蛋白组学
新疆大学研究生课程考试（查）论文
2015 ——2016 学年第 1 学期
《在神经母细胞瘤细胞中用蛋白质组学的方法研究miR-153 - 3p和miR-205-5p的效应》
课程名称：高级生物化学及研究技术
任课教师：杨洁
学院：生命科学与技术学院
专业：
学号：
姓名：马腾飞马洋洋王晨日
刘树虎秦亚楠
成绩：
在神经母细胞瘤细胞中用蛋白质组学的方法研究miR-153 -
3p和miR-205-5p的效应
摘要：小分子核糖核酸是多种疾病调节和控制的关键物质。在HEK293细胞中,miR -153 - 3 p
和miR - 205 - 5 p抑制α-突触核蛋白(SNCA)和富亮氨酸重复体内基因LRRK2激酶2(LRRK2),两个关键蛋白质参与帕金森病(PD)。我们使用双向电泳(2 d-page)耦合到质谱(MS)确定一个频谱miR - 153 - 3 p和miR- 205 - 5 p目标在神经SH-SY5Y细胞。我们过表达和抑制两种小分子核糖核酸SH-SY5Y细胞,通过比较蛋白质组学分析我们从每个分析量化~ 240的蛋白质斑点。结合,33个蛋白质斑点-确定了三个蛋白质斑点显示显著(p值< 0.05)的变化。调制mir - 153 - 3 - p导致7个上调蛋白质和8个下调蛋白质。miR - 205调制导致12个上调差异蛋白质和6个下调蛋白质。几个蛋白质与神经元的过程，包括peroxiredoxin-2和4、cofilin-1 prefoldin alpha-enolase,人类的核苷二磷酸激酶B(Nm23)和14-3-3蛋白ε。许多差异表达的蛋白，参与多种代谢途径包括神经营养因子信号，肌动蛋白细胞骨架调节，HIF-1信号和蛋白酶体说明mir-153-3p和mir-205-5p参与多种生物调节神经母细胞瘤细胞的过程。
前言：帕金森病（PD）是最常见的神经退行性运动障碍的疾病，特点是在黑质致密部[ 1 ]
多巴胺能神经元变性的表征。大多数PD病例是散发的但一般是基因在α-突触核蛋白病变（SNCA）[ 2 ] [ 3 ]，帕金，PINK1 [ 4 ] [ 5 ]，DJ-1和富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）[ 6 ]已在早期和迟发性帕金森病。尽管广泛的研究，导致帕金森病的发病和进展的分子途径知之甚少。小分子核糖核酸被用来解码不同的路径与一些疾病相关[7]。然而,microRNA在神经退化的研究是有限的。PD,miR -7 / mir - 153和mir - 205 - 5 - p可以抑制体内基因LRRK2 SNCA和,替换有效而DJ-1和帕金是由miR-34b / c(8、9、10)。间接监管的影响PD-associated蛋白质也有mir - 133 b,mir - 433,mir - 184*和let-7(11、12、13)。尽管数据有限microRNA与神经节点——相关监管途径一代[14],小分子核糖核酸与神经干细胞分化和猛击-,突触形成和突触可塑性(11、15)。
单个小分子核糖核酸可以调节几个mrna[16]。因此,比较蛋白质组学分析与改变细胞微rna 水平有可能揭示新的微目标蛋白质。本研究的目的是结合微rna和蛋白质组学技术iden -tify 新mir - 153 - 3 - p和mir - 205 - 5 - p在神经元SH-SY5Ycells目标。我们选择了双向电泳相对于LC-MS尽管LC-MS分析提供更加全面，双向电泳蛋白质丰度识别更微妙变化的可能性。几个蛋白质的目标确定的与神经元的过程和关键的监管途径，表明mir-153-3p和mir-205-5p参与多种生物学过程。
材料与方法
细胞培养与瞬时转染
SH-SY5Y细胞(神经母细胞瘤细胞)（crl-2266；ATCC）培养基介质的混合物（(Full medium: 1:1DMEM/Ham’s-F12) (Invitrogen)添加10% v/v胎牛血清（亚特兰大生物制品）2 mmglutamax （Invitrogen）5% CO2气氛中37°C.转染进行，一式三份，控制mir-153-3模板，mir-205-5p 模板，加扰控制发夹抑制剂，抑制剂和miR-205 mir-153-3p发夹发夹抑制剂，所有mirVanaTM （Life Technologies），在终浓度为20。细胞接种于6孔培养板在金刚石5x105个细胞/孔。2μLμRNA（20μm），以优化100μl稀MEM，7μl Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen公司）与
