超滤离心法降低重组人脱细胞真皮基质牛血清白蛋白残留量检测中基质效应的实验研究
脱细胞真皮基质-在制备过程中去除了表皮和真皮
脱细胞真皮基质-在制备过程中去除了表皮和真皮脱细胞真皮基质-在制备过程中去除了表皮和真皮中的细胞成分，仅保留真皮的不溶性基质成分，具有低抗原性、快速血管化和一定的稳定性。
脱细胞真皮基质为规则的三维网状支架，Ⅰ型胶原纤维占主要地位，构成脱细胞真皮基质的基本骨架；Ⅲ型胶原纤维减少至原来的一半；Ⅳ型胶原纤维和Ⅶ型胶原纤维几乎消失。
弹力蛋白明显减少，层粘连蛋白损失较多，硫酸软骨素消失殆尽，纤维连接素明显减少，糖蛋白几乎完整保存。
学术术语来源——人、猪、大鼠来源网状层真皮组织学及材料学表征的比较文章亮点：1 课题组前期研究发现猪边腹部网状层真皮较其他部位更适合作为异种脱细胞真皮支架的制作材料，但其组织学及材料学特点未见报道。
2 实验创新比较人、猪边腹部、Wistar大鼠背部网状层真皮的组织学及材料学表征，发现猪边腹部网状层真皮组织胶原纤维束直径及热力学行为与人接近，杨氏模量与人无统计学差异，取皮面积也较大鼠面积大，在单块较大面积脱细胞真皮材料的制作方面具有较好的应用前景；大鼠背部网状层真皮组织胶原纤维束排列与人类似，Ⅰ、Ⅲ型胶原含量及其比值也接近于人，热稳定性较好，在脱细胞真皮材料制作方面也具有一定的应用价值，在较小面积的脱细胞真皮材料制作时其临床效果可能优于猪边腹部网状层真皮。
关键词：生物材料；材料相容性；猪边腹部；大鼠；网状层真皮；间隙率；胶原束直径；苦味酸-天狼星红染色；杨氏模量主题词：真皮；猪；人；大鼠摘要背景：课题组以往研究证实，猪边腹部网状层真皮质地柔软，伸展性也较其他部位好，适合作为异种脱细胞真皮的制作材料，但将其与人网状层真皮和大鼠网状层真皮进行组织形态学和材料学表征的系统对比未见相关报道。
目的：研究猪边腹部、大鼠背部与人网状层真皮在组织学、生物力学、分子结构和热稳定性等方面的差异。
方法：取人、猪边腹部、Wistar大鼠背部网状层真皮标本并大体观察，石蜡切片后行苏木精-伊红染色、苦味酸-天狼星红染色，显微照相后用图像分析软件测量分析；样本真空干燥并复水后用电子拉伸机测量其力学性能并计算杨氏模量；真空干燥后的样品研碎后用傅里叶红外光谱仪及同步热分析仪分析测量。
牛乳酪蛋白降血压肽的超滤分离
牛乳酪蛋白降血压肽的超滤分离蒋菁莉，任发政*，蔡华伟(中国农业大学食品科学与营养工程学院，教育部-北京市功能乳品实验室，北京 100083)摘 要：采用超滤法分离酪蛋白降血压多肽溶液，研究超滤操作压力、温度和溶液浓度对膜渗透通量的影响，结果表明，超滤分离浓度为5%的多肽溶液，压力为0.15M P a ，温度为45℃条件下，膜渗透通量相对较高；利用高效凝胶排阻色谱技术分析超滤滤过液的相对分子量分布。
结果表明，超滤技术可以实现不同分子量多肽组分的分离；多肽超滤滤过液的A C E 抑制活性提高。
关键词： 超滤；降血压多肽；酪蛋白Separation of Antihypertensive Peptides Derived from Yak Milk Casein with Ultra-filtration TechnologyJIANG Jing-li ，REN Fa-zheng*，CAI Hua-wei (Key Laboratory of Functional Dairy, Ministry of Education and Municipal Government of Beijing, College of FoodScience and Nutritional Engineering, China Agricultrual University, Beijing 100083, China)Abstract ：Antihypertensive peptide derived from yak milk casein was separated by ultra-filtration technology. The effects of pressure, temperature and concentrations of peptides on ultra-filtration permeate flux were investigated. The results showed that the optimum conditions are: 5% peptides, pressure 0.15MPa and temperature 45℃. The relative molecular mass of permeates was investigated by high performance size exclusion chromatography. The results showed that the peptides mixtures can be effectively separated by ultra-filtration. The permeate fractions show higher ACE inhibitory activity than original peptide mixtures.Key words ：ultra-filtration ；antihypertensive peptides ；casein中图分类号：TS252.59 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2006)07-0124-05收稿日期：2006-04-07 *通讯作者基金项目：“十五”奶业专项基金资助项目(2002BA518A-05)作者简介：蒋菁莉(1979-)，女，博士研究生，研究方向为功能乳制品加工。
超滤膜分离牛血清蛋白的操作条件优化研究
超滤膜分离牛血清蛋白的操作条件优化研究张晓艳;姜英;王龙飞;王旭;许海丽【摘要】本文采取超滤膜技术进行分离实验,用紫外分光光度计进行分离结果测量.通过聚砜聚乙烯超滤膜分离牛血清蛋白的研究,以主要影响的因素:牛血清蛋白的浓度、流量,膜前后压力来确定影响分离效果的因素,通过配制一系列不同的牛血清蛋白水溶液浓度和吸光度做出的标准曲线,清浓液浓度对比,以及用正交实验的方法对实验数据进行处理,即可得到膜分离的最佳条件.最后由正交实验得出最佳条件为第六组实验条件:浓液流量为8L/h,清夜流量为2.5L/h,膜前压力为0.200Mpa,膜后有压力为0.176Mpa.由最佳条件可知,若要提高超滤膜分离效率,需减小清液流量并且增大膜前压力.【期刊名称】《赤峰学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(033)016【总页数】3页(P5-7)【关键词】超滤;膜分离技术;牛血清蛋白;正交实验;最佳条件【作者】张晓艳;姜英;王龙飞;王旭;许海丽【作者单位】赤峰学院化学化工学院, 内蒙古赤峰 024000;赤峰学院化学化工学院, 内蒙古赤峰 024000;赤峰学院化学化工学院, 内蒙古赤峰 024000;赤峰学院化学化工学院, 内蒙古赤峰 024000;赤峰学院化学化工学院, 内蒙古赤峰 024000【正文语种】中文【中图分类】Q592膜分离技术是一种已经被广泛应用的新型分离技术，它采用的分离介质是对组分拥有有选择透过性的天然高分子薄膜或人工合成的无机膜等凝结相物质，其膜有气态、液态、固态的一相或复合相[1].在生产等工程中为了达到混合物分离的目的，通常可以使膜两侧产生一定的梯度差异进而形成相应的推动力，使原料中的某组分可以有选择性地优先透过分离膜，继而使其依次经过浓缩、提取，纯化等单元操作得到所需产物的一种新型分离过程[2].牛血清白蛋白(BSA)在生物体内主要有两种作用,一是平衡渗透压，二是维持营养的运转，它不仅是一种重要的载体蛋白，在生物学中，也是一种重要的模式蛋白[3].因其分子量较大，故在分离实验中，分离效果明显，所形成的实验数据能够清晰并且直观的表现出影响分离效果的因素.正交试验被叫做正交设计，它是以数理统计和概率论和为理论基础，科学地安排多种因素作为实验的研究对象，这是一类实用性比较强的数学方法[4].2.1 实验装置在本次实验中，采用聚砜聚丙烯膜为实验装置，由于本次实验为模拟实验，因此最大工作压力和透过液通量都低于工业现场实际使用情况，实验中，压力不可超过膜组件的承受范围.主要工艺参数如表1.2.2 实验内容及分析2.2.1 实验步骤以自来水为原料，利用紫外分光光度计测量料液通过超滤膜后浓液和清液的吸光度进而分析膜的渗透通量随时间的衰减情况，操作压力和清液、浓液浓度对渗透通量的影响.操作步骤如下：标准曲线：用电子天平称量牛血清蛋白（生化试剂），加蒸馏水使其溶于烧杯中，配置出不同浓度的溶液，继而在紫外分光光度计上测得到标准曲线.2.2.1.1 控制膜前、膜后压力、清液流量不变，调节浓液流量大小（1）先向料液槽内加入适量自来水，再将适宜牛血清蛋白倒入料液灌中的自来水，打开泵进口阀、超滤进口阀和超滤出口阀，关闭微滤出口阀和微滤进口阀，打开电源、泵、仪表开关.（2）控制泵的回流阀，控制压力表的压力为某一压力值（不超过0.2MPa），稳定清液流量在某一值，调节浓液流量计，待稳定好后取少许清液和浓液分别为样液1和样液2.（3）将样液1和样液2分别在紫外分光光度仪内测出相应的浓度.隔一定的时间，多取几组样液进而测量.（4）记录相关数据.2.2.1.2 控制膜前、膜后压力、浓液流量不变，调节清液流量大小（1）先向料液槽内加入适量自来水，再将适宜牛血清蛋白倒入料液灌中的自来水，打开泵进口阀、超滤进口阀和超滤出口阀，关闭微滤出口阀和微滤进口阀，打开电源、泵、仪表开关.（2）控制泵的回流阀，控制压力表的压力为某一压力值（不超过0.2MPa），稳定浓液流量在某一值，调节清液流量计，待稳定好后取少许清液和浓液分别为样液3和样液4.（3）将样液3和样液4分别在紫外分光光度仪内测出相应的浓度.隔一定的时间，多取几组样液进而测量.（4）记录相关数据.2.2.1.3 控制清液流量、浓液流量不变，调节膜前、膜后压力（1）先向料液槽内加入适量自来水，再将适宜牛血清蛋白倒入料液灌中的自来水，打开泵进口阀、超滤进口阀和超滤出口阀，关闭微滤出口阀和微滤进口阀，打开电源、泵、仪表开关.（2）控制泵的回流阀，稳定浓液流量和清液流量分别在某一值，调节压力表的压力值（不超过0.2MPa），待稳定好后取少许清液和浓液分别为样液5和样液6. （3）将样液5和样液6分别在紫外分光光度仪内测出相应的浓度.