荧光素标记抗体方法

荧光免疫标记技术

荧光染料的选择与特性
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荧光染料种类
常见的荧光染料包括异荧光染料特性
不同的荧光染料具有不同的激发波长和发射波长，可选择适用于不同检测需求的染料。
荧光染料标记方式
荧光染料稳定性
荧光染料可以通过化学键合、生物素-亲和素系统等方式与抗体或抗原结合。
反应条件控制
为了确保抗原-抗体反应的顺利进行，需要控制适宜的反应条件，如温度、pH值和离子强度等。这些条件会影响抗原和抗体的活性以及它们之间的结合能力。
荧光染料的标记与染色
选择合适的荧光染料
根据实验需求选择具有特定波长的荧光染料，以便在检测时能够产生明显的荧光信号。荧光染料应具有高灵敏度、低背景干扰和稳定性好的特点。
标记抗原或抗体
将荧光染料与抗原或抗体结合，形成带有荧光的标记物。标记的过程可以通过化学方法或生物技术实现，确保荧光染料与抗原或抗体牢固结合。
结果观察与数据分析
荧光显微镜观察
通过荧光显微镜观察抗原-抗体复合物的荧光信号，可以定性或定量分析样本中的抗原含量。观察时需注意控制激发波长和发射波长，以获得最佳的荧光信号。
数据分析
利用相关软件对荧光信号进行定量分析，通过测量荧光强度、荧光分布和荧光色彩等信息，计算抗原浓度或细胞数量等指标。数据分析有助于提高实验结果的准确性和可靠性。
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荧光免疫标记技术的优缺点
优点
高灵敏度
荧光免疫标记技术能够检测到低浓度的抗原或抗体，具有较高的灵敏度。
特异性高
荧光免疫标记技术通常采用特异性的抗体或抗原，能够针对特定的目标进行检测，具有较高的特异性。
流式细胞术
利用荧光免疫标记技术对细胞表面抗原进行标记，通过流式细胞仪进行检测和分析，可以对细胞进行分群、计数和功能研究。

荧光素FITC标记抗体方法

荧光素FITC标记抗体的方法当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。

一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。

1．Marsshall法(1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或3．0的0．01mol／LPBS等。

(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。

②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。

也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。

a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。

b．总蛋白量(AXB)＝Crag。

c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。

d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。

e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。

f．PBS量D-(B+F)=Gml。

注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。

免疫荧光双标操作方法及注意事项【范本模板】

在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色.双重免疫荧光标记法（double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法.(1）直接法双重免疫荧光标记:将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B）以适当比例混合，滴加在标本上孵育,然后洗去未结合的荧光抗体,在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察,即可对两种抗原进行定位和定量。

直接法简便可靠,但灵敏度较低。

(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察,从而对两种抗原进行定位和定量。

使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属,且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。

免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下:1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。

2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定.3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。

4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS （1：1）。

条件许可,建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久.5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光.6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照.二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

2、每次试验均需设置以下三种对照:（1) 阳性对照:阳性血清+荧光标记物；(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物；(3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。

三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit—FITC(绿）和donkey anti—rat-Tex-Red(红）.2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。

抗体PE荧光素标记操作流程记录

1.目的
规范单克隆抗体标记荧光PE (快速标记法）标准操作程序
2.适用范围
适用于本公司抗体标记荧光PE (快速标记法）操作
3.术语和定义
藻红蛋白，简称“PE”。

相对分子质量较大，约为240kD，最大吸收峰为564nm。

4.职责和权限
实验员负责实施本规范，主管负责人监督执行。

5.实验试剂.
5.1溶液配制
5.2其他试剂
6.操作流程
6.1抗体活化
将抗体用0.01mol/L PBS稀释为1mg/mL，加入mL 活化液(体积比为抗体溶液：反应活化液=10:1），旋涡振荡器混匀后，室温避光反应10min。