100μL Opti-MEM稀在室温下孵育5分钟（分钟）。两者的解决方案是混合的孵育15 min，转染混合稀释到2毫升Opti-MEM，在37°C下培养4 - 6小时前更换全介质。细胞后24小时取定量PCR（qRT-PCR）分析与Western 48小时后印迹和电泳分析。
分离RNA，RT-PCR和实时定量PCR
RNA的分离，一式三份，转染24小时后使用mircury RNA分离试剂盒（,丹麦Exiqon公司）用1 unit/μgRNA的DNaseI处理（Thermo Scientific赛默飞世尔）30分37°C之后，再用50mM EDTA在65°C处理10分钟。利用该基因合成qscripttm RNA的cDNA合成试剂盒（子公司）和用于半定量（25个周期）和实时荧光定量PCR。mir-153-3p正向引物（5’gccgggcttgcatagtcaca3’），mir-205-5p正向引物（5’gtttccttcat tccaccgg3’），U6前进引物（5’cgcttcggcagcacatatac 3”）和perfecta1universal PCR引物沿以绿色为perfecta1 sybr1 supermix IQTM进行qRT-PCR分为每个生物复制。
Western印迹法
使用缓冲液制备的全细胞裂解液（150mM NaCl，1% w/v NP40，50mmTris pH值8，0.5% w / v的脱氧胆酸钠，0.1% w/v SDS）转染后48小时，用Western印迹分析以下公布的实验报告[ 17 ]。所用的主要抗体如S1表。所用的二次抗体是山羊抗兔或山羊抗小鼠抗体(Jackson Immunoresearch)。报道的代表西方杂交结果是n= 3。
二维凝胶电泳
样品制备
用尿素溶解缓冲液制备的总蛋白裂解液（7M尿素，2M硫脲，4%（W/V）人和30mMTris，1x蛋白酶和磷酸酶抑制剂）和超声。离心后上清液浓缩物用amicon1ultra离心过滤器过滤（截留分子量10000）。使用Bradford法（Bio-Rad）测定蛋白浓度。
双向电泳
蛋白裂解液与补液缓冲液稀释（7 M尿素，2M硫脲，2%（w/v）皲裂，40mM DTT，0.5% IPG 缓冲液，pH值3–10 NL，0.4%溴酚蓝）并应用于Immobiline TM DryStrip 7 cm，pH值为3–10 NL（GE医疗）隔夜被动补液。等电聚焦在一个PROTEAN IEF 细胞进行的，根据制造商的推荐（Bio-Rad）。后复水，蛋白质减少DTT和随后的烷基化与平衡缓冲液碘乙酰胺（6M尿素，2.5% SDS，50mM Tris，pH 8.8，20%甘油）。第二维电泳12%在100V进行SDS-PAGE凝胶染色过夜。胶体考马斯蓝G-250 [ 18 ]。
图像的扫描与分析
使用爱普生扫描完整凝胶扫描V750 Pro软件（数字冰技术）在600 DPI / 16位灰度。ImageMaster 2D platinum 7（锗医疗）被用于现场检测，背景减法，匹配，并鉴定蛋白质斑点的差异（方差分析）变更控制。进行了三次实验。
凝胶消化
差异表达的蛋白点被切除，切成小件，放置在0.6毫升离心管。脱色凝胶块孵育200μL 100mM 碳酸氢铵：乙腈（50:50 v/v）颤抖。当充脱色，凝胶碎片脱水用100%乙腈100μ（ACN）洗两次，然后在真空离心干燥（速度VAC）5分钟，干燥后蛋白裂解成肽酶。对于这一点，胰蛋白酶溶液(2 μl of 0.02 μg/μl)添加到湿凝胶块，进行培养4小时，在室温加30μl 的
50mM碳酸氢铵到凝胶片，并在室温下留过夜，后观察凝胶中的肽的扩散。被消化的蛋白质被储存在80摄氏度，直到更进一步分析。
肽质量指纹图谱