隔一定的时间，多取几组样液进而测量.（4）记录相关数据2.2.1.4 实验结束，关闭实验仪器并清洗实验仪器，整理实验数据.2.2.2 实验内容将样液用紫外分光光度计进行检测，采用蒸馏水为基准，分光光度计波长设为280nm，光度模式为单波长法，得到紫外光谱，得到校正曲线如下：通过标准曲线可以的到浓度与吸光度的关系，y=-0.13613+0.68985x，R^2=0.99972.可以得出各种不同浓度下溶液的吸光度或者已知吸光度得到不同吸光度的溶液的浓度.影响分离的因素有牛血清蛋白的浓度、流量，膜前后压力，分别控制每一个变量，根据实验数据判断出个影响因素之间的影响，综合起来就可以得到分离牛血清蛋白的最优条件.由此清浓液对比折线图可以看出，设定的清液浓度和浓液浓度变化范围不大，浓液浓度在0.8g/L左右，清液浓度在0.4g/L左右，但清液浓度和浓液浓度之间差别较大，更加清楚的反应出实验结果.以自来水为原料，考察当料液通过超滤膜后，膜的渗透通量随时间的增加而衰减的情况，并考察膜表面流速和操作压力对渗透通量的影响.操作步骤如下：用去离子水清洗超滤组件，加热到60℃后清洗超滤组件2～3次.在原料液储槽中加入一定量的自来水后，打开低压料液泵回流阀和低压料液泵出口阀，打开超滤料液进口阀、超滤清液出口阀和浓液出口阀，则整个超滤单元回路已畅通.将泵启动，等到泵运转稳定后，通过控制和调整泵出口阀门和超滤馏液出口阀门，来达到实验所需要的流量和压力，待稳定后，测量一定实验时间内的渗透液体积，每十分钟一次，做好记录.调节膜后的压力为0.03 MPa，待稳定后，测量渗透液的体积,，做好记录.然后依次增加膜后的压力分别为0.04MPa，0.06MPa，0.08MPa，分别测量渗透液的体积，做好记录.利用用去离子水清洗超滤组件，方法同上.加入保护液甲醛溶液于超滤膜组件中，然后密闭系统，避免保护液的损失，到此，实验结束. 由表2可以得出，B组即清液流量的大小和C组膜前压力值对超滤膜分离牛血清蛋白的效果影响比较大,A组浓液流量的大小和D组膜后压力值对分离效果影响最小.并且影响因素由主到次为，清液流量，膜前压力，膜后压力，浓液流量，最优组合条件为第一组实验的实验条件.在本次试验中，对超滤膜的性能有一定的要求，其中有一个重要的参数为截留率(R)，截留率是指溶液经过超滤处理后，被膜截留的溶质质量占溶液中该溶质总量的百分率.截留率可以直观的表现出超滤膜的性能是否合格，在本次实验所采用的超滤膜经过测试截流率为0.9992，达到实验的标准.由实验结果得出，清液流量和膜前压力对超滤膜分离的效果影响最为显著，因此，若要得到最为理想的分离效果，需减小清液流量同时增大膜前压力.【相关文献】〔1〕张云飞，田蒙奎，许奎.我国膜分离技术发展的现状[J].现代化工学报，2017，37（4）. 〔2〕王华,刘艳飞,彭东明,王福东,鲁曼霞.膜分离技术的研究进展及应用展望[J].应用化工，2013(3). 〔3〕吕华，单晓辉.碳量子点的制备及与牛血清蛋白的相互作用[J].新型碳材料，2013（28）：308-310.〔4〕秦颖.正交实验设计法在造纸试验中的应用[J].黑龙江造纸,2006（1）：42-45.。
牛的牛血清白蛋白残留检测酶联免疫分析(ELISA)
牛的牛血清白蛋白残留检测酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定牛血清，血浆及相关液体样本中类牛血清白蛋白残留检测的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中牛的牛血清白蛋白残留检测水平。
用纯化的牛的牛血清白蛋白残留检测抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入类牛血清白蛋白残留检测，再与HRP标记的类牛血清白蛋白残留检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的类牛血清白蛋白残留检测呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中牛的牛血清白蛋白残留检测浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存标准品：2700ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
脱细胞真皮基质分析报
、八、、》刖言大面积深度烧伤或其他创伤导致皮肤真皮成分缺损，通过刃厚小皮片或微粒植皮技术虽然能使创面愈合，但由于其缺乏真皮层，导致愈合后创面弹性差，凸凹不平，易挛缩且不耐摩擦。
移植自体皮瓣或全厚及中厚皮片固然是最好的方法，但大面积深度烧伤后，能作为供皮区的部位已很少，供皮区又将形成同等程度的缺损，日后形成瘢痕。
为解决这一问题，国内外学者致力于寻找一种理想的真皮替代品。
1. 脱细胞真皮基质概述脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix ADM ）是用物理、化学等方法将人或动物皮肤中的表皮层及细胞成分彻底去除仅保留真皮中含胶原网架的细胞外基质。
脱细胞真皮基质由于完全没有了细胞成分和I、U型细胞相容性抗原的主要免疫活性,故一般不会诱发排斥反应。
但脱细胞真皮基质保留有正常胶原的三维结构和真皮中含胶原支架的细胞外基质能为组织细胞的再生提供一个良好的支架结构，具有创面覆盖、组织缺损填充、引导组织再生和支架等作用。
脱细胞真皮基质中无细胞成分，免疫活性低，不会诱发免疫反应。
它保留了表皮和真皮间的基底膜，移植后可形成真皮面和基底膜面。
基底膜面可支持断层皮片的生长，这对表皮细胞的增殖分化以及移植皮的外观和功能起着重要作用，同时也有利于种子细胞的點附增殖等。
真皮面利于脱细胞真皮基质的快速血管化，为成纤维细胞的增殖提供支架，有助于胶原成分改建，促使成纤维细胞排列分布规则,形成结构形态正常的胶原纤维，此外,还有诱导、调节宿主细胞和新生血管长入,促进上皮形成等作用。
此外,细胞外基质蛋白也可以促进表皮细胞的再生。
因此，脱细胞真皮基质可作为真皮替代品，在为烧伤创面提供真皮的同时，可明显减少瘢痕形成。
是一种理想的真皮替代材料。
1.1脱细胞真皮基质的制备方法根据来源的不同脱细胞真皮基质分为异体脱细胞真皮基质（来源主要为尸体皮）和异种脱细胞真皮基质（来源为动物皮以猪皮和牛皮为主）两种。
制备过程都是尽可能的去除具有抗原性的细胞（表皮细胞、毛囊、皮脂腺、汗腺及真皮中血管内皮细胞、成纤维细胞等）,保留完整的胶原纤维成分和组织基本结构。
不同方法纯化颗粒脂肪的效果评价及其对移植后转归的影响
不同方法纯化颗粒脂肪的效果评价及其对移植后转归的影响自体脂肪移植术(autologus fat transplantation,AFT),又称自体脂肪注射,是利用自身脂肪组织作为填充材料修复皮下软组织缺损一种手段。
与人造材料和异种材料相比,自体脂肪获取便捷,价格低廉且具有更好生物相容性,在整形美容外科中的应用非常广泛。
临床工作中,移植后脂肪的存活情况是医患双方最为关注的问题,而抽吸后脂肪的纯化处理与脂肪组织的存活情况直接相关。
目的对棉垫吸附(AWG,Absorptionwithgauze)法、离心分离(CEN,Centrifugation)法以及静置沉淀(DEC,Decantation)法纯化处理脂肪的效果进行评价,并在动物实验中对移植物转归进行比较分析,以初步探索其影响移植物存留和转归的具体机制。
方法将人腹部来源的抽吸颗粒脂肪分别经棉垫吸附法、离心分离法、静止沉淀法进行纯化处理。
在体外实验中,将纯化后脂肪经高速离心处理,使得液体成分、油脂、脂肪组织分离,测量各自体积以评价不同方法的纯化效力。
通过组织学检测和代谢功能检测对不同方法纯化后脂肪组织的结构和功能完整性进行比较;经胶原酶消化获得脂肪组织中的血管周围基质成分(Stromal Vascular Fraction,SVFs),利用流式细胞分析仪对中的细胞成分进行分析;将SVFs细胞贴壁培养至第三代,获得脂肪间充质干细胞(Adipose-Derived Stem Cells,ADSCs,)利用 CCK8(Cell Counting Kit-8)试剂绘制细胞增殖曲线,并对其细胞周期和凋亡情况进行检测,通过成脂、成骨、成软骨分化对其分化活性进行比较;使用免疫缺陷小鼠构建颗粒脂肪移植的动物模型,于注射后3天,6天,9天,12天,3周,6周,9周,12周取出移植后脂肪。
通过称取移植物重量、测量体积对不同方法纯化后脂肪组织的存留情况进行比较;组织学用脂周蛋白染色标记活性良好的脂肪细胞,比较不同方法纯化后脂肪在体内的存活情况。
小牛血清去蛋白提取物的常用分析方法
现代商贸工业小牛血清去蛋白提取物的常用分析方法孙秀娥(吉林工程技术师范学院，吉林长春130052)摘要：多年来，对小牛血清去蛋白提取物的研究中，对组分分离及所含组分的结构确证一直是个难题，尤其 是有效成分的分析方法更是值得深入研究的课题。
关键词：小牛血清去蛋白提取物；有效成分；分析方法中图分类号：G4 文献标识码：A doi：10. 19311/j,cnki. 1672-3198. 2016. 34. 266在常用的分析方法中高效液相色谱法可分析游离氨基酸含量；毛细管区带电泳可得到产品的指纹图谱；液质联用可测出初步的相对分子质t t信息；加热、烘烤、酸碱处理、萃取、接种微生物发酵等方法可以帮助推测产品中成分组成。
细胞实验中同位素标记法可测脂肪生成增加率；微量减压技术可测产品促进豚鼠肝匀浆耗氧量，得到呼吸活性分析9丁亚军，王莹等对小牛血清去蛋白提取物的药理、毒理作用进行研究，并将其主要成分和活性指标与爱维治比较。
研究结果表明两药对比差异无显著性。
李爱菊，郑宏强，熊爱琴用异硫氰酸_酯（Isothiocyanate，PITC)柱前衍生高效液相 色谱法 (HPLC法）测 定小牛血清去蛋白提取物制剂中游离氨基酸。
任淑萍对小牛血清去蛋白注射液与小牛血去蛋白注射液有效成分含量和生物活性的比较研究，采用 H PL C法进行鉴定分析，用Low ry法测定多肽含量，用 瓦氏微量呼吸检压仪测定呼吸活力并计算刺激指数，测定两者对小鼠耐缺氧试验的不同影响时间，比较两 者在主要成分、多肽含量、生物活性等方面的差异s赵 宗阁，王尊文等在画内小牛血、小牛血清去蛋白提取物注射液质量分析及其抗缺氧作用研究中，采用Lowry 法测定多肽含量，IT C作为衍生剂的高效液相色谱法测定游离总氨基酸，瓦氏呼吸实验测定其促进豚鼠肝匀浆呼吸活性，H P L C法鉴定双峰肽图。
