蛋白组学

新疆大学研究生课程考试（查）论文

2015 ——2016 学年第 1 学期

《在神经母细胞瘤细胞中用蛋白质组学的方法研究miR-153 - 3p和miR-205-5p的效应》

课程名称：高级生物化学及研究技术

任课教师：杨洁

学院：生命科学与技术学院

专业：

学号：

姓名：马腾飞马洋洋王晨日

刘树虎秦亚楠

成绩：

在神经母细胞瘤细胞中用蛋白质组学的方法研究miR-153 -

3p和miR-205-5p的效应

摘要：小分子核糖核酸是多种疾病调节和控制的关键物质。在HEK293细胞中,miR -153 - 3 p

和miR - 205 - 5 p抑制α-突触核蛋白(SNCA)和富亮氨酸重复体内基因LRRK2激酶2(LRRK2),两个关键蛋白质参与帕金森病(PD)。我们使用双向电泳(2 d-page)耦合到质谱(MS)确定一个频谱miR - 153 - 3 p和miR- 205 - 5 p目标在神经SH-SY5Y细胞。我们过表达和抑制两种小分子核糖核酸SH-SY5Y细胞,通过比较蛋白质组学分析我们从每个分析量化~ 240的蛋白质斑点。结合,33个蛋白质斑点-确定了三个蛋白质斑点显示显著(p值< 0.05)的变化。调制mir - 153 - 3 - p导致7个上调蛋白质和8个下调蛋白质。miR - 205调制导致12个上调差异蛋白质和6个下调蛋白质。几个蛋白质与神经元的过程，包括peroxiredoxin-2和4、cofilin-1 prefoldin alpha-enolase,人类的核苷二磷酸激酶B(Nm23)和14-3-3蛋白ε。许多差异表达的蛋白，参与多种代谢途径包括神经营养因子信号，肌动蛋白细胞骨架调节，HIF-1信号和蛋白酶体说明mir-153-3p和mir-205-5p参与多种生物调节神经母细胞瘤细胞的过程。

前言：帕金森病（PD）是最常见的神经退行性运动障碍的疾病，特点是在黑质致密部[ 1 ]

多巴胺能神经元变性的表征。大多数PD病例是散发的但一般是基因在α-突触核蛋白病变（SNCA）[ 2 ] [ 3 ]，帕金，PINK1 [ 4 ] [ 5 ]，DJ-1和富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）[ 6 ]已在早期和迟发性帕金森病。尽管广泛的研究，导致帕金森病的发病和进展的分子途径知之甚少。小分子核糖核酸被用来解码不同的路径与一些疾病相关[7]。然而,microRNA在神经退化的研究是有限的。PD,miR -7 / mir - 153和mir - 205 - 5 - p可以抑制体内基因LRRK2 SNCA和,替换有效而DJ-1和帕金是由miR-34b / c(8、9、10)。间接监管的影响PD-associated蛋白质也有mir - 133 b,mir - 433,mir - 184*和let-7(11、12、13)。尽管数据有限microRNA与神经节点——相关监管途径一代[14],小分子核糖核酸与神经干细胞分化和猛击-,突触形成和突触可塑性(11、15)。

单个小分子核糖核酸可以调节几个mrna[16]。因此,比较蛋白质组学分析与改变细胞微rna 水平有可能揭示新的微目标蛋白质。本研究的目的是结合微rna和蛋白质组学技术iden -tify 新mir - 153 - 3 - p和mir - 205 - 5 - p在神经元SH-SY5Ycells目标。我们选择了双向电泳相对于LC-MS尽管LC-MS分析提供更加全面，双向电泳蛋白质丰度识别更微妙变化的可能性。几个蛋白质的目标确定的与神经元的过程和关键的监管途径，表明mir-153-3p和mir-205-5p参与多种生物学过程。