消化后，POROS 20 R2树脂（Applied Biosystems）添加到消化的凝胶样品用5%甲酸和0.2%氟酸振动筛4°C时提取4h。MALDI-MS分析之前，消化的肽进一步淡化用ZipTip C18（微孔）。ZipTips 依次用10μ0.1% TFA的两倍，70%乙腈/ 0.1% TFA的两倍，10μL 0.1% TFA的两倍。含样消化和珠的混合物被转移到eZipTips 和绑定到C18树脂。这个加载的提示进行10μL 0.1% TFA洗。消化的肽洗脱放10 mg/mL CHCA基质溶液中0.003%的TFA，13%乙醇2μL，和84%乙腈，该ZipTips顶部慢慢分配到MALDI板上。质谱分析
使用热电LTQ XL线性离子阱质谱仪进行（Thermo Scientific）配备真空MALDI源后，溶剂蒸发，在室温和CHCA基质结晶在MALDI板肽。数据采集使用Xcalibur软件进行，其中前40名最丰富前体离子扫描(mass range 700–3500 Da)被选出来和MS / MS采集被触发的CID碎片（碰撞诱导解离）。归一化碰撞能量为50%，隔离宽度为3 Da。原文件从LTQ质谱仪是利用吉祥物酒糟2.3.2分析(Matrix Science, Boston,MA)蛋白的鉴定。肽质量是匹配against the 分类智人在美国国家生物技术信息中心（ncbinr）的非冗余数据库。胰蛋白酶裂解肽是一个想每年允许与初始质量公差0.3大was used in all搜索。完全和部分氧化半胱氨酸巯基carboxyamidation—蛋氨酸的假设[ 19 ]。
细胞活力和活性氧的测量
细胞活力测定采用中性红吸收法48小时后转染。细胞PBS漂洗，中性红溶液100μL (40μg/ml) 添加到每个板孵育2小时。细胞用PBS洗，中性红提取使用150μl脱色液（50%乙醇，1%冰醋酸，49%去离子水）好的板进行摇动10 min吸光度在540nm处测定用一个时代的微孔板分光光度计（bioteck）。细胞内活性氧（ROS）的测定采用（DCF-DA）(Sigma-Aldrich)。细胞在固体黑色不透明板镀5x104细胞每48小时孵育后的100μDCF-DA L（25μm）45分钟，使用glomas1多检测系统测量荧光板阅读器（Promega）在485nm波长处（激励）和528nm（排放）。进行测定，一式三份。
图像分析、统计分析及相关分析
Western blot图像分析软件使用iqtl（GE医疗）。微软优于工具被用于双尾学生的t检验。标准误差被用来显示变化。对mir-153-3p和mir-205-5p目标作为Partek基因组输入查询
套装软件，版本6.6（Partek）进行基因本体论（GO）分析和生成交互式地图和路径。
结果与讨论
miR - 153 - 3p和miR - 205 - 5p在SH-SY5Y细胞超表达和抑制
mir - 153在HEK293细胞中过度表达下调SNCA mir - 205超表达在HEK293细胞已被证明体内基因LRRK2表达下调(8、9)。在这项研究中,我们选择了神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y作为神经元的特征代表了一个更好的平台解剖microRNA-regulated通路和机制与帕金森病有关。mir - 153 - 3 - p成功中使用mir - 153 - 3 - p模仿和抑制使用mir - 153 - 3 - p antago -米尔SH-SY5Y细胞(图1 a和1 b)。同样,mir - 205 - 5 - p成功过表达使用mir - 205 - 5 - p模仿和抑制使用mir - 205 - 5 - p antagomir(图1 a和1 b)。此外,我们使用qPCR验证下来由于antagomirs 小分子核糖核酸的监管(图1 c)。
改变水平的miR- 153 - 3p和miR - 205 - 5p导致蛋白质的变化与光谱相关的生物过程
我们下一个试图确定额外的目标mir - 153 - 3 - p和mir - 205 - 5 - p SH-SY5Y细胞使用2 d-page 分析。然而,在执行2 d-page分析之前我们显示thatmir - 153 - 3 - p和mir - 205 - 5 - p转染对SH-SY5Y细胞生存能力没有显著影响确保任何观察到蛋白质的变化是由于变化mir - 153 - 3 - p和mir - 2055 p水平(图1 d)。