体外抗缺氧实验采用M T T比色法测定其对缺氧诱导神经细胞损伤保护作用。
超滤法(ultrafiltration)分离明胶厚壳贻贝血清蛋白溶液
超滤法（ultrafiltration）分离明胶厚壳贻贝血清蛋白溶液一、实验目的1.熟悉超滤的基本原理、板式超滤器的结构及基本流程2.了解超滤过程中的影响因素如温度、压力、流量及物料分子量等因素对超滤通量的影响3.了解超滤器污染的原因及其对策二、实验原理超滤的技术原理近似机械筛分。
当溶液体系由水泵进入超滤器时，在超滤器内的膜表面发生分离，溶剂（水）和其他小分子量溶质透过具有不对称微孔结构的滤膜，大分子溶质和微粒（如蛋白质、病毒、细菌、胶体等）被滤膜截留（图1）。
从而达到分离和纯化的目的。
图1 超滤技术原理示意图一般来说，以截留分子量来间接地反映超滤膜孔径的大小，具体做法是：通过测定具有相似化学性质的不同分子量的一系列化合物的截留率所得的曲线，根据该曲线求的截留率大于90%的分子量即为截留分子量（图2）。
通常截留分子量在500～106间的膜分离过程称为超滤。
表征超滤膜性能的参数除截留分子量外，还有截留率和膜的纯水通量。
截留率是指对一定分子量的物质来说，膜所能截留的程度，其定义为式中C f为料液的浓度，C p为超滤液的浓度。
膜的纯水通量是指料液为纯水时，单位时间透过纯水的体积，一般是在0.13～0.3 MP a压力下测定的实验装置图3为本实验的流程，料液先放入料液槽，由泵供给，旁路阀3用以调节进料流量，用出口阀4调节进出口压力，料液泵入系统后，超滤液用一排塑料收集管收集，截留液进入料液槽循环。
三、实验材料：厚壳贻贝血清溶液四、实验仪器和试剂：NaOH, 去离子水，真空抽率仪，滤纸，低温离心机，0.45μm孔径滤膜，制冰机，五、实验步骤1.将贻贝血清于4℃，13000rpm 离心，取上清液，并用0.45μm孔径滤膜过滤。
2. 关闭进口阀1，向料液槽加入一定量的去离子水排出泵内空气后，按说明书将滤膜装于超滤仪上，并拧紧。
3．合上电源，启动泵，打开出口阀4，并半开进口阀1，然后从小到大不断关闭出口阀，使出口压力表的读数由小到大发生变化（注意不能超过压力表的量程范围，推荐值为20psi），4．清洗完毕后，先打开出口阀，再关闭进口阀，停止进料泵。
ELISA法检测干细胞溶液中残留牛血清白蛋白含量
ELISA法检测干细胞溶液中残留牛血清白蛋白含量宛莹;聂德志;贲亮;黄若洋【摘要】目的检测胎牛血清白蛋白(Fetal bovine serum albumin,BSA)在脐带源间充质干细胞溶液的含量以代表异源蛋白在脐带源间充质干细胞溶液中的残留情况的适用性,并通过改进培养条件和增加清洗次数以进一步减少BSA等异源蛋白在脐带源间充质干细胞溶液内的残留.方法运用定量ELISA方法检测了脐带源间充质干细胞溶液中BSA的含量,并探讨改进培养方式与增加清洗次数等方法对干细胞溶液中残留的BSA含量的影响.结果对细胞清洗次数的增加能够有效减少BSA等异源蛋白的残留,并且采用无血清培养基进行干细胞培养是减少BSA等异源蛋白在干细胞溶液内残留量的最有效方法.结论通过检测BSA以代表异源蛋白在脐带源间充质干细胞溶液中残留情况具有适用性；并且增加清洗次数能有效地降低BSA的残留量；采用无血清培养基进行干细胞培养是减少BSA等异源蛋白在干细胞溶液内残留量的最有效方法.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2013(017)010【总页数】3页(P1764-1766)【关键词】BSA;脐带源间充质干细胞;ELISA;无血清培养基;细胞培养【作者】宛莹;聂德志;贲亮;黄若洋【作者单位】四平中心人民医院中心实验室,吉林四平136000;吉林省拓华生物科技有限公司,吉林四平136000;四平中心人民医院中心实验室,吉林四平136000;吉林省拓华生物科技有限公司,吉林四平136000;四平中心人民医院中心实验室,吉林四平136000;吉林省拓华生物科技有限公司,吉林四平136000;四平中心人民医院中心实验室,吉林四平136000;吉林省拓华生物科技有限公司,吉林四平136000【正文语种】中文【中图分类】R446.61间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞，是造血微环境中一种重要细胞成分，目前临床实验证实间充质干细胞移植可用于组织的修复及治疗间充质组织遗传缺陷性疾病，临床应用前景广阔［1－4］。
超滤膜分离牛血清蛋白
超滤膜分离牛血清蛋白作者：王兴权来源：《赤峰学院学报·自然科学版》 2011年第12期王兴权（赤峰市特种设备检验所，内蒙古赤峰 024000）摘要：运用膜分离现代分离技术对牛血清蛋白溶液浓缩，实现物质纯化与分离.关键词：膜分离；浓缩；牛血清蛋白中图分类号：TQ464.7 文献标识码：A 文章编号：1673-260X（2011）12-0166-03膜及其相关技术在自然界中扮演着越来越重要的角色，它的产生和发展与人类的生活密切相关，在人类的生活与实践中，人们早已不自觉地接触和应用到了膜分离技术.膜分离技术的迅猛发展是在上世纪60～80年代，由于膜分离技术的应用与发展，使传统的分离过程受到挑战，引起了分离技术的重大变革.膜分离技术是一种借助外界能量或化学位的推动，以选择性透过膜为分离介质，对两组分或多组分气体或液体进行分离、分级和富集.与传统分离方法(蒸发、萃取或离子交换等)相比，它是在常温下操作，没有相变，最适宜对热敏性物质和生物活性物质的分离与浓缩；具有高效、节能、工艺过程简单、投资少、污染小等优点，因而在化工、轻工、电子、医药、纺织、生物工程、环境治理、冶金等方面具有广泛的应用前景[1].1 膜及膜分离技术1.1 膜的分类工业上膜分离大致分为微滤、超滤、纳滤和反渗透等，不同的分离类型其作用机理是各不相同.微滤：膜孔径大约0.1μm；主要从气相和液相物质中截留微米及亚微米的细小悬浮物、微生物、微粒、细菌、酵母、红血球、污染物等，以达到净化和浓缩的目.在静压差的作用下，小于膜孔的粒子透过膜，大于膜孔的粒子则被截留在膜的表面上，使大小不同的粒子得以分离.微滤分离的实质是利用膜的“筛分”作用来进行的.超滤：膜孔径在10～100nm，主要用于分离液相物质，如蛋白质、核酸聚合物、淀粉等大分子化合物、胶体分散液和乳液等.超滤过程的分离机理一般认为是压力驱动的筛孔分离过程，但膜表面的化学物质也是影响分离的一个重要因素.纳滤：膜孔径在1～10nm，是一种介于反渗透和超滤之间的压力驱动膜分离过程，主要用于二价或多价离子及分子量介于200～500之间的有机物的脱除.与超滤膜相比，纳滤膜有一定的荷电容量；与反渗膜相比，纳滤膜又不是完全无孔的，因此其分离机理在存在共性的同时，也存在差异.反渗透：膜孔径小于1nm，它仍是一种压力驱动的膜过程，与其他压力驱动的膜过程相比，反渗透是最精细的过程，因此又称“高滤”.它过滤的实质是利用反渗透膜具有选择性透过溶剂而截留离子物质的性质.分离的过程是依靠膜两侧的静压力差为推动力，用以克服溶剂的渗透压，使溶剂通过反渗透膜而实现对液体混合物的分离.它主要用于水的脱盐、软化、除菌等.它的分离机理与其它压力驱动膜过程有所不同，分离过程除与孔的大小有关外，还取决于透过组分在膜中的溶解、吸附和扩散，因此与膜的化学、物理性质以及透过组分与膜之间的相互作用有很大关系.四个过程的主要区别在于被分离物粒子或分子的大小和所采用膜的结构与性能.微滤膜的压差范围约为0.015～0.2MPa；超滤膜压差范围约为0.1～0.5MPa；反渗透的压差与溶液中溶质的相对分子质量及浓度有关，通常的压差在2MPa左右，也有高达10MPa的；介于反渗透与超滤之间的为纳滤过程，膜的脱盐率及操作压力通常比反渗透低.1.2 膜分离技术膜分离是以对组分具有选择性透过功能的膜为分离介质，通过在膜两侧施加（或存在）一种或多种推动力，使原料中的某组分选择性地优先透过膜，从而达到混合物的分离，并实现产物的提取、浓缩、纯化等目的的一种新型分离过程.其推动力可以为压力差、浓度差、电位差、温度差等.膜分离过程有多种，不同的过程所采用的膜及施加的推动力不同，通常称进料液流侧为膜上游、透过液流侧为膜下游.膜分离技术是一种新型高效、精密分离技术，它是材料科学与介质分离技术的交叉结合，具有高效分离、设备简单、节能、常温操作、无污染等优点，广泛应用于工业领域，尤其在化工、食品、医药、生化领域发展迅猛[2].膜分离技术具有如下特点：(1)膜分离过程不发生相变化，因此膜分离技术是一种节能技术；(2)膜分离过程是在压力驱动下，在常温下进行分离，特别适合于对热敏感物质，如酶、果汁、某些药品的分离、浓缩、精制等.(3)膜分离技术适用分离的范围极广，从微粒级到微生物菌体，甚至离子级都有其用武之地，关键在于选择不同的膜类型；(4)膜分离技术以压力差作为驱动力，因此采用装置简单，操作方便.2 超滤膜分离实验2.1 实验仪器膜分离实验装置，电子天平，紫外可见分光光度计.2.2 实验原理2.2.1 膜性能表征2.2.3 实验内容（1）用电子天平称量牛血清蛋白（生化试剂），加蒸馏水使其溶于烧杯中，分别配制浓度为0.200g/l、0.100g/l、0.067g/l、0.050g/l的溶液，取样为样液1、样液2、样液3、样液4.（2）将配好的的牛血清蛋白溶液（浓度为0.05g/l）倒入料液灌中，打开泵进口阀、超滤进口阀和超滤出口阀，关闭微滤出口阀和微滤进口阀，打开电源、泵、仪表开关.（3）控制泵的回流阀，控制压力表的压力（不超过0.15MPa），调节清液和浓液流量计，待稳定好后取少许清液和浓液分别为样液5和样液6.（4）实验完毕后关闭电源，打开排水阀.然后用水清洗管路，若较长时间不用时，为了防止系统生菌，应加入少量防腐剂，例如甲醛、双氧水等（浓度均不高于0.5％）.在下次使用前，则必须将这些保护液冲洗干净，才能进行实验.（5）将样液用紫外分光光度计在波长为280nm处进行检测（以蒸馏水为基准）得到以下图谱（见图2）；根据lambert-beer定律A=abc.A为吸光度，a为吸收系数(l·g-1·cm-1)，b为液层厚度(cm)，c为吸光度物质的浓度（g/l）.