6.2与PE反应形成共轭物
将抗体混合液（步骤6.1）加入mg PE荧光素中（加入量：抗体与荧光素质量比为1:1），在室温条件下避光反应3小时，反应开始时间：至结束时间：；（或2-8度条件下避光过夜）。

6.3荧光淬灭
向共轭物（步骤6.2）中加入mL 淬灭剂（淬灭剂添加量按抗体体积：淬灭剂体积=10:1添加）。

混匀后，室温孵育30分钟，去除游离的荧光素的荧光效应。

淬灭开始时间：至结束时间：。

6.4层析
将共轭物（步骤6.3）层析柱分离，进一步去除游离的荧光素或抗体。

6.5保存
收集得到的标记抗体（步骤6.4），上机测试后根据效价，用Storage Buffer 按比例稀释后，4℃避光保存，有效期一年。

免疫荧光技术的几种实验方法及其分类

免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。

底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。

结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。

该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。

以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。

除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。

洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。

最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。

传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。

2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。

然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。

RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。

但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。

近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。

3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。

竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。

夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。

ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。

几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记

几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。

、酶标记1 、辣根过氧化物酶(HRP) 标记辣根过氧化物酶(HRP) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。

其原理是HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG 氨基结合，形成Schiff 氏碱。

为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。

氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff 氏碱。

这里介绍两种程序。

程序一：(1)将5mg HRP 溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中加0.5ml 10mmol/LNaIO4 溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2 小时。

(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3 混匀。

(3)加入0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml) ，混匀。

(4)称取SephadexG25 干粉0.3g ，加入一支下口垫玻璃棉的5ml 注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4C过夜。

(5)用少许PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V 体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4 溶液，混匀，室温作用30 分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4C过夜)。

(6)将交联物过Sephadex g200 或Sepharose6B(2.6 X 50cm)层析纯化，分管收集第一峰。

(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403 X 0.4IgG 量(mg/ml)=(OD280- OD403X 0.3) X 0.62克分子比值(E/P)=酶量X 4/IgG量，一般在1-2之间。

酶结合率=酶量X体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280 等于0.4 时，E/P 约为1 。

免疫荧光技术操作步骤

免疫荧光技术操作步骤 Prepared on 22 November 2020免疫荧光技术操作步骤一. 直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。

其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。

试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：L，荧光标记的抗体溶液：以 L，的 PBS 进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ 碳酸盐缓冲液 1 份配制搪瓷桶三只（内有 L，的 PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。

实验步骤1. 滴加 L，的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。

2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。

3. 取出玻片，置玻片架上，先用 L，的 PBS 冲洗后，再按顺序过 L，的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。

4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

5. 立即用荧光显微镜观察。

观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。

待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。

注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在 1：20-100 之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。

2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数小时，一般 30 min 已足够。

染色温度多采用室温（25℃左右），高于 37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用 0-2℃的低温，延长染色时间。

荧光标记抗体原理

荧光标记抗体原理
荧光标记抗体是指将一种荧光物质与抗体结合，使抗体具有荧光性质。

荧光标记抗体原理如下：
1. 选择一种具有良好荧光性质的荧光物质，常用的荧光物质包括荧光素、荧光染料（如荧光同种异构体（FITC）、荧光硫氰酸异硫氰酯（Alexa Fluor）等）等。

2. 将选择的荧光物质与抗体进行化学反应，常用的偶联试剂包括异硫氰酸酯（Isocyanate）和丙酮醛等。

3. 反应后，荧光物质与抗体结合成荧光标记抗体。

荧光物质的选择要求与抗体具有良好的结合活性和稳定性，且不影响抗体的特异性和亲和性。

4. 荧光标记抗体可用于免疫组化、流式细胞术、免疫印迹等实验中，通过检测其荧光信号来定位和定量分析抗体所结合的目标分子。

荧光标记抗体的优势在于其具有较高的灵敏度、选择性和多色选择性，可用于多重标记和共定位分析等研究。

同时，荧光标记抗体还可以与其他标记抗体（如酶标记抗体）结合使用，以增加信号的稳定性和可见度，从而提高实验结果的可靠性。

荧光素FITC标记抗体的方法

荧光素FITC标记抗体的方法当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。

一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→FITC-NS-C-N-H2-蛋白质常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。