我们执行比较2 d-page分析比较控制模拟和控制antagomir转染细胞与细胞转染miR - 153 - 3p模仿和miR -153 - 3p antagomir分别(图2),相同的比较分析SH-SY5Y细胞转染和miR - 205 - 5 - p模仿和miR - 205 - 5p antagomir(图3)。我们确定了33个蛋白质斑点显示显著的丰度变化(褶皱改变> 1.4,n = 3,p值< 0.05)控制转染和miR - 153 - 3p / miR - 205 - 5p -转染SH-SY5Y细胞。为了改变mir - 153 - 3 - p水平七个蛋白质斑点8个蛋白质点差异而被抑制(图2,表1),为了应对miR -205 - 5p扰动十二proteinspots——虽然6个蛋白质点表达是上调下来监管(图3,表1)。蛋白质斑点和碎片光谱女士受到searchedagainstthe NCBInr数据库(taxonomyHomosapiens)使用吉祥物蒸馏器暴露差异表达蛋白质的身份(S1无花果;表1 S2表)。
监管的关键神经过程mir - 153 - 3 - p和mir - 205 - 5 – p
超表达mir - 153 - 3 - p导致老年病的蛋白酶体亚基α1型同种型2(PSMA1)(表1,点4,S2图)。mir - 205 - 5 - p超表达也增加了大量的蛋白酶体亚基第42页(PSMC6)(表1,现货24;S2无花果)和蛋白酶体子任务单位α1型异构体2(PSMA1)(表1,点21)。有效的蛋白酶体活动是至关重要的神经元是不恰当的错误折叠蛋白质的降解,如淀粉和SNCA、结果聚合形成,广告的特征和PD(12、20)。mir - 153 - 3 - p过度也导致增加大量的Prefolding单元2(PFDN2)(表1,现货7),转让错误折叠蛋白质chaperonin确保适当的折叠[21]。这表明mir - 153 - 3 - p可能会上调PFDN2
反应增加错误折叠蛋白的水平作为神经保护机制。
我们还发现,组织蛋白酶Z(CTSZ)(表1,发现13)抑制在回应miR - 153 - 3p抑制。在衰老小鼠大脑组织蛋白酶是调节,损害neuronalsurvival neuritogenesis,表明miR - 153 - 3p可能调节组织蛋白酶水平主要锡箔健康的神经元数量[22]。
抑制mir - 153 - 3 - p也导致钙激活氯的老年病通道家族成员4(CLCA4)(表1,点9)。钙激活氯通道小胶质细胞中高度表达和活化的小胶质细胞和降低毒性应对CLCA抑制剂[23]。CLCA4抑制mir - 153 - 3 - p可能导致神经保护。
压力诱导的磷蛋白1(STIP1)(表1,点4)也上调应对mir - 153 - 3 - p模仿而mortalin的表达(热休克70 kda pro -爱因斯坦9-HSPA9)(表1,现货6)是衰减的。STIP1蛋白形式复杂HSC70一半寿命和[24],STIP1升高患者的血清神经dis -缓解[25]。我们还发现,14-3-3蛋白ε(14-3-3E)(表1点15),参与细胞周期调控,PI3-Akt信号,河马信号生成信号,汽车,和病毒cinogenesis(图4),抑制在应对mir - 153 - 3 - p抑制[26]。几节3亚型存在于路易小体显示14-3-3蛋白在神经的参与变性[27]。14-3-3蛋白的小分子核糖核酸的规定都有记录在14-3-3zeta mir - 451[28]的直接目标。
为了应对mir - 153 - 3 - p抑制cofilin-1衰减(表1点32),真实通过免疫印迹分析同一标准的(图5 b),同时mir - 205 - 5 - p过度导致cofilin-1上调(表1,点18)。Cofilin-1参与蛋白质易位,杆状由淀粉样β蛋白肌动蛋白束形成和被激活(β淀粉状蛋白质1-42)(29、30)。杆状肌动蛋白束网站有人蛋白质积累在广告[31]。免疫印迹分析证实cofilin-1监管,mir - 205 - 5 - p模拟(图5 c)和antagomir(图5 d)。