对于同一种物质ab都是定值，则A与c呈线性方程，由样液1、样液2、样液 3、样液4的数据可得到下图（见图3）.通过线性方程可以得出样液5和样液6的浓度，从图谱结果可以得出超滤能对牛血清蛋白浓缩，这可用于某些药物的纯化与分离.目前膜分离技术在许多方面得到广泛应用，而且在某些方面应用得还比较成熟.在对产品质量要求不断提高、生产成本要求不断降低的今天，膜技术的优势越来越明显，其必将取代传统的低效分离技术.但我们也应该清醒的认识到，膜分离技术的大量应用毕竟是近几十年开始的，许多方面还不成熟，还有待进一步深入的研究.首先，选择性问题应集中于膜材的研究，继续开发功能高分子膜材料和无机膜材料.对仿生膜、高效电解质膜、分子识别型膜的研究需要达到智能化、高效化和专一化目标.其次，膜通量的稳定性和产值比问题应集中于渗透时的防污染和膜过程强化的研究上.无论采用那种类型的膜，都存在膜孔被堵塞、膜表面形成黏性附层等膜污染问题，这极大的影响了通量的稳定性和产值比.因此应研究一种适用面广的强化膜过程分离技术，以减少膜污染、增大过滤通量、延长膜寿命.这需要将许多因素结合起来综合考虑，如选择合适的膜材，合理的膜组件设计、具有针对性的清洗和防污染方法、以及周密的工艺流程设计等方面.随着新型膜材料的不断开发、高效强化膜过程分离技术研究的不断深入，膜分离技术必定会有更加广泛的应用前景[3].参考文献：〔1〕王志斌，杨宗伟，邢晓林，高朝祥.膜分离技术应用的研究进展[J].过滤与分离，2008，（2）:19-23.〔2〕罗丽萍，高荫榆，扬柏云.膜分离技术在食品工业上的应用[J].江西科学，2004，2(2)：146—150．〔3〕王驰，魏东洋.膜处理技术在饮用水处理的应用研究.医药卫生，2005，34(3)：210.。
离心超滤法去除血清大相对分子质量高丰度蛋白质的实验研究
超 滤 膜 离 心去 除血 清 中大相 对 分 子 质 量 高丰 度 蛋 白质 后 保 留低 丰 度 蛋 白质 的 重 复 性 。 结 果 以 选择 ＭＷＣ 为 ５ ×１ 和 ３ × Ｏ Ｏ ０ ０
ｌｓ较 为适 宜 。 电 泳 分 离 结 果 显 示 ， 离心 超 滤后 滤过 液 中 大相 对 分 子 质 量 高丰 度 蛋 白质 ， 别 是 清 蛋 白 得 到 有 效 去 除 。 ＨＰ Ｃ Ｏ 经 特 Ｌ 检 测 结果 显 示 ， 用 ＭＷＣ 为 ５ ×１ 。 滤 膜 分 离后 ， 清 低 丰 度 蛋 白质 数 量 保 留适 中 。 重复 性 统 计 结 果显 示 ， 相 对 分 子 质 量 选 Ｏ Ｏ ０超 血 小 低 丰 度 蛋 白质 相 对 保 留 时 间 和相 对峰 面 积 ＲＳ 值 分 别 小 于 ０ ４ 和 ５ ５ 。结 论 离心 超 滤 法去 除血 清 中 大相 对分 子 质 量 高 Ｄ ．６ ．６ 丰 度 蛋 白 质 步 骤较 为 简 便 、 复性 好 ， 进 一 步 深 入 研 究血 清蛋 白质 组 学 奠 定 了基 础 。 重 为 关 键 词 ： 白质 组 学 ； 离心 超 滤 法 ； 高 丰 度蛋 白质 ； 低 丰 度 蛋 白 质 蛋
１ ×１ 。超 滤 膜 离心 管 中 ， Ｏ Ｏ 离心 １ ｎ ８０ ０ ５ ｍｉ （ ０ ×ｇ 。滤 液 真 空冷 冻 干 燥 后 ， 超 纯 水 按 浓 缩 １ ） 以 Ｏ倍 复 溶 。 分 别 应 用 Ｔ ｉ ｎ — Ｄ － ｒ ｉｅＳ Ｓ ｃ
超滤技术分离中药有效成分的实验研究
图９超滤后黄柏提取物ＨＰＬＣ图 （膜孔径：Ｏ．０５ｍ１）
（膜孔径：Ｏ．０５ｍ）
小结：①在实验中，我们选用三种中药提取物 筛选了孔径为０．Ｉｔｅｍ、０．０５舯１、０．０１ｐｌ和０．００Ｓｋｉｎ 的超滤膜（截留分子量分别为２０万、１０万、２万 和ｌ万），单纯以膜的截留分子量为分析依据，中 药有效成分（分子量～般都在１０００左右）应该都 能通过四种孔径的超滤膜，但从图１～３分析，以 药液的膜通量、有效成分转移率和千膏降低率为考 察指标，三种提取物对超滤膜孔径的大小有不同的 要求；②比较三种提取物超滤前和超滤后的色谱图 ４～９，可以看出超滤前后的图谱比较一致，说明使 用超滤技术滤过并没有改变药液中所含的化学成 分；③根据图ｌ一３和三种提取物超滤前和超滤后
在实验中我们选用三种中药提取物筛选了孔径为011m0105m0101m和01005m的超滤膜截留分子量分别为20万10万2万和1万单纯以膜的截留分子量为分析依据中药有效成分分子量一般都在1000左右应该都能通过四种孔径的超滤膜但从图13分析以药液的膜通量有效成分转移率和干膏降低率为考察指标三种提取物对超滤膜孔径的大小有不同的要求
的色谱图４～９，综合考虑三种指标，苦玄参提取 物使用孔径为０．０１／ｔｍ可以取得良好的效果，而黄 芩和黄柏的提取物中含有大量的粘液质，使用小孔 径的超滤膜时，膜通量非常的小，所以使用孔径为 ｏ．０５／ｚｍ的超滤膜比较合适。因此，在进行超滤时， 要根据提取物中所含成分选用适宜的超滤膜。 ２．药液浓度对膜分离的影响在膜孔径、操 作压力、药液温度等工艺参数一定的情况下，使不 同浓度的样品通过膜，测定滤液中有效成分的转移 率、干膏降低率和药液的膜通量，并比较超滤前后 药液中成分的变化。结果见图ｌｏ—１８。
４０ ２０
在不影响生产周期的情况下，可降低药液的浓度， 减少次级膜的形成，提高有效成分转移率和膜通量。 ３．药液温度对膜分离的影响在膜孔径、操 作压力、药液浓度等工艺参数一定的情况下，使不 同温度的样品通过膜，测定药液有效成分的转移 率、干膏降低率和药液的膜通量，并比较超滤前后 药液中成分的变化。结果见图１９—２７。 小结：①由于药液的温度不断升高，药液中分 子运动加剧，各成分之间的吸附、包合、氢键等多 种作用力减弱，所以有效成分的转移率也相应地增 高。同时升高药液的温度，可以降低药液的粘度， 减少了次级膜的形成，增加膜的通透性。正如图
超滤离心法降低重组人脱细胞真皮基质牛血清白蛋白残留量检测中基质效应的实验研究
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Ｃｈｍｅ∞Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＲｅｐａｒａｔｉｖｅ ａｎｄ ＲｅｃｏｎｓｍＪｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００８。Ｖ０１．２２，Ｎｏ．９
ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＰＲ２
ｍｅｔ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｅｍａｎｄ．Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａ ｖａｌｕｅ ａｎｄ ｓａｍｐｌｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｒｈＡＤＭ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａ．ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ． ｔｈａｔ
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｈｕｍａｎ ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｒｍａｌ ｍａｔｒｉｘ
Ｕｌｔｒａ．
Ｍａｔｒｉｘ ｅｆｆｅｃｔｓ
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｉｔｅｍ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆＣｈｉｎａ（３０６７０５７３）
重组人脱细胞真皮基质（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ａｓ
Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｒｈＡＤＭ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ：ｒｈＡＤＭ ｗｅｒｅ ｒｉｎｓｅｄ．ａｎｄ ｔｈｅｎ ｒｈＡＤＭ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ａｓ
ｓａｌｉｎｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ
ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ．Ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｌｔｒａ．ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：ｍａｒｋｅｄ ｔｈｅ ｕｌｔｒａ－ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｔｕｂｅｓ
超滤质谱法研究大黄蒽醌类化合物与人血清白蛋白的相互作用_王献