材料与方法

细胞培养与瞬时转染

SH-SY5Y细胞(神经母细胞瘤细胞)（crl-2266；ATCC）培养基介质的混合物（(Full medium: 1:1DMEM/Ham’s-F12) (Invitrogen)添加10% v/v胎牛血清（亚特兰大生物制品）2 mmglutamax （Invitrogen）5% CO2气氛中37°C.转染进行，一式三份，控制mir-153-3模板，mir-205-5p 模板，加扰控制发夹抑制剂，抑制剂和miR-205 mir-153-3p发夹发夹抑制剂，所有mirVanaTM （Life Technologies），在终浓度为20。细胞接种于6孔培养板在金刚石5x105个细胞/孔。2μLμRNA（20μm），以优化100μl稀MEM，7μl Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen公司）与

100μL Opti-MEM稀在室温下孵育5分钟（分钟）。两者的解决方案是混合的孵育15 min，转染混合稀释到2毫升Opti-MEM，在37°C下培养4 - 6小时前更换全介质。细胞后24小时取定量PCR（qRT-PCR）分析与Western 48小时后印迹和电泳分析。

分离RNA，RT-PCR和实时定量PCR

RNA的分离，一式三份，转染24小时后使用mircury RNA分离试剂盒（,丹麦Exiqon公司）用1 unit/μgRNA的DNaseI处理（Thermo Scientific赛默飞世尔）30分37°C之后，再用50mM EDTA在65°C处理10分钟。利用该基因合成qscripttm RNA的cDNA合成试剂盒（子公司）和用于半定量（25个周期）和实时荧光定量PCR。mir-153-3p正向引物（5’gccgggcttgcatagtcaca3’），mir-205-5p正向引物（5’gtttccttcat tccaccgg3’），U6前进引物（5’cgcttcggcagcacatatac 3”）和perfecta1universal PCR引物沿以绿色为perfecta1 sybr1 supermix IQTM进行qRT-PCR分为每个生物复制。

Western印迹法

使用缓冲液制备的全细胞裂解液（150mM NaCl，1% w/v NP40，50mmTris pH值8，0.5% w / v的脱氧胆酸钠，0.1% w/v SDS）转染后48小时，用Western印迹分析以下公布的实验报告[ 17 ]。所用的主要抗体如S1表。所用的二次抗体是山羊抗兔或山羊抗小鼠抗体(Jackson Immunoresearch)。报道的代表西方杂交结果是n= 3。

二维凝胶电泳

样品制备

用尿素溶解缓冲液制备的总蛋白裂解液（7M尿素，2M硫脲，4%（W/V）人和30mMTris，1x蛋白酶和磷酸酶抑制剂）和超声。离心后上清液浓缩物用amicon1ultra离心过滤器过滤（截留分子量10000）。使用Bradford法（Bio-Rad）测定蛋白浓度。

双向电泳

蛋白裂解液与补液缓冲液稀释（7 M尿素，2M硫脲，2%（w/v）皲裂，40mM DTT，0.5% IPG 缓冲液，pH值3–10 NL，0.4%溴酚蓝）并应用于Immobiline TM DryStrip 7 cm，pH值为3–10 NL（GE医疗）隔夜被动补液。等电聚焦在一个PROTEAN IEF 细胞进行的，根据制造商的推荐（Bio-Rad）。后复水，蛋白质减少DTT和随后的烷基化与平衡缓冲液碘乙酰胺（6M尿素，2.5% SDS，50mM Tris，pH 8.8，20%甘油）。第二维电泳12%在100V进行SDS-PAGE凝胶染色过夜。胶体考马斯蓝G-250 [ 18 ]。

图像的扫描与分析

使用爱普生扫描完整凝胶扫描V750 Pro软件（数字冰技术）在600 DPI / 16位灰度。ImageMaster 2D platinum 7（锗医疗）被用于现场检测，背景减法，匹配，并鉴定蛋白质斑点的差异（方差分析）变更控制。进行了三次实验。

凝胶消化

差异表达的蛋白点被切除，切成小件，放置在0.6毫升离心管。脱色凝胶块孵育200μL 100mM 碳酸氢铵：乙腈（50:50 v/v）颤抖。当充脱色，凝胶碎片脱水用100%乙腈100μ（ACN）洗两次，然后在真空离心干燥（速度VAC）5分钟，干燥后蛋白裂解成肽酶。对于这一点，胰蛋白酶溶液(2 μl of 0.02 μg/μl)添加到湿凝胶块，进行培养4小时，在室温加30μl 的