1．Marsshall法(1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或3．0的0．01mol／LPBS等。

(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于使最后免疫球蛋白浓度为再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，烧杯中，20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。

②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。

也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。

a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。

b．总蛋白量(AXB)＝Crag。

c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。

d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。

e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。

f．PBS量D-(B+F)=Gml。

注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓。

荧光抗体标记_实验报告

一、实验目的1. 掌握荧光抗体标记技术的基本原理和操作步骤。

2. 学会使用荧光显微镜观察荧光标记的抗体与抗原的结合情况。

3. 了解荧光抗体标记技术在生物医学研究中的应用。

二、实验原理荧光抗体标记技术是将荧光素与特异性抗体结合，形成荧光标记抗体。

这种标记抗体仍保持抗体原有的活性，当与相应的抗原发生特异性结合时，荧光标记抗体在荧光显微镜下呈现出明亮的荧光，从而实现对抗原的检测和定位。

三、实验材料1. 实验试剂：FITC标记的抗体、抗原、抗体稀释液、磷酸盐缓冲液（PBS）、甘油、甲醇等。

2. 实验仪器：荧光显微镜、离心机、移液器、吸管、试管、载玻片等。

四、实验步骤1. 标准化抗体将FITC标记的抗体用抗体稀释液稀释至适当浓度。

2. 制备抗原将待检测的抗原用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至适当浓度。

3. 制备细胞悬液将待检测的细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，离心弃去上清液，加入适量的磷酸盐缓冲液重悬细胞。

4. 混合抗原与抗体将抗原与抗体按一定比例混合，在室温下孵育一段时间。

5. 洗涤将混合后的溶液在室温下用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次洗涤后离心弃去上清液。

6. 封片将洗涤后的细胞沉淀用甘油封片，封片剂与细胞沉淀的比例为1:1。

7. 荧光显微镜观察将封片置于荧光显微镜下观察，调整显微镜参数，观察荧光标记的抗体与抗原的结合情况。

五、实验结果通过荧光显微镜观察，发现荧光标记的抗体与抗原发生了特异性结合，形成明亮的荧光复合物。

阳性细胞在荧光显微镜下呈现出明显的荧光信号，而阴性细胞则无荧光信号。

六、实验讨论1. 实验过程中，抗体与抗原的孵育时间、洗涤次数和封片剂的选择对实验结果有较大影响。

本实验中，抗体与抗原的孵育时间为30分钟，洗涤次数为3次，封片剂为甘油。

2. 荧光抗体标记技术具有特异性高、灵敏度高、操作简便等优点，广泛应用于生物医学研究、临床诊断等领域。

3. 在实验过程中，应注意以下几点：（1）抗体与抗原的比例要适中，过多或过少都会影响实验结果；（2）孵育时间不宜过长或过短，以免影响抗体与抗原的结合；（3）洗涤时要充分，以去除未结合的抗体和抗原；（4）封片剂的选择要合适，以保证荧光信号的稳定。

荧光素FITC标记抗体方法

荧光素FITC标记抗体方法荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）是一种常用的荧光染料，广泛应用于细胞和组织标记。