第32卷第2期中南民族大学学报（自然科学版）Vol．32No．22013年6月Journal of South-Central University for Nationalities （Nat．Sci．Edition ）Jun．2013收稿日期2012-12-17作者简介王献（1978-），女，副教授，研究方向：质谱分析，E-mail ：xwang@mail．secuec．edu．cn 基金项目国家自然科学基金资助项目（21275167）；中南民族大学中央专项重点资助项目（CZZ12003）超滤质谱法研究大黄蒽醌类化合物与人血清白蛋白的相互作用王献，喻花（中南民族大学化学与材料科学学院，武汉430074）摘要为研究药物小分子与靶蛋白的相互作用，建立了超滤技术和液相色谱电喷雾质谱联用方法（LC-ESI-MS ），并用该法筛选了与人血清白蛋白（HSA ）的作用的大黄蒽醌类物质（大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素）．通过比较大黄蒽醌类药物混合溶液与HSA 结合前后的提取离子流图色谱峰，发现大黄酸与HSA 结合能力最强，芦荟大黄素次之，大黄酚最弱．说明超滤质谱法是研究药物小分子和蛋白质相互作用的一种快速灵敏的分析方法．关键词超滤质谱；人血清白蛋白；大黄蒽醌类化合物；蛋白质-配体复合物中图分类号TQ028；O657．63文献标识码A文章编号1672-4321（2013）02-0029-03Study on the Interactions between HSA and ＲhubarbAnthraquinone Analogues by Ultrafiltration Mass SpectrometryWang Xian ，Yu Hua（College of Chemistry and Materials Science ，South-Central University for Nationalities ，Wuhan 430074，China ）AbstractTo study the interactions between small drug molecules and the target protein ，an ultrafiltration technologycoupled with liquid chromatography-ESI-mass spectrometry （LC-ESI-MS ）method was established and applied to screen the rhubarb anthraquinone analogues （chrysophanol ，rhein and aloe-emodin ）that interacted with human serum albumin （HSA ）．Comparing the extracted ion chromatography （EIC ）of these drugs before and after the incubation with HSA ，the sesults indicated that the binding affinity capacity of rhein was the strongest ，followed by aloe-emodin ，and chrysophanol was the weakest．This work demonstrated that ultrafiltration mass spectrometry is a fast and sensitive analytical method for the study of interactions of protein-ligand complexes．Keywordsultrafiltration mass spectrometry ；human serum albumin （HSA ）；rhubarb anthraquinone analogues ；protein-ligand complexes在药物小分子与蛋白质相互作用的研究中，质谱法受到了广泛地应用．超滤质谱技术是一种新的分析方法，它结合了超滤装置的分离功能和质谱技术的分析优势，能够迅速有效地检测和鉴别出与受体蛋白质相结合的配体小分子．故超滤质谱技术可应用于先导化合物的筛选［1，2］，组合文库的筛选［3，4］，天然产物有效成分的筛选［5，11］．此外，超滤质谱技术具有分析速度快、特异性强、高通量的特点，且样品用量少、图谱信息量大，因此在药物小分子和生物大分子相互作用的研究方面具有巨大的优势．大黄（Ｒadix et Ｒhizoma Ｒhei ）为蓼科植物掌叶大黄Ｒheum Palmatum L．唐古特大黄Ｒheum tanguticum Maxim．ex Balf 或药用大黄Ｒheum officinale Baill 的干燥根和根茎，味苦、性寒．临床研究证明，大黄具有抗衰老、降血脂、抗肿瘤、泻下作用及抗菌、消炎、止血等多种生理活性［12］．大黄的主要有效成分为蒽醌类衍生物：大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素及它们与葡萄糖结合成的苷类［13］．本文采用超滤质谱法研究了人血清白蛋白（HSA）与3种蒽醌类化合物（大黄酚、大黄酸和芦荟大黄素）的相互作用，通过提取离子色谱峰比较了这几种药物与HSA的相对结合能力，在此基础上建立并优化了一套超滤质谱法，可应用于研究和筛选与生物靶分子结合的药物．1实验部分1．1仪器与试剂高效液相色谱仪（Agilent1200，美国安捷伦科技有限公司），四极杆飞行时间质谱仪（Agilent6520 Q-TOF MS，美国安捷伦科技有限公司），高速冷冻离心机（GL-20M，上海卢湘仪离心机仪器有限公司），超滤膜YM-10（美国Millipore公司，理论截取分子量10kDa），超纯水机（Molelement1815a摩尔元素型，上海摩勒科学仪器有限公司）．人血清白蛋白（HSA，美国Sigma），大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素纯度均≥98%（上海拉丁试剂），甲醇、乙腈均为色谱纯（德国Merck公司），其他试剂均为优级纯．1．2样品制备将HSA溶解于超纯水中，配制成100μM的蛋白质母液，离心，于4ħ下冷藏保存．分别准确取一定质量的大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素3种化合物，用甲醇溶解，配置成100μM的蒽醌类化合物混合溶液母液，离心，于4ħ下冷藏保存．超滤实验前，用超纯水5倍稀释蛋白和药品溶液母液得到20μM 工作液．1．3仪器条件1．3．1色谱条件C18色谱柱（150mmˑ4．6mmˑ5μm），柱温40ħ，流速0．2mL/min．液相色谱梯度洗脱条件：流动相A为超纯水，B为乙腈；t=0min，99%A（1% B）；t=0 6min，30%A（70%B）；t=6 15min，1%A（99%B）；t=15 25min，1%A（99%B）；t= 25 30min，99%A（1%B），进样量为5μL．1．3．2质谱条件电喷雾离子源（ESI），负离子模式检测，离子扫描范围50 600m/z，干燥气温度350ħ，干燥气流速12L/min，雾化器压力40psig，毛细管电压4000V，碎裂电压125V．1．4超滤实验吸取20μL三种化合物的混合工作液，20μL （20μM）HSA和160μL超纯水混合均匀，室温反应2h，置于YM-10超滤管中，10000r/min离心15 min，用200μL超纯水离心清洗滤膜，重复3次，将未结合的配体小分子充分清洗干净．再向滤膜中加入水/甲醇（50︰50，v/v），静置30min，10000 r/min离心15min，将药物小分子从HSA上解离下来，用200μL水/甲醇（50︰50，v/v）离心清洗滤膜，重复3次，收集洗脱液于进样瓶中，用LC-MS检测．实验以不加入蛋白质的空白实验为对照组，结合组和对照组均平行实验3次以上．2结果与讨论2．1标准品混合溶液色谱质谱联用（LC-ESI-MS）测试条件优化首先建立标准品混合物LC-ESI-MS分析测试方法．将大黄酸、芦荟大黄素和大黄酚3种物质配成最终浓度为2μM的混合溶液，它们的摩尔浓度比为1︰1︰2，优化LC-ESI-MS条件对标准品混合溶液进行分离测试，结果见图1．t/min1）大黄酸；2）芦荟大黄素；3）大黄酚图13种大黄蒽醌类化合物混合样LC-MS提取离子流图Fig．1Extracted Ion Chromatography（EIC）of3mixtureof rhubarb anthraquinone analogues由图1可见，通过优化测试的色谱、质谱条件，混合样品溶液在C18柱中得到了有效分离，峰形较为对称，17min内可完成对这3种组分的分离．3种大黄蒽醌类化合物分子式、理论同位素分子量M及形成去质子分子离子［（M-H）－］离子质量见表1．表13种大黄蒽醌类物质分子式、精确分子量和形成负离子的质量Tab．1Molecular formulas and precise molecular weights of3rhubarb anthraquinone analogues and of their negative ions化合物分子式（M-H）－M大黄酸C15H8O6283．0248284．0321芦荟大黄素C15H10O5269．0455270．0528大黄酚C15H10O4253．0506254．057903中南民族大学学报（自然科学版）第32卷EIC 图中3组峰分别所对应的ESI-MS 质谱图见图2．对比表1可知，图2（a ）中m /z 为283．0287，269．0491，253．0534的分别是大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚的［（M-H ）－］峰，故根据质谱图可以确定图1中3种物质1、2、3分别为大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚．m /z图2提取离子流图（EIC ）中各峰对应的ESI-MS 质谱图Fig．2The corresponding ESI-MS spectra of 3peaks in EIC2．2大黄蒽醌类化合物和人血清白蛋白的竞争性结合实验超滤实验完成后，收集解离下来的大黄蒽醌类化合物混合溶液进LC-MS 检测，检测条件参照标准品测试条件．对所得的总离子流图（TIC ）进行3种大黄蒽醌类化合物的精确分子量的提取离子分析，结果见图3．如图3所示，结合组的3个提取离子流图（EIC ）色谱峰（即加入蛋白组，实线所示）均在不同程度上高于对照组（即未加蛋白质组，虚线所示）对应的EIC 色谱峰．相同的色谱、质谱条件下，EIC 色谱峰的积分面积与溶液中该物质的浓度成正比，通过实验组和空白组的EIC 色谱峰锋面积差异可知3种大黄蒽醌类化合物和HSA 均有不同程度的结合，其中大黄酸的结合能力较强，其次是芦荟大黄素，大黄酚的结合能力最弱．图3中3组峰分别对应的ESI-MS 质谱图（图略）与标准溶液图2一致，分别对应保留时间为8．942，12．636，16．565min 的质谱图．由Q-TOF MS 给出的精确分子量信息可知，m /z 为283．0287的是大黄酸的［（M-H ）－］峰，m /z 为269．