我们的数据表明,mir - 205 - 5 - p和mir - 153 - 3 - p影响直接和外围与神经退行性疾病相关流程,提供对可能的线索监管的关键路径(S4表,图4)。
通过mir-153-3p mir205-5p和过氧化物酶的调节。
我们发现，mir-153-3p表达的上调导致过氧化物酶2（PRDX2）（表1，1点）而mir-153-3p抑制的结果过氧化物酶-4（PRDX4的差异）的前体的上调（表1，9点）。观察mir-205-5p也相似的影响（表1，点19和29）。Prdx1家庭保护的氧化应激诱导的细胞凋亡的细胞和已与神经退行性疾病相关的[ 32 ]。通过调节硫氧还蛋白的氧化还原状态的神经细胞产生ROS MN9D减少6-OHDA ASK1激活预防（TRX），而过表达PRDX2 PRDX2击倒导致ROS增加[ 33 ]。胞浆PRDX2（S3表）也可以作为分子伴侣保护柠檬酸合成酶，引起聚集[ 34胰岛素和SNCA，35 ]。
表1.模仿物和拮抗物对mir-153-3p和mir-205-5p的SH-SY5Y细胞差异表达表。
我们验证了mir-153-3p和mir-205-5p-mediated增加PRDX2 Western blot分析（图5A和5C）。PRDX4的差异是公认的肿瘤驱动在下调在胶质母细胞瘤多形PRDX4的差异（GBMS）细胞的生长结果和ROS水平增加，DNA损伤，细胞凋亡[ 36 ]。
通过mir-153-3p和mir-205-5p PRDXs调控的建议，mir-153-3p和mir-205-5p可能影响细胞的ROS水平。事实上，过度的mir-153-3p和mir-205-5p导致显著降低ROS（图5e）。这表明，联合mir-153-3p和mir205-5p Prdx水平的影响，这可能会影响ROS水平（图5F）。
mir-153-3p和mir-205-5p改变已知的细胞周期调控
图4。蛋白质协会网络显示互连关系mir-153-3p和mir-205-5p靶蛋白之间通过关键调控途径。
图5。验证差异表达蛋白的Western blot分析和ROS反应mir-153-3p 和mir-205-5p变化。
许多microRNA参与细胞周期，癌细胞的增殖和转移[ 37 ]。响应mir-153-3p抑制我们确定核苷二磷酸激酶B（nm23）（表1，10点）和肿瘤抑制α-烯醇化酶（表1，11点），两细胞cycleregulatory蛋白[ 38，39 ]。mir-153-3p抑制结果nm23丰度增加（图2，10点），称为转录激活c-myc [ 40 ]。相反，α-烯醇化酶是针对mir-153-3p抑制调节（表1）。有趣的是，α-烯醇化酶与c-Myc基因的启动子，但与nm23基因，抑制c-myc的表达[ 41 ]。
我们还发现，mir-205-5p影响水平的改变与肿瘤的增殖、侵袭相关蛋白（表1）。mir-205-5p抑制下调nm23（表1，spot31）和蛋白质组（图2，33点）。蛋白质组的一部分，乙酰化酶抑制剂（inhat）复杂，在众多的肿瘤[ 42 ]上调。有趣的是，一个军共激活因子，新生多肽相关复杂的α（hsd48），上调（表1，16点）的mir-205-5p表达而其表达下降（表1，33点）的mir-205-5p抑制[ 43，44 ]。hsd48（NACA）调节mir-205-5p Western blot分析证实（图5c和4D）。
1，β-半乳糖苷结合蛋白与细胞增殖和分化相关也相应下降mir-205-5p抑制调节（表1，点30）[ 45 ]。
结合这些结果表明，mir-153-3p和mir-205-5p可能发挥的作用，在细胞的增殖和迁移涉及多种靶蛋白。
mir-153-3p和mir-205-5p具有调节作用的蛋白质参与代谢途径
增加葡萄糖刺激miR-153表达和mir-153表达减少ptprn2（蛋白酪氨酸磷酸酶受体N多肽2）基因敲除小鼠模型[ 46 ]。我们发现脂肪因子抑制物的表达（serpina12 A12）（表1，5点）是在响应mir-153-3p过度调节而丙酮酸脱氢酶β亚基（PDHB）（表1，2点），连接的糖酵解途径的TCA循环的关键酶，上调（表1）[ 47 ]。