荧光素FITC标记抗体方法是通过将FITC染料与抗体共化合，实现对特定抗原的检测与定位。

下面介绍一种常用的荧光素FITC标记抗体方法。

一、材料准备：1.FITC染料：从商业供应商购买具有高纯度的FITC染料，最好使用高纯度的FITC染料。

2.抗体：选择与目标抗原结合的特异性抗体。

3. 缓冲液：例如0.01 M PBS（phosphate-buffered saline，PBS）等。

4. 交联剂：例如戊二醛（glutaraldehyde）等。

5.离心机：用于离心洗涤步骤。

6.荧光显微镜：用于观察荧光素标记的抗体。

二、FITC标记抗体方法步骤：1. 准备荧光素FITC溶液：根据抗体浓度调整FITC染料浓度。

通常建议使用1 mg/mL的FITC染料溶液。

2.准备抗体溶液：使用适当的缓冲液稀释抗体至所需浓度。

3.将荧光素FITC溶液与抗体溶液按比例混合，使其均匀混合，最好在黑暗条件下进行。

4.在混合物中加入适量的缓冲液，并将其在室温下静置足够时间（通常为1-2小时）。

此步骤是为了保证荧光素FITC与抗体充分反应，形成共价键。

5.添加适量的交联剂（例如戊二醛）进行交联反应。

该步骤有助于稳定化合物。

6.在室温下搅拌1-2小时，然后离心洗涤步骤中的沉淀。

7.使用冷冻离心机将上述混合液离心10分钟以除去未反应的FITC。

8.弃去上清液，用适量的缓冲液洗涤沉淀2-3次，以除去剩余的FITC染料。

9.加入适量的缓冲液使沉淀均匀悬浮，以得到FITC标记抗体的最终溶液。

10.对所得荧光素FITC标记抗体进行质控实验，如免疫组化或细胞标记实验等。

11.在荧光显微镜下观察标记抗体的染色效果，根据实验需要选择适当的显微镜参数进行观察。

总结：荧光素FITC标记抗体方法是一种常用的荧光标记方法，可以用于细胞和组织中的抗原的定位与检测。

荧光标记抗人抗体的检测(流式细胞术——直接法)标准操作规程

天津三箭生物技术有限公司（Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd.）天津经济技术开发区第四大街80号天大科技园C5-106/311 邮编：300457Room106/311,Building C5,80 Fourth Avenue,TEDA Tianjin,PR,China. Zip:300457Tel ：0086-22-66211636， Fax ：0086-22-66211638Website ：荧光标记抗人抗体的检测（流式细胞术——细胞表面抗原染色——直接法）标准操作规程1、检验目的用于体外定性,定量的免疫分析，用来检测被检荧光标记抗体的特异性，荧光强度并确定所检抗体的滴度试验。

2、原理利用流式细胞技术检测荧光标记抗体。

根据抗原抗体结合原理，用特定荧光素标记的抗体对已知携有相应抗原的细胞进行染色。

经荧光素标记抗体染色的细胞可以被流式细胞仪识别，并根据已知细胞所携带的荧光素的强度，对标记抗体进行定性，定量分析。

3、实验材料人外周血若干ml试剂：1xPBS pH7.2；FACS TM Lysing Solution （BD Cat# 349202）；荧光素标记抗体；屈臣氏蒸馏水；NaClO耗材：抽血针头，5ml 抗凝抽血管，流式管,离心管，离心管架；移液器（10ul ，20ul ，100ul ，200ul ，1000ul 及5ml ）； 100*100冻存盒；泡沫盒等。

仪器：低速离心机，制冰机，流式细胞仪4、实验步骤（1）单细胞悬液的制备1）根据试验需要取人外周血若干ml 待用。

（2）染色1）根据试验设计，标记好流式管号。

2）用移液器取100μl 细胞/管（约106细胞），分别加到已经标记好的流式管底部（不可粘到管壁）。

3）根据试验设计，向流式管中加入相应荧光素标记抗体。

混匀。

4）冰上（或4度冰箱）避光染色30min 。

5）加入2ml 1x FACS TM Lysing Solution ，混匀后裂解10min,1400 rpm/min ，离心5min 。

ELISA原理及步骤

ELISA原理及步骤ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附法）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的分析技术。