0491的是芦荟大黄素的［（M-H ）－］峰，m /z 为253．0534的是大黄酚的［（M-H ）－］峰．根据质谱图可以确定图3中3种物质按照洗脱时间顺序依次为大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚，与上述标准品的色谱峰保留时间一致．t /min图3大黄蒽醌类物质与HSA 相互作用后的超滤质谱提取离子流图（EIC ）Fig．3EIC of the rhubarb anthraquinone analogues binding withHSA by ultrafiltration mass spectrometry3结语本文通过构建超滤质谱法研究大黄蒽醌类化合物和人血清白蛋白的相互作用，实验结果表明大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚3种药物均可与HSA 结合，相对结合强度为大黄酸﹥芦荟大黄素﹥大黄酚，验证了超滤质谱法是一种研究配体和蛋白质的相互作用快速灵敏有效的分析方法．超滤实验中同时考虑配体和蛋白质的浓度、孵育时间、解离溶剂的选择、超滤膜的选择等，获得了准确可靠的实验数据．该超滤质谱方法可广泛应用于对与各类生物靶分子相互作用的天然产物和药物的筛选工作．参考文献［1］Chen C J ，Chen S ，Woodbury C P ，et al．Pulsed ultrafiltrationcharacterization of binding ［J ］．Anal Biochem ，1998，261（1）：164-182．［2］Johnson B M ，Nikolic D ，Breemen ＲB．Applications of pulsed ultrafiltration-mass spectrometry ［J ］．Mass Spectrom Ｒev．2002，21（2）：76-86．［3］Zhao Y Z ，Breemen ＲB ，Nikolic D ，et al．Screeningsolution-phasecombinatoriallibrariesusingpulsedultrafiltration /electrospray mass spectrometry ［J ］．J Med Chem ，1997，40（25）：4006-4012．(下转第45页)13第2期王献，等：超滤质谱法研究大黄蒽醌类化合物与人血清白蛋白的相互作用2003，33（Sup2）：23-30．［4］余祖华，王红宁．利用巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展［J］．生物技术通讯，2004，15（6）：614-616．［5］Trant J M．Functional expression of recombinant spiny dogfish shark（Squalus acanthias）cytochrome P450c17（17alpha-hydroxylase/C17，20-lyase）in yeast（Pichiapastoris）［J］．Arch Biochem Biophys，1996，326（1）：8-14．［6］Boyle S M，Popp M P，Smith W C，et al．Expression of CYP2L1in the yeast Pichia pastoris，and determination ofcatalytic activity with progesterone and testosterone［J］．Mar EnvironＲes，1998，46（1/5）：25-28．［7］Andersen M D，Busk P K，Svendsen I，M ller B L．Cytochromes P-450from cassava（Manihot esculentaCrantz）catalyzing the first steps in the biosynthesis ofthe cyanogenic glucosides linamarin and lotaustralin．Cloning，functional expression in Pichia pastoris，andsubstrate specificity of the isolated recombinant enzymes［J］．J Biol Chem，2000，275（3）：1966-1975．［8］Matsuzaki F，Wariishi H．Molecular characterization of cytochrome P450catalyzing hydroxylation of benzoatesfrom the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium［J］．Biochem BiophysＲes Commun，2005，334（4）：1184-1190．［9］Dietrich M，Grundmann L，Kurr K，et al．Ｒecombinant production of human microsomal cytochrome P4502D6inthe methylotrophic yeast Pichia pastoris［J］．Chem BioChem，2005，6（11）：2014-2022．［10］Kolar N W，Swart A C，Mason J I，et al．Functional expression and characterisation of human cytochromeP45017αin Pichia pastoris［J］．J Biotech，2007，129（4）：635-644．［11］陈惠，赵海霞，王红宁，等．植酸酶基因中稀有密码子的改造提高其在毕赤酵母中的表达量［J］．中国生物化学与分子生物学报，2005，21（2）：171-175．［12］Sreekrishna K，BrankampＲG，Kropp K E，et al．Strategies for optimal synthesis and secretion ofheterologous protein in the methylotrophics yeast PiehiaPastoris［J］．Gene，1997，190（1）：55-62．［13］方曙光，储炬，张嗣良，等．温度对巴斯德毕赤酵母表达瑞替普酶（reteplase）的影响［J］．工业微生物，2007，37（4）：11-15．［14］黄晶．ＲGD-拖丝蛋白基因的构建及其在毕赤醉母中的分泌表达［D］．福州：福建师范大学，2008：櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀1-73．(上接第31页)［4］BreemenＲB，Huang CＲ，Nikolic D，et al．Pulsed ultrafiltration mass spectrometry：A new method forscreening combinatorial libraries［J］．Anal Chem，1997，69（11）：2159-2164．［5］Liu J H，Burdette J E，Xu H Y，et al．Evaluation of estrogenic activity of plant extracts for the potentialtreatment of menopausal symptoms［J］．J Agric 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P，et al．Characterization of compounds and potential neuraminidase inhibitors fromthe n-butanol extract of Compound IndigowoadＲootGranule using ultrafiltration and liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］．J Pharm Biomed Anal，2012，59：96-101．［12］WHO．Monographs on selects medicinal plant［M］．Geneva：World Health Organization，1999：231．［13］Kuo C H，Sun S W．Analysis of nine rhubarb anthraquinones and bianthrones by micellarelectrokinetic chromatography using experimentaldesign［J］．Anal Chim Acta，2003，482（1）：47-58．54第2期吴云华，等：重组人细胞色素P4502C9在毕赤酵母中的胞内表达。
超滤离心法测定银杏内酯B纳米结构脂质载体包封率
超滤离心法测定银杏内酯B纳米结构脂质载体包封率周恺;姚亮;戴浩志;林彤远;朱婷婷;邢蓉;陈卫东【摘要】目的建立超滤离心法测定银杏内酯B（ginkgolide B,GB）纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carrier,NLC）包封率的方法,以便对GB-NLC处方进行优化。
方法利用乳化蒸发-低温固化法制备GBNLC,在电镜下观察其微观形态,用纳米激光粒度仪测定其粒径和Zeta电位。
建立超滤离心测定包封率方法,分离载药NLC与游离GB,采用LC-MS/MS测定包载GB或游离GB含量,并计算包封率。
结果制得GB-NLC外观圆整,平均粒径和电位分别为（173.10±5.84）nm和（-27.47±0.40）mV;超滤离心法测得包封率为（61.97±1.03）%。
结论超滤离心法准确、快捷,适合作为GB-NLC包封率的测定方法。