mir-153-3p过度也导致了高迁移率族蛋白B1（HMGB1）调节（表1，3点），参与染色质重塑对基因表达的影响（表%s3）。HMGB1基因敲除小鼠致死性低血糖造成的死亡在24小时。为了验证上调响应mir-153-3p我们进行Western blot分析表达HMGB1（图5A）。有趣的是，切丝（CFL1）（表1，14点），从而降低丰度由于mir-153-3p抑制，表现为糖皮质激素受体抑制剂[ 50 ]。
类似mir-153-3p，mir-205-5p也下调Serpin A12（表1，26点）。此外，mir-205-5p 下调异柠檬酸脱氢酶[和]α亚基（idh3a）（表1，25点），在TCA循环和GAPDH 的关键酶（表1，25点）。mir-205-5p也上调Annexin A1（表1，20点），磷脂酶
A2活性蛋白调节[ 53 ]。
mir-205-5p与转录调控有关
mir-205-5p似乎影响影响mRNA的表达和处理蛋白质的丰度（表1和图2）。丝氨酸/精氨酸丰富的剪接因子1（srsf-1）（表1，28点），以保证拼接精度和调节的可变剪接，是响应mir-205-5p抑制[ 54 ]上调。事实上，hsd48（表1，16和33点），这是受mir-205-5p，是转录调节[ 55 ]。mir-205-5p抑制也会导致TAR DNA 结合蛋白43（TDP-43）丰度增加（表1，表%s3，现货27）促进CFTR基因外显子跳跃和调节转录[ 56 ]。nm23基因的表达，一个调制器，也mir-205-5p表达水平降低了响应mir-205-5p抑制调节（表1，点31）[ 57 ]。
作为微小RNA是最常参与转录调控，了真核翻译起始因子5A-1 B亚型调节（eIF5A）（表1，17点）和（eif3i）（表1，23点），在响应mir-205-5p并不奇怪。
结论总结
MicroRNA生物学是复杂的,我们已经表明,mir - 153 - 3p和mir - 205 - 5p影响使用者ence大量
蛋白质的丰度积分在neuroblas——许多生物学过程生田斗真细胞(图4,S3表)。有趣的是,我
们观察到一些蛋白质(cofilin-1和HSFD48)相互回应microrna的模仿和antagomir监管效果而
其他蛋白质并没有显示这个互惠的监管。这表明蛋白质本研究中确定代表直接和间接的结合mir - 153 - 3p的目标和mir - 205 - 5p。
一些这些流程与鉴定相关蛋白质的根本自然而其他人则专门与细胞生存,细胞增殖andneuroprotection。虽然我们承认改变大量的一小部分蛋白质的途径不一定表明整个通路
的影响,我们的研究强调,要完全理解microRNA-mediated流程整体的方法是需要,这将为进一步了解神经过程联系在一起正常发育和疾病。
致谢
这项工作是由挪威研究委员会的资助,西方挪威卫生行政部门和挪威运动障碍中心。我们感
谢Katja博士贝克尔,克里斯蒂娜Fernandez-Valle博士和苏珊娜Hradetkzy抗体。作者宣布他
们没有利益冲突。
作者的贡献
构思和设计实验:KP IB RP HPH GA EJC喷气推进实验室SGM。完成了实验:KP IB RP HPH EJC。
分析了数据:KP IB RP HPH GA EJC喷气推进实验室SGM。共同对试剂/材料/分析工具:EJC SGM。该报写道:KP IB RP GA EJC喷气推进实验室上海通用汽车有限公司。
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蛋白质组学生物信息学分析介绍
生物信息学分析FAQ CHAPTER ONE ABOUT GENE ONTOLOGY ANNOTATION (3) 什么是GO？ (3) GO和KEGG注释之前，为什么要先进行序列比对（BLAST）？ (3) GO注释的意义？ (3) GO和GOslim的区别 (4) 为什么有些蛋白没有GO注释信息？ (4) 为什么GO Level 2的统计饼图里蛋白数目和差异蛋白总数不一致？ (4) 什么是差异蛋白的功能富集分析&WHY？ (4) GO注释结果文件解析 (5) Sheet TopBlastHits (5) Sheet protein2GO/protein2GOslim (5) Sheet BP/MF/CC (6) Sheet Level2_BP/Level2_MF/Level2_CC (6) CHAPTER TWO ABOUT KEGG PATHWAY ANNOTATION (7) WHY KEGG pathway annotation? (7) KEGG通路注释的方法&流程？ (7) KEGG通路注释的意义？ (7) 为什么有些蛋白没有KEGG通路注释信息？ (8) 什么是差异蛋白的通路富集分析&WHY？ (8) KEGG注释结果文件解析 (8) Sheet query2map (8) Sheet map2query (9) Sheet TopMapStat (9) CHAPTER THREE ABOUT FEATURE SELECTION & CLUSTERING (10) WHY Feature Selection? (10)
聚类分析（Clustering） (10) 聚类结果文件解析 (10) CHAPTER FOUR ABOUT PROTEIN-PROTEIN INTERACTION NETWORK (12) 蛋白质相互作用网络分析的意义 (12) 蛋白质相互作用 VS生物学通路？ (12) 蛋白质相互作用网络分析结果文件解析 (12)
蛋白质组学与分析技术1
名词解释 蛋白质组学：是研究与基因对应的蛋白质组的学科。指一种基因组所表达的全套蛋白质,即包括一个基因组、一种细胞或组织，乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 双向电泳原理：双向一般是指第一向为等点聚焦（IEF），根据蛋白质等电点进行分离；第二向为SDS凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据蛋白质的相对分子量进行分离。 三步纯化策略:第一步粗提，浓缩，稳定蛋白，去除蛋白酶，使用梯度洗脱来增加捕获步骤的速度和容量；第二步中度纯化，去除主要杂质，一般需要连续梯度洗脱； 第三步精纯，最终去除痕量杂质，如目标蛋白的结构变体。 高效液相色谱：是一种以高压输出液体为流动相的色谱技术。在技术上采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器，克服了经典液相色谱固定相柱效低，分析周期 长的缺点，具有分析速度快、分离效率高、检出极限地的特点。 吸附色谱：吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸 附中心的过程。 PCR扩增：即聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA 得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 基因组文库：基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。 广义的基因文库指来于单个基因组的全部DNA克隆，理想情况下应含有这一 基因组的全部DNA序列（遗传信息），这种基因文库常通过鸟枪法获得。 狭义的基因文库有基因组文库和cDNA文库之分。 cDNA文库：按构建基因文库的类似方法对cDNA进行克隆，获得的克隆总称。 基因芯片：基因芯片又叫DNA芯片（DNA chip)，DNA微阵列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）是一种将核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的高新生物技术。将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体（硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等）上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。 基因敲除（gene knock out）：又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细
浅析功能基因组学和蛋白质组学的概念及应用