它基于免疫学原理，通过检测特定抗原和抗体的结合来定量测定目标物。

1.直接ELISA的原理及步骤：直接ELISA方法适用于已知抗体，且目标物的抗原性较好的情况。

该方法将特异性的抗原通过硫酸盐或其他方法固定于微孔板上，然后用荧光素标记的抗体与其结合，最后通过测量荧光素的荧光强度来进行定量测定。

步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。

2）将非特异性结合位点封闭，以防止非特异性结合。

3）加入荧光素标记的抗体，与抗原特异性结合。

4）洗涤净化微孔板以除去未结合的荧光素标记的抗体。

5）加入底物，并进行发光强度测定。

6）测量荧光素的荧光强度，利用标准曲线计算样品中目标物的浓度。

2.间接ELISA的原理及步骤：间接ELISA方法适用于已知抗原，但目标物的抗原性较差的情况。

该方法在抗原固定之后，加入绕行适体素标记的次级抗体，通过该次级抗体与目标物特异性结合，最后通过测量标记抗体的发光强度来进行定量测定。

步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。

2）将非特异性结合位点封闭，以防止非特异性结合。

3）加入特异性的初级抗体与目标物结合。

4）洗涤净化微孔板以除去未结合的初级抗体。

5）加入绕行适体素标记的次级抗体，使其与初级抗体结合。

6）洗涤净化微孔板以除去未结合的次级抗体。

7）加入底物，并进行发光强度测定。

8）测量标记抗体的发光强度，利用标准曲线计算样品中目标物的浓度。

3.竞争ELISA的原理及步骤：竞争ELISA方法适用于已知抗体和已知抗体与抗原的结合关系的情况。

该方法将标记抗原与固定抗原共同加入到微孔板中，通过测量标记抗原与抗体的竞争情况来进行定量测定。

步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。

2）将标记抗原共同加入到微孔板中。

荧光标记抗体,分离纯化

荧光标记抗体,分离纯化
荧光标记抗体是一种将荧光物质与特异性抗体结合的标记试剂，可通过荧光显微镜、流式细胞术和荧光免疫组化等技术，对目标分子进行可视化分析。

分离纯化荧光标记抗体主要包括以下步骤：
1. 抗体制备：选择适当的抗体，常用的来源包括小鼠、兔子等。

抗体可以通过动物免疫或用细胞培养技术得到。

2. 免疫沉淀：将抗体与待标记的抗原充分混合，形成免疫复合物。

可以使用免疫沉淀试剂盒等商业试剂盒进行沉淀。

3. 离心洗涤：通过离心把免疫复合物沉积在底部，去除未结合的抗原和其他污染物。

4. 荧光标记：选择适当的荧光剂与抗体结合，形成荧光标记的抗体。

常用的荧光剂有FITC（荧光素异硫氰酸酯）和Alexa Fluor（一种荧光染料），其选择应基于实验需求和设备兼容性。

5. 剩余荧光剂的去除：可以通过凝胶过滤或柱层析等技术，去除未结合的荧光剂。

6. 质量控制：对分离纯化后的荧光标记抗体进行质量检测，如使用SDS-PAGE和Western blot技术验证抗体的纯度和特异性。

7. 储存：将荧光标记抗体分装，并储存在适当的条件下，避免存放在光照和高温环境中。

总之，荧光标记抗体的分离纯化过程主要包括抗体制备、免疫沉淀、离心洗涤、荧光标记、剩余荧光剂去除、质量控制和储存等步骤。

荧光素FITC标记抗体的原理和操作方法

荧光素FITC标记抗体的原理和操作方法中文名称：异硫氰酸荧光素酯中文别名：荧光素-5-异氰酸酯; 异硫氰酸荧光酯异构体; 异硫氰酸荧光橙红; 异硫氰酸荧光红; 异硫氰酸荧光黄; 异硫氰酸荧光素（同分异构体I）; 荧光素5-异硫氰酸盐,异构体1,95%; 异硫氰酸荧光素异构体1.95+%; 异硫氰酸荧光素英文名称：Fluorescein isothiocyanate isomer I英文别名：Fluorescein isothiocyanate, isomer 1; 5-FITC;5-Isothiocyanato fluorescein; FITC; FITC-CELITE(R); FITC ISOMER; FITC 'ISOMER I'; FITC, ISOMER I; FLUORESCEIN ISOMER I ISOTHIOCYANATE;2-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-5-isothiocyanatobe nzoic acidCAS号：3326-32-7 EINECS号：222-042-0 分子式：C21H11NO5S分子量：389.3807InChI：InChI=1/C21H11NO5S/c23-12-2-5-15-18(8-12)27-19-9-13(24 )3-6-16(19)20(15)14-4-1-11(22-10-28)7-17(14)21(25)26/h 1-9,23H,(H,25,26)分子结构：密度： 1.46g/cm3熔点：360℃沸点：735.6°C at 760 mmHg闪点：398.7°C水溶性：practically insoluble蒸汽压： 1.02E-22mmHg at 25°C【FITC标记原理】当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。