【期刊名称】《安徽中医药大学学报》【年(卷),期】2015(034)002【总页数】4页(P78-81)【关键词】银杏内酯B;纳米结构脂质载体;包封率;超滤离心法【作者】周恺;姚亮;戴浩志;林彤远;朱婷婷;邢蓉;陈卫东【作者单位】【正文语种】中文【中图分类】R944银杏内酯B(ginkgolide B，GB)是从银杏叶中提取的三萜内酯类化合物，对心脑血管疾病具有显著的药理活性[1-2]，是极具应用前景的天然血小板活化因子受体拮抗剂[3]。
然而GB在水中溶解度低、半衰期短等缺点限制了其临床应用[4]。
纳米结构脂质载体(nanostructured lipid carriers，NLC)是第二代脂质纳米粒，特点为采用液体脂质以及固体脂质作为混合脂质核心包载药物，可实现缓释效果，延长药物半衰期[5-7]。
评价NLC质量的重要指标之一就是包封率。
1.1 仪器Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司；AB SCIEX 4500三重四级杆质谱：上海爱博才思仪器贸易有限公司；SU8020扫描电镜：日本日丽公司；3000HS型Zetasizer纳米激光粒度仪：美国Malvern公司；AB-135型分析天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；Milli-Q Reference超纯水系统：密理博(上海)贸易有限公司；LC-4016低速离心机：中科中佳科学仪器有限公司；XW-80A涡旋混合仪：上海沪西仪器有限公司；DF-101S集热式加热搅拌器：江苏省常州普天仪器制造有限公司；Amicon Ultra-4超滤离心管：密理博(上海)贸易有限公司。
不同方法消除脂血对生化检验结果干扰的效果对比 张红伟
不同方法消除脂血对生化检验结果干扰的效果对比张红伟摘要：目的：对比不同方法消除脂血，对生化检验结果的影响。
方法：对我院2017年10月~2018年10月，抽取的110份脂血样本进行分析，所有样本均通过高速离心方法、乙醚萃取方法、离子水稀释方法处理，以此消除血脂，分析3种不同方法消除脂血的效果。
结果：采用高速离心法、乙醚萃取法、离子水稀释法间的生化检验结果比较，统计学意义不存在，P>0.05。
上述方法和血浆原液生化检验结果对比，存在统计学的意义，P<0.05。
结论：不同方法消除脂血在生化检验方面应用均各有利弊，建议结合临床需求和具体情况进行选择。
关键词：不同方法；消除脂血；生化检验结果；干扰效果当前，我国国民经济水平不断提高，人们生活方式、生活习惯的改变，使得高脂血症的发生率持续提高。
如果没有在第一时间做好相应的处理工作，对于生化检验结果的可信度，会构成一定影响。
高脂血症，即为血脂水平过高所致的疾病，这一疾病主要包括：原发性、继发性。
原发性高脂血症的发生，和环境、酶/再植蛋白异常有关；继发性高脂血症的出现，与代谢性异常疾病（高血压、糖尿病、甲状腺低下等）、年龄、性别、不良生活习惯（吸烟、饮酒、精神紧张等），存在直接的联系[1]。
临床症状：脂质于内皮沉积所致黄色瘤、脂质于血管内皮沉积引发动脉硬化。
本文重点分析、比较采用高速离心、乙醚萃取、离子水稀释几种方法，对消除脂血生化检验结果的影响。
1.资料情况和方法1.1资料情况分析回顾性分析，我院2017年10月~2018年10月期间，共抽取110份脂血样本。
男性及女性分别为（n=59 vs n=51）；年龄区间为24~50岁，平均（47.2±2.3）岁；三酰甘油检测结果在3.2~29mmol/L，平均（16.1±0.7）mmol/L。
所有病例的临床相关数据，均列入统计学软件中，加以分析和处理。
1.2方法110例脂血标本，按照每分钟3000r的速度离心处理，时间为15min。
牛血清白蛋白为分离剂超滤拆分色氨酸的机理和模型(Ⅰ)
牛血清白蛋白为分离剂超滤拆分色氨酸的机理和模型(Ⅰ)陈扬;吕阳成;亓晅;骆广生【期刊名称】《化工学报》【年(卷),期】2007(58)1【摘要】以牛血清白蛋白(BSA)作为手性选择剂,利用膜超滤法拆分色氨酸(Trp)可以达到良好的手性分离效果.系统地研究了溶液pH值、温度、色氨酸和BSA的初始浓度、超滤压力等因素对分离效果的影响,指出除pH值外,温度对分离效果同样具有显著的影响.并依据pH值和温度对BSA空间结构和色氨酸带电性质的影响规律,定性分析了BSA拆分色氨酸对映体的机理.pH值主要通过影响BSA的空间构象和色氨酸的带电性质影响分离效果,温度则主要通过影响BSA的空间结构影响分离效果.【总页数】5页(P114-118)【作者】陈扬;吕阳成;亓晅;骆广生【作者单位】清华大学化学工程国家重点实验室,北京,100084;清华大学化学工程国家重点实验室,北京,100084;清华大学化学工程国家重点实验室,北京,100084;清华大学化学工程国家重点实验室,北京,100084【正文语种】中文【中图分类】TQ028.8【相关文献】1.色氨酸在自制人血清白蛋白手性柱上的拆分及手性识别机理研究 [J], 林艳萍;亢珊珊;姚碧霞;翁文2.色氨酸在自制牛血清白蛋白手性柱上的拆分 [J], 亢珊珊;黄洁云;邓翠瑶;叶丽虾;姚碧霞;翁文3.牛血清白蛋白为分离剂超滤拆分色氨酸的机理和模型(Ⅱ) [J], 亓晅;吕阳成;陈扬;骆广生4.萘乙二胺法测定色氨酸及应用于DL-色氨酸拆分过程 [J], 曹飞;于文涛;武红丽;孟涛;韦萍5.色氨酸抑制体外模型中晚期糖基化终末产物形成机理 [J], 刘炜妍;郑晓燕;杨旸;郑丽丽;艾斌凌;钟爽;校导;盛占武;张伟敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＢＳＡ
ｂｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｗｈｅｎ
ｕｌｔｒａ．ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｔｕｂｅ ｉｓ ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｅｄ ｂｙ ｓａｍｐｌｅ ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔ．
Ｒｅｓｉｄｕａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
ａｌｂｕｍｉｎ
ＰＲｌ（ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ
ｐｒｏｔｏｃｏｌ １），ＰＲ２（ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ２）ａｎｄ ｒｈＡＤＭ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｄｄｅｄ ２ ｍＬ ｏｆ １ ｍｇ／ｍＬ ａｎｄ １０ １．ｔｇ／ｍＬ ＢＳＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉＩｌｔｏ ＰＲ ｌ ａｎｄ ＰＲ２ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｃｅｎｔｆｉｆｕｇｅｄ
ａｎｄ
Ｒ２０
ｗａｓ（８．６４±０．２４），ｇ／ｍＬ ａｎｄ（８．１２±１．０１）峙，ｍＬ＇ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ １０¨ｇ／ｍＬ ＢＳＡ ｗａｓ ２６３．４％±
１６．９％ａｎｄ １０６．５％±３．０％ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｕｌｔｒａ—ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｔｕｂｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｓａｔｕｒａｅｄ ｂｙ ＰＲＩ ａｎｄ ＰＲ２（Ｐ＜０．０１），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ＇．Ｔｈｅ ＢＳＡ
１．２
管内管取出，置于未使用的１５ ｍＬ离心管中，标记号 码同Ｉ．２．３。在ＰＲｌ和ＰＲ２管中各加入１０．ｇ／ｍＬ ＢＳＡ 溶液４ ｍＬ，ｒｈＡＤＭ管中加入对应的ｒｈＡＤＭ浸提液
４
ｍＬ。同上法离心后，收集滤液作为待测标本备用。 观测指标 ＢＳＡ回收率测定①标本稀释：采用定量检测
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｈｕｍａｎ ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｒｍａｌ ｍａｔｒｉｘ
Ｕｌｔｒａ．
Ｍａｔｒｉｘ ｅｆｆｅｃｔｓ
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｉｔｅｍ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆＣｈｉｎａ（３０６７０５７３）
重组人脱细胞真皮基质（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ
Ｃｏｎｔｒｏｌｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，１０００５０，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ．Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＦＡＮＧ Ｙｕ，Ｅ—ｍａｉｌ：向ｎｇｙｕ＠
ｔｈｅ ｍａｔｒｉｘ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ
ＨＵＭＡＮ
ＡＣＥＬＬＵＬＡＲ ＤＥＲＭＡＬ ＭＡＴＲＩＸ
ＩＭＭＥＲＳｌＯＮ
ＯＮ
ＲＥＳｌＤＵＡＬ
ＢＯＶＩＮＥ ＳＥＲＵＭ ＡＬＢＵＭＩＮ
ＭＥＡＳＵＲＥＭＥＮＴ ＢＹ ＥＬｌＳＡ／ＦＡＮＧ ｈ，ＤＵ Ｘｉａｏｄａｎ，ＸＩ Ｔｉｎｇｆｅｉ，ＦＥＮＧ Ｘｉａｏｍｉｎ昏Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｆ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＮａｔｉｏｎａＩ
ａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｄｅｒｍａｌ ｍａｔｒｉｘ，
ｒｈＡＤＭ）样品浸提液对ＥＬＩＳＡ方法检测牛血清白蛋白（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ）残留量的基质效应。 洗ｒｈＡＤＭ后，制各ｒｈＡＤＭ生理盐水浸提液。取超滤离心管若干，分别加入ｌ
ｍｇ／ｍＬ
方法清
ＢＳＡ溶液（预饱和方式ｌ，记作
ＰＲＩ）、１０ ｐｇ／ｍＬ ＢＳＡ溶液（预饱和方式２，记作ＰＲ２）和ｒｈＡＤＭ浸提液２ ｍＬ（记作ｒｈＡＤＭｌ和ｒｈＡＤＭ２），ｌ ５００×ｇ离 心２０ ｍｉｎ，重复操作３次后取出离心管内管，放入未使用的１５ ｍＬ离心管中，在ＰＲＩ和ＰＲ２管中加入ｌＯ ｐｇ／ｍＬ ＢＳＡ溶液
ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｒｍａｌ
ｈｕｍａｎ
标记为ＰＲｌ，每支加入１
ｍｇ／ｍＬ
ＢＳＡ溶液２ ｍＬ（预饱
ｐｇ／ｍＬ ＢＳＡ
ｍａｔｒｉｘ，ｒｈＡＤＭ）由胶原与人源性成纤
和方式１）；３支标记为ＰＲ２，每支加入１０
维细胞所分泌的ＥＣＭ共同构建而成，可用于修复烧 伤、烫伤、创伤、慢性溃疡等因素造成的皮肤缺损［Ｉ－３１。 在组织工程医疗产品构建中，ＦＢＳ是大多数细胞培养 液以及产品保存液中的重要成分。当以牛血清白蛋白
ｔｈｅ
ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ（Ａ）ｖａｌｕｅ ｗａｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｅｘａｃｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｕｌｔｒａ．ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
Ｔｈｅ ＢＳＡ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＲＩ ａｎｄ Ｒ１０
ｗａｓ（２３．８０±１．５８），ｇ／ｍＬ ａｎｄ（９．０４±０．２４）岖，／ｍＬ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．１１１ｅ ＢＳＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＲ２
４
ｍＬ，ｒｈＡＤＭ管中加入ｒｈＡＤＭ浸提液４ ｍＬ，同上法离心后，收集滤液。用ＥＬＩＳＡ法测定ＢＳＡ含量。计算不同预饱和
方式下１０｝ｌｇ／ｍＬ ＢＳＡ溶液的ＢＳＡ回收率（以未经处理的１０ ｐｇ／ｍＬ ＢＳＡ溶液作为基础样品，分别记作Ｒ１０和Ｒ２０）；计算 滤液稀释倍数的对数与测定吸光度（一）值的相关系数，并与未经超滤离心处理的浸提液检测结果进行比较。 结果采 用预饱和方式ｌ处理后，ＰＲＩ ＢＳＡ浓度为（２３．８０ ４－１．５８），ｇ／ｍＬ，Ｒ１０为（９．０４ ４－０．２４）肛ｇ／ｍＬ，ＢＳＡ回收率为２６３．４％４－ １６．９％。采用预饱和方式２处理后，ＰＲ２ ＢＳＡ浓度为（８．６４ ４－０．２４）ｐｇ／ｍＬ，Ｒ２０为（８．１２ ４－１．０１）ｐｇ／ｍＬ，ＢＳＡ的回收率为 １０６．５％４－３．Ｏ％。预饱和方式２的回收率符合检测要求。不同预饱和方式下ＢＳＡ回收率差异有统计学意义（尸＜０．０１）。 经超滤离心处理后，滤液稀释倍数的对数与Ａ值之间的相关性明显提高，相关系数由－０．７２７提高至一０．９６０。超滤处理后 的相关系数符合检测要求。 结论超滤离心处理可以有效减少ｒｈＡＤＭ样品浸提液的基质效应对ＢＳＡ残留量检测的
ａｎ
ｃｏｅｆ！ｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓ ｒａｉｓｅｄ ｆｒｏｍ一０。７２７ ｔｏ一０．９６０ ａｆｔｅｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍａｔｒｉｘ ｅｆｆｅｃｔｓ
ｃａｎ ｃａｎ
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
Ｔｈｅ
ｂｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｙ ｕｌｔｒａ－ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ。ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ
ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｕｎｕｓｅｄ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ．Ａｄｄｅｄ ４ ｍＬ ｏｆ １０ ｐｇ／ｍＬ ＢＳＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ＰＲＩ ａｎｄ ＰＲ２ ｔｕｂｅｓ，４ ｍＬ ｏｆ ｒｈＡＤＭ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ
ｉｎ
ｒｈＡＤＭ ｔｕｂｅｓ，ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ
ａｔ
ｌ ５００。ｇ ｆｏｒ ２０ ｍｉｎｕｔｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ
ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｔｅｄ．Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＢＳＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ｔｈｅ
ＢＳＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｌｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ
ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ＢＳＡ ＥＬＩＳＡ
ห้องสมุดไป่ตู้
织工程医疗产品进入人体后，作为异种蛋白可能引起 免疫反应［４－５］。因此，组织工程医疗产品中ＢＳＡ残留 量的检测对其安全评估具有重要意义。 既往我们采用ＥＬＩＳＡ方法检测组织工程人工骨、 肌腱和人工角膜贴片中ＢＳＡ的残留量【６】，但采用相同 方法检测ｒｈＡＤＭ中ＢＳＡ残留量时发现样品浸提液稀 释倍数与测定吸光度（彳）值间相关性较差，且该现象 很难单纯用Ｈｏｏｋ效应进行合理解释，推测可能样品浸 提液对ＥＬＩＳＡ法测定ＢＳＡ残留量有较大的基质效应。 为此，我们设计对样品浸提液进行超滤离心处理，以减 少基质效应对检测的影响。 材料与方法 主要试剂与仪器 ｒｈＡＤＭ由陕西艾尔肤组织工程有限公司提供； ＢＳＡ由北京欣经科生物技术有限公司提供，采用生理 盐水配制成浓度为１ ｍｇ／ｍＬ、１０肛ｇ／ｍＬ溶液备用。超 滤离心管（Ｕｌｔｒａｃｅｌ ＰＬ．１＇００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司，美国）；定量 检测ＢＳＡ酶联免疫试剂盒（无锡博生医用生物技术开 发有限公司）：酶标仪（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ公司，美国）。
基金项目：国家自然科学摹金资助项目（３０６７０５７３） 作者单位：中国药品牛物制品检定所医疗器械质量监督检验中心（北京，１０００５０） 通讯作者：方玉，高级工程师，研究方向：医疗器械生物学评价，Ｅ－ｍａｉｌ：ｆａｎｇｙｕ＠ｎｉｃｐｂｐ．ｏｒｇ．ｃｎ
中国修复重建外科杂志２００８年９月第２２卷第９期
影响；样品浸提液自身对超滤离心管的预饱和处理，可得到较为理想的ＢＳＡ回收率。 【关键词】 牛血清白蛋白残留量
Ｒ４４６．６１
重组人脱细胞真皮基质 文献标志码：Ａ
超滤离心
基质效应
中图分类号：Ｒ３７３
ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＳＴＵＤＹ ＯＮ ＵＬ＿ＴＲＡ－ＦＩＬ．ＴＲＡＴＩＯＮ ＩＮ ＲＥＤＵＣＩＮＧ ＭＡＴＲＩＸ ＥＦＦＥＣＴＳ ＯＦ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴｌＯＮ
ｋｉｔ．Ｔｈｅ
ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆ
１０｝ｌｇ／ｍＬ ＢＳＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｌ ａｎｄ ２ ｗｅｒｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ １０峙．／ｍＬ ＢＳＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ａｓ ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｓａｍｐｌｅ，ｍａｒｋｅｄ ＲＩＯ ａｎｄ Ｒ２０ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）．Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｌｏｇａｒｉｔｈｍ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ
ｎｉｃｐ印．ｏｒｇ．ｃｎ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｏｆ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｌｔｒａ—ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