超滤离心法降低重组人脱细胞真皮基质牛血清白蛋白残留量检测中基质效应的实验研究

织工程医疗产品进入人体后，作为异种蛋白可能引起 免疫反应［４－５］。因此，组织工程医疗产品中ＢＳＡ残留 量的检测对其安全评估具有重要意义。 既往我们采用ＥＬＩＳＡ方法检测组织工程人工骨、 肌腱和人工角膜贴片中ＢＳＡ的残留量【６】，但采用相同 方法检测ｒｈＡＤＭ中ＢＳＡ残留量时发现样品浸提液稀 释倍数与测定吸光度（彳）值间相关性较差，且该现象 很难单纯用Ｈｏｏｋ效应进行合理解释，推测可能样品浸 提液对ＥＬＩＳＡ法测定ＢＳＡ残留量有较大的基质效应。 为此，我们设计对样品浸提液进行超滤离心处理，以减 少基质效应对检测的影响。 材料与方法 主要试剂与仪器 ｒｈＡＤＭ由陕西艾尔肤组织工程有限公司提供； ＢＳＡ由北京欣经科生物技术有限公司提供，采用生理 盐水配制成浓度为１ ｍｇ／ｍＬ、１０肛ｇ／ｍＬ溶液备用。超 滤离心管（Ｕｌｔｒａｃｅｌ ＰＬ．１＇００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司，美国）；定量 检测ＢＳＡ酶联免疫试剂盒（无锡博生医用生物技术开 发有限公司）：酶标仪（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ公司，美国）。
１．２
管内管取出，置于未使用的１５ ｍＬ离心管中，标记号 码同Ｉ．２．３。在ＰＲｌ和ＰＲ２管中各加入１０．ｇ／ｍＬ ＢＳＡ 溶液４ ｍＬ，ｒｈＡＤＭ管中加入对应的ｒｈＡＤＭ浸提液
４
ｍＬ。同上法离心后，收集滤液作为待测标本备用。 观测指标 ＢＳＡ回收率测定①标本稀释：采用定量检测
ａｔ
ａｄｄｅｄ ２ ｍＬ ｏｆ ｒｈＡＤＭ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｉｎｔｏ ｒｈＡＤＭ ｔｕｂｅｓ（ｒｈＡＤＭ １ ａｎｄ ｒｈＡＤＭ２）．Ｔｈｅ ｔｕｂｅｓ ｏｆ ｕｌｔｒａ－
ｌ ５００。ｇ ｆｏｒ ２０ ｍｉｎｕｔｅｓ．Ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｓｔｅｐｓ ｗｅｒｅ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｏｒ ３ ｔｉｍｅｓ．Ｔａｋｅ ｔｈｅ ｉｎｎｅｒ—ｔｕｂｅ
ｋｉｔ．Ｔｈｅ
ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆ
１０｝ｌｇ／ｍＬ ＢＳＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｌ ａｎｄ ２ ｗｅｒｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ １０峙．／ｍＬ ＢＳＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ａｓ ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｓａｍｐｌｅ，ｍａｒｋｅｄ ＲＩＯ ａｎｄ Ｒ２０ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）．Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｌｏｇａｒｉｔｈｍ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ
影响；样品浸提液自身对超滤离心管的预饱和处理，可得到较为理想的ＢＳＡ回收率。 【关键词】 牛血清白蛋白残留量
Ｒ４４６．６１
重组人脱细胞真皮基质 文献标志码：Ａ
超滤离心
基质效应
中图分类号：Ｒ３７３
ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＳＴＵＤＹ ＯＮ ＵＬ＿ＴＲＡ－ＦＩＬ．ＴＲＡＴＩＯＮ ＩＮ ＲＥＤＵＣＩＮＧ ＭＡＴＲＩＸ ＥＦＦＥＣＴＳ ＯＦ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴｌＯＮ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ
Ｃｏｎｔｒｏｌｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，１０００５０，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ．Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＦＡＮＧ Ｙｕ，Ｅ—ｍａｉｌ：向ｎｇｙｕ＠
ｔｈｅ ｍａｔｒｉｘ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ
ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｔｅｄ．Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＢＳＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ｔｈｅ
ＢＳＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｌｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ
ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ＢＳＡ ＥＬＩＳＡ
ａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｄｅｒｍａｌ ｍａｔｒｉｘ，
ｒｈＡＤＭ）样品浸提液对ＥＬＩＳＡ方法检测牛血清白蛋白（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ）残留量的基质效应。 洗ｒｈＡＤＭ后，制各ｒｈＡＤＭ生理盐水浸提液。取超滤离心管若干，分别加入ｌ
ｍｇ／ｍＬ
方法清
ＢＳＡ溶液（预饱和方式ｌ，记作
ＰＲＩ）、１０ ｐｇ／ｍＬ ＢＳＡ溶液（预饱和方式２，记作ＰＲ２）和ｒｈＡＤＭ浸提液２ ｍＬ（记作ｒｈＡＤＭｌ和ｒｈＡＤＭ２），ｌ ５００×ｇ离 心２０ ｍｉｎ，重复操作３次后取出离心管内管，放入未使用的１５ ｍＬ离心管中，在ＰＲＩ和ＰＲ２管中加入ｌＯ ｐｇ／ｍＬ ＢＳＡ溶液
