分子量小于1500道尔顿，由于高 通量膜的使用大大削弱了分子量对药物清除的 影响。
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分布容积血浆蛋白结合率
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分子量、电荷及蛋白结合率 （四）
概念4：如果一个小分子量药物，分布容积小， 70％的蛋白结合率，那么大约有<30％的游离药 物在血液中，清除比较充分
相反，一个药物即使只有10％的蛋白结合率却有 很大的分布容积，尽管游离药物比率很大，也不 易清除，因为药物主要存留在组织中，而不是在 循环的血浆中
2/17/2021
分布容积血浆蛋白结合率
18
PD对药物的清除（一）
通常药物从腹膜的毛细血管腔顺浓梯度以弥散方式进 入腹腔，并得以清除，其速率较为缓慢，且不完全。 腹膜清除率与相对分子量呈半对数反比关系 腹膜透析与血液透析药物清除作用相一致，但不尽相 同；
例如： 1）与HD相比，腹膜透析清除蛋白结合率高的 药物效果优于HD； 2）而标准HD一次通常可清除氨基糖甙类抗生 素的2/3负荷量，而行PD24小时只能清除负荷 量的1/4
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3. 将两端扎紧的半透膜置于盛有9.75ml透 析液的30ml广口瓶中，用袋两端线段调 节袋内外液面
4. 加2.0ml透析液代替血浆于半透膜袋内， 作平衡时间对照样品，以确定药物从袋 内外自由扩散达到平衡所需时间。
实验三 药物血浆蛋白结合率测定
测定方法
• 平衡透析法 • 超过滤法 • 分配平衡法 • 稳定同位素-GC-MS法 • 凝胶过滤法 • 光谱技术
平衡透析法
• 基本原理 将蛋白置于一个隔室内，用半透膜将
此隔室与另一隔室隔开。蛋白等大分子 不能通过此半透膜，但系统中游离配基 可自由通过。当达到平衡时半透膜两侧 自由配基的浓度相等。若系统中自由配 基的总量已知，测定不含蛋白隔室中自
Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸馏水至1000ml； B液： 0.2M NaH2P4
NaH2P4·2H2O 12克，加蒸馏水至1000ml； 应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水
作10倍稀释即成。
试剂的配制
0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液 0.5 g溶于95 %乙醇约400 mL中，再用乙醇稀 释至500ml，棕色瓶于冰箱中保存
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6. 置广口瓶于冰箱中，平衡透析时间约需 60h左右。
7. 待透析平衡后，吸出袋外透析液少许， 加等量磺基水杨酸试剂，检查有无血浆 蛋白漏出。如检查为阳性，则该样品作 废。
9. 用重氮化-偶合比色法测定袋内外溶液中磺胺药浓度
取袋内外溶液各0.5ml，加水15.5ml；加15%三氯醋
酸4ml，混匀，静置2min，过滤 取试管3支，各加入滤液5mL，为测定管 取试管3支，加入空白对照液5mL，为空白管 取试管3支，加入应用标准液5mL，为标准管
度
测定管光密 标准管光密
计算公式
Dt Df
• fb= Dt
×100%
fb：血浆蛋白结合率；
Dt：血药总浓度（透析袋内血浆药物浓度）；
Df：游离药物浓容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用
资料仅供参考，实际情况实际分析
主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、 图文设计制作、发布广告等
透析液 （PBS） pH7.4的 0.02M 磷酸盐缓冲液
鸡、兔各三只 管状半透膜 周长5cm，长约12cm
设备与器械
• 721分光光度计、离心机、天平 • 注射器、广口瓶、烧杯、三角烧瓶、试管、
试管架、漏斗、滤纸、丝线、注射器
试剂的配制
0.02M, PH7.4磷酸盐缓冲盐液( PBS) ： 贮存液： A液：0.2M Na2HPO4
重氮化偶合比色测定法
• 具有游离氨基的磺胺药在酸性介质中重氮化
后，可与N-(1萘基）乙二胺产生偶合反应生 成紫红色偶氮染料，再与同样处理的磺胺药 标准液比较，即可求得磺胺药的含量。
• 剩余的亚硝酸影响测定，用氨基磺酸胺分解
材料与试剂
药物 10%磺胺嘧啶钠注射液 试剂
• 15%三氯醋酸溶液 • 0.1%亚硝酸钠溶液 • 0.5%氨基磺酸胺溶液 • 0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液 • 磺胺嘧啶钠贮存标准液 • 磺胺嘧啶钠应用标准液
贮存标准液 取标准品0.125g溶于蒸馏水中， 并稀释至1000mL。如不溶于水，可先溶于 0.1 mol/L氢氧化钠25mL中，再加4mol/L 硫酸175 mL，用蒸馏水稀释至1000mL。
应用标准液 精确吸取贮存标准液3mL，置
操作步骤
1. 血浆的制备：兔心脏采血（鸡翼静脉采 血），肝素抗凝，以3000rpm离心10min， 上清液即为血浆。
在以上各管中各加入0.1%亚硝酸钠溶液0.5mL，混
匀，放置3min
各加入0.5%氨基磺酸胺溶液0.5mL，混匀，
放
置2min
各加入0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶
液
2.5mL，充分混匀，放置10min
用721分光光度计在550nm波长处比色
计算公式
度 游离磺胺药含量 （mg%）=