免疫荧光技术操作步骤

免疫荧光技术操作步骤 Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT免疫荧光技术操作步骤一. 直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。

其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。

试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：L，荧光标记的抗体溶液：以 L，的 PBS 进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ 碳酸盐缓冲液 1 份配制搪瓷桶三只（内有 L，的 PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。

实验步骤1. 滴加 L，的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。

2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。

3. 取出玻片，置玻片架上，先用 L，的 PBS 冲洗后，再按顺序过 L，的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。

4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

5. 立即用荧光显微镜观察。

观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。

待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。

注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在 1：20-100 之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。

2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数小时，一般 30 min 已足够。

染色温度多采用室温（25℃左右），高于 37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用 0-2℃的低温，延长染色时间。

荧光素FITC标记抗体的方法

荧光素FITC标记抗体的方法荧光素FITC（Fluorescein Isothiocyanate）标记抗体是一种常用的免疫染色技术，在生命科学研究中广泛应用于细胞、组织和分子的可视化及定量分析。

荧光素FITC标记抗体的方法主要包括材料准备、抗体标记、纯化和检测等步骤。

材料准备：1. 荧光素FITC标记剂（Fluorescein Isothiocyanate）2.抗体样品（可购买或通过克隆等方法获取）3. Phosphate-buffered saline (PBS)缓冲液（pH 7.4）4.碳酸氢钠（NaHCO3）5.钠氢磷酸二水合物（Na2HPO4·2H2O）6.无水甲醇或二甲基亚砜（DMSO）抗体标记：1. 将所需量的荧光素FITC标记剂溶解在无水甲醇或DMSO中，得到FITC标记剂的浓度为1-10 mg/mL。