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｈｕｍａｎ ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｒｍａｌ ｍａｔｒｉｘ
Ｕｌｔｒａ．
Ｍａｔｒｉｘ ｅｆｆｅｃｔｓ
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｉｔｅｍ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆＣｈｉｎａ（３０６７０５７３）
重组人脱细胞真皮基质（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
ａｎ
ｃｏｅｆ！ｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓ ｒａｉｓｅｄ ｆｒｏｍ一０。７２７ ｔｏ一０．９６０ ａｆｔｅｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍａｔｒｉｘ ｅｆｆｅｃｔｓ
ｃａｎ ｃａｎ
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
Ｔｈｅ
ｂｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｙ ｕｌｔｒａ－ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ。ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ
基金项目：国家自然科学摹金资助项目（３０６７０５７３） 作者单位：中国药品牛物制品检定所医疗器械质量监督检验中心（北京，１０００５０） 通讯作者：方玉，高级工程师，研究方向：医疗器械生物学评价，Ｅ－ｍａｉｌ：ｆａｎｇｙｕ＠ｎｉｃｐｂｐ．ｏｒｇ．ｃｎ
中国修复重建外科杂志２００８年９月第２２卷第９期
ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｒｍａｌ
ｈｕｍａｎ
标记为ＰＲｌ，每支加入１
ｍｇ／ｍＬ
ＢＳＡ溶液２ ｍＬ（预饱
ｐｇ／ｍＬ ＢＳＡ
ｍａｔｒｉｘ，ｒｈＡＤＭ）由胶原与人源性成纤
和方式１）；３支标记为ＰＲ２，每支加入１０
维细胞所分泌的ＥＣＭ共同构建而成，可用于修复烧 伤、烫伤、创伤、慢性溃疡等因素造成的皮肤缺损［Ｉ－３１。 在组织工程医疗产品构建中，ＦＢＳ是大多数细胞培养 液以及产品保存液中的重要成分。当以牛血清白蛋白
４
ｍＬ，ｒｈＡＤＭ管中加入ｒｈＡＤＭ浸提液４ ｍＬ，同上法离心后，收集滤液。用ＥＬＩＳＡ法测定ＢＳＡ含量。计算不同预饱和
方式下１０｝ｌｇ／ｍＬ ＢＳＡ溶液的ＢＳＡ回收率（以未经处理的１０ ｐｇ／ｍＬ ＢＳＡ溶液作为基础样品，分别记作Ｒ１０和Ｒ２０）；计算 滤液稀释倍数的对数与测定吸光度（一）值的相关系数，并与未经超滤离心处理的浸提液检测结果进行比较。 结果采 用预饱和方式ｌ处理后，ＰＲＩ ＢＳＡ浓度为（２３．８０ ４－１．５８），ｇ／ｍＬ，Ｒ１０为（９．０４ ４－０．２４）肛ｇ／ｍＬ，ＢＳＡ回收率为２６３．４％４－ １６．９％。采用预饱和方式２处理后，ＰＲ２ ＢＳＡ浓度为（８．６４ ４－０．２４）ｐｇ／ｍＬ，Ｒ２０为（８．１２ ４－１．０１）ｐｇ／ｍＬ，ＢＳＡ的回收率为 １０６．５％４－３．Ｏ％。预饱和方式２的回收率符合检测要求。不同预饱和方式下ＢＳＡ回收率差异有统计学意义（尸＜０．０１）。 经超滤离心处理后，滤液稀释倍数的对数与Ａ值之间的相关性明显提高，相关系数由－０．７２７提高至一０．９６０。超滤处理后 的相关系数符合检测要求。 结论超滤离心处理可以有效减少ｒｈＡＤＭ样品浸提液的基质效应对ＢＳＡ残留量检测的
・１１２６・
Ｃｈｍｅ∞Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＲｅｐａｒａｔｉｖｅ ａｎｄ ＲｅｃｏｎｓｍＪｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００８。Ｖ０１．２２，Ｎｏ．９
超滤离心法降低重组人脱细胞真皮基质牛血清白蛋白 残留量检测中基质效应的实验研究
方玉杜晓丹奚廷斐冯晓明
【摘要】 目的探讨采用超滤离心法减少重组人脱细胞真皮基质（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｈｕｍａｎ
ａｎｄ
Ｒ２０
ｗａｓ（８．６４±０．２４），ｇ／ｍＬ ａｎｄ（８．１２±１．０１）峙，ｍＬ＇ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ １０¨ｇ／ｍＬ ＢＳＡ ｗａｓ ２６３．４％±
１６．９％ａｎｄ １０６．５％±３．０％ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｕｌｔｒａ—ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｔｕｂｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｓａｔｕｒａｅｄ ｂｙ ＰＲＩ ａｎｄ ＰＲ２（Ｐ＜０．０１），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ＇．Ｔｈｅ ＢＳＡ
ｎｉｃｐ印．ｏｒｇ．ｃｎ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｏｆ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｌｔｒａ—ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ
ｒｅｄｕｃｉｎｇ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｈｕｍａｎ ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｒｍａｌ ｍａｔｒｉｘ（ｒｈＡＤＭ）ｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）ｂｙ ＥＬＩＳＡ．
ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｕｎｕｓｅｄ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ．Ａｄｄｅｄ ４ ｍＬ ｏｆ １０ ｐｇ／ｍＬ ＢＳＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ＰＲＩ ａｎｄ ＰＲ２ ｔｕｂｅｓ，４ ｍＬ ｏｆ ｒｈＡＤＭ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ
ｉｎ
ｒｈＡＤＭ ｔｕｂｅｓ，ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ
ａｔ
ｌ ５００。ｇ ｆｏｒ ２０ ｍｉｎｕｔｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ
ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＢＳＡ
ｂｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｗｈｅｎ
ｕｌｔｒａ．ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｔｕｂｅ ｉｓ ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｅｄ ｂｙ ｓａｍｐｌｅ ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔ．
Ｒｅｓｉｄｕａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
ａｌｂｕｍｉｎ
ｔｈｅ
ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ（Ａ）ｖａｌｕｅ ｗａｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｅｘａｃｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｕｌｔｒａ．ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
Ｔｈｅ ＢＳＡ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＲＩ ａｎｄ Ｒ１０
ｗａｓ（２３．８０±１．５８），ｇ／ｍＬ ａｎｄ（９．０４±０．２４）岖，／ｍＬ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．１１１ｅ ＢＳＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＲ２
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ａｓ
Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｒｈＡＤＭ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ：ｒｈＡＤＭ ｗｅｒｅ ｒｉｎｓｅｄ．ａｎｄ ｔｈｅｎ ｒｈＡＤＭ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ａｓ
ｓａｌｉｎｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ
ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ．Ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ百度文库ａｎｄ ｕｌｔｒａ．ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：ｍａｒｋｅｄ ｔｈｅ ｕｌｔｒａ－ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｔｕｂｅｓ
ＰＲｌ（ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ
ｐｒｏｔｏｃｏｌ １），ＰＲ２（ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ２）ａｎｄ ｒｈＡＤＭ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｄｄｅｄ ２ ｍＬ ｏｆ １ ｍｇ／ｍＬ ａｎｄ １０ １．ｔｇ／ｍＬ ＢＳＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉＩｌｔｏ ＰＲ ｌ ａｎｄ ＰＲ２ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｃｅｎｔｆｉｆｕｇｅｄ
ＨＵＭＡＮ
ＡＣＥＬＬＵＬＡＲ ＤＥＲＭＡＬ ＭＡＴＲＩＸ
ＩＭＭＥＲＳｌＯＮ
ＯＮ
ＲＥＳｌＤＵＡＬ
ＢＯＶＩＮＥ ＳＥＲＵＭ ＡＬＢＵＭＩＮ
ＭＥＡＳＵＲＥＭＥＮＴ ＢＹ ＥＬｌＳＡ／ＦＡＮＧ ｈ，ＤＵ Ｘｉａｏｄａｎ，ＸＩ Ｔｉｎｇｆｅｉ，ＦＥＮＧ Ｘｉａｏｍｉｎ昏Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｆ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＮａｔｉｏｎａＩ
ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＰＲ２
ｍｅｔ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｅｍａｎｄ．Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａ ｖａｌｕｅ ａｎｄ ｓａｍｐｌｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｒｈＡＤＭ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａ．ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ． ｔｈａｔ
（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ
溶液２ ｍＬ（预饱和方式２）；２支标记为ｒｈＡＤＭｌ，２支 标记为ｒｈＡＤＭ２，每支分别加入对应的ｒｈＡＤＭ浸提液
２
ｍＬ。离心管均于ｌ ５００×ｇ条件下离心２０ ｍｉｎ，重复 样品超滤离心将经过预饱和处理的超滤离心
处理３次。
１．２．４
ａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ）为主要成分的ＦＢＳ随组