2.将抗体溶液与FITC标记剂按照一定的比例混合，通常比例为1:1到1:10，充分混合。

3.在充满PBS缓冲液的离心管中加入混合液，并在黑暗条件下，在4°C下孵育1-2小时或过夜，以进行反应。

纯化：1.将样品离心5分钟，以去除半固体物质。

2.用PBS缓冲液洗涤标记抗体1-2次，以去除未反应的FITC和其他杂质。

3.使用滤过设备，例如蛋白尺寸排除柱（如蛋白G纯化柱），将抗体从未反应的FITC和其他杂质中进一步纯化。

检测：1.使用荧光显微镜或流式细胞术检测标记抗体的荧光素FITC信号。

2.荧光显微镜：将样品涂盖在载玻片上，使用适当波长的激发光源照射并观察荧光信号。

3.流式细胞术：将标记抗体与细胞混合，通过流式细胞术仪器检测细胞中FITC的荧光信号。

1.可以在活体组织或细胞中进行实时或定量检测。

2.FITC标记抗体稳定性较好，可以在长时间照射下保持荧光信号不衰减。

3.FITC标记抗体荧光信号强度较高，检测灵敏度较好。

4.FITC标记抗体可以与其他标记的抗体同时使用，实现多重染色。

抗体PE荧光素标记操作流程记录

抗体PE荧光素标记操作流程记录一、实验准备1.1准备工具和试剂：-PE荧光素标记试剂盒（内含PE荧光素和可标记的抗体）-离心管和离心机-蛋白质浓度测定试剂盒-0.01MPBS缓冲液-冷冻干燥机-漩涡振荡器-稀释液（例如BSA或牛血清白蛋白）-显微镜玻璃片和盖玻片1.2样品准备：-准备需要标记的抗体- 确保抗体的浓度在2-5 mg/mL范围内-如果抗体浓度较低，可以进行浓缩处理以提高标记效率-在0.01MPBS缓冲液中稀释抗体至所需浓度二、抗体标记2.1将所需PE荧光素标记试剂盒中的PE荧光素固体完全溶解在10mL 的0.01MPBS缓冲液中2.2取出相应量的标记试剂液至一个离心管中，根据需要调整标记试剂的量，一般建议在1-10倍抗体量的范围内进行标记2.3将标记试剂液加入抗体溶液中，同时进行漩涡振荡混合2.4在室温下孵育标记混合物，时间一般为1-2小时，可以根据需要进行调整2.5在孵育过程中，建议定时轻轻漩涡振荡混合混合物，以确保充分的标记反应三、纯化标记抗体3.1使用离心机将标记混合物离心10分钟，以除去未反应的标记试剂和杂质3.2移除上清液，确保将尽量多的小颗粒留在离心管中3.3向离心管中加入2mL冷PBS缓冲液并混合悬浮液3.4使用离心机将离心管离心5分钟，并移除上清液3.5重复此步骤一次以确保完全去除未反应的标记试剂四、测定纯化后的标记抗体浓度4.1在蛋白质浓度测定试剂盒提供的说明书下，按照指示操作以测定抗体浓度4.2 确保标记抗体浓度在5-10 mg/mL范围内五、保存和储存标记抗体5.1将标记抗体分装至0.5-1mL的离心管中5.2加入10%-20%甘油作为稳定剂，以防止抗体降解和凝集5.3在-20°C以下的冷冻干燥机中冻干标记抗体样品5.4将冻干的标记抗体样品存放在-20°C以下的冰箱中六、实验操作注意事项-实验过程中需要严格遵循无菌操作规范，以防止抗体受到污染-根据实验需要，可以调整抗体和标记试剂的浓度以及反应时间，但需确保最终的标记抗体浓度在有效范围内-尽量避免标记试剂和抗体的过度稀释，以提高标记效率-实验完成后，将实验器材和废液进行正确的处理，以确保实验室环境的安全和清洁以上是抗体PE荧光素标记操作流程的记录，该流程涵盖了实验准备、抗体标记、纯化标记抗体、测定标记抗体浓度以及保存和储存标记抗体的步骤。

抗体的荧光素标记

抗体的荧光素标记
用于标记的抗体，要求是高特异性和高亲和力的。

所用抗血清中不应
含有针对标本中正常组织的抗体。

一般需经纯化提取IgG后再作标记。

作为标记的荧光素应符合以下要求：
①应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合
后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。

②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。

③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。

④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。

⑤标记方法简单、安全无毒。

⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。

常用的标记蛋白质的方法有搅拌法和透析法两种。

以FITC标记为例，搅拌标记法为：先将待标记的蛋白质溶液用0.5ml/LpH9.0的碳酸
盐缓冲液平衡，随后在磁力搅拌下逐滴加入FITC溶液，在室温持续搅
拌4～6h后，离心，上清即为标记物。

此法适用于标记体积较大，蛋白
含量较高的抗体溶液。

优点是标记时间短，荧光素用量少。

但本法的
影响因素多，若操作不当会引起较台强的非特异性荧光染色。

透析法适用于标记样品量少，蛋白含量低的抗体溶液。

此法标记
比较均匀，非特异染色也较低。

方法为：先将待标记的蛋白质溶液装
入透析袋中，置于含FITC的0.01mol/LpH9.4碳酸盐缓冲液中反应过夜，以后再对PBS透析法去除游离色素。

低速离心，取上清。

标记完成后，还应对标记抗体进一步纯化以去除未结合的游离荧
光素和过多结合荧光素的抗体。

纯化方法可采用透析法或层析分离法。