【摘要】基因组相对较稳定，而且各种细胞或生物体的基因组结构有许多基本相似的特征；蛋白质组是动态的，随内外界刺激而变化。对蛋白质组的研究可以使我们更容易接近对生命过程的认识。蛋白质组学是在细胞的整体蛋白质水平上进行研究、从蛋白质整体活动的角度来认识生命活动规律的一门新学科，简要介绍功能基因组学和蛋白质组学的科学背景、概念及其应用。 【关键词】基因组；功能基因组学；蛋白质组学； 一、基因组及基因组学的概念 基因组(genome)一词系由德国汉堡大学H．威克勒教授于1920年首创，用以表示真核生物从其亲代所继承的单套染色体，或称染色体组。更准确地说，基因组是指生物的整套染色体所含有的全部DNA序列。由于在真核细胞的线粒体和植物的叶绿体中也发现存在遗传物质，因此又将线粒体或叶绿体所携带的遗传物质称为线粒体基因组或叶绿体基因组。原核生物基因组则包括细胞内的染色体和质粒DNA。此外非独立生命形态的病毒颗粒也携带遗传物质，称为病毒基因组。所有生命都具有指令其生长与发育，维持其结构与功能所必需的遗传信息，本书中将生物所具有的携带遗传信息的遗传物质总和称为基因组。[1] 基因组学(genomic)一词系由T．罗德里克(T．Roderick)于1986年首创，用于概括涉及基因组作图、测序和整个基因组功能分析的遗传学学科分支，并已用来命名一个学术刊物Genomics。基因组学是伴随人类基因组计划的实施而形成的一个全新的生命科学领域。[1] 基因组学与传统遗传学其他学科的差别在于，基因组学是在全基因组范围研究基因的结构、组成、功能及其进化，因而涉及大范围高通量收集和分析有关基因组DNA的序列组成，染色体分子水平的结构特征，全基因组的基因数目、功能和分类，基因组水平的基因表达与调控以及不同物种之间基因组的进化关系。基因组学的研究方法、技术和路线有许多不同于传统遗传学的特点，各相关领域的研究仍处于迅速发展和不断完善的过程中。 基因组学的主要工具和方法包括：生物信息学，遗传分析，基因表达测量和基因功能鉴定。 二、功能基因组学的概念及应用
蛋白质组学及其在疾病研究中的应用
综述摘要 创新中药及其在我国的发展 邓文龙(四川省中药研究所,成都610041)本文就创新中药的定义、标准及创新中药在我国的发展进行了讨论。作者认为一流的临床疗效或独特的作用机理是创新中药的首要条件,按药物有效成分的有效剂量进行质量控制是创新中药的基础。 蛋白质组学及其在疾病研究中的应用 段春燕综述,何涛审校 (泸州医学院生物化学教研室,四川泸州646000) 目前人类基因组计划已进入后基因组时代,1994年Mac Wilkins与Keith Williams首先提出了蛋白质组学(prot eomics)的概念。依赖于二向电泳、质谱技术及生物信息学等多种手段的蛋白质组学分析在肿瘤、心血管系统、内分泌系统、神经系统及感染性疾病等的研究中得到了充分的应用,从整体的蛋白质水平上,在一个更深入、更贴切生命本质的层次上来探讨和发现生命活动的规律和重要生理、病理现象的本质。 蜂毒的现代药理研究及临床应用概况 夏隆江 (成都中医药大学药理教研室2004级博士生,成都610075)蜂毒是蜜蜂科昆虫中华蜜蜂Apis cerana F abricus等之工蜂尾部蛰刺毒腺和副腺分泌出的具有芳香气味的淡黄色透明毒液,是具有多种药理学和生物学活性的复杂混合物,主要由多种肽和酶类活性物质组成。它具有较广泛的药理作用:1、对心血管的作用:蜂毒有明显的降血压作用,其作用类似于组胺,是通过扩血管实现的;同时,蜂毒对心肌具有正性频率和负性肌力作用。2、对神经系统的作用:蜂毒有明显的镇痛作用和调节神经系统紧张度的作用。3、对血液的作用:蜂毒具有溶血、抗凝血和降低血栓素的作用。4、对呼吸系统的作用:蜂毒可使呼吸加快,大量的蜂毒可导致呼吸肌麻痹。5、对消化系统的作用:蜂毒有抗肝纤维化和吸收肝纤维化作用。6、对内分泌系统的作用:蜂毒对垂体、肾上腺皮质系统有明显的兴奋作用。7、对免疫系统的作用:蜂毒具有免疫抑制作用。8、抗炎镇痛作用:蜂毒肽对前列腺素合成酶的抑制作用是吲哚美辛的70倍,具有极强的抗炎镇痛效果。另外,蜂毒还具有抗肿瘤、抗辐射、抗菌等作用。在临床运用方面,临床上蜂毒被广泛地用于治疗风湿性、类风湿性疾病、多发性硬化病、艾滋病、高血压、哮喘、白塞病、寻常型银屑病等,具有较大的研究前景和临床运用价值。 瘦素的研究现状 龙中奇(四川省达州中医学校,达州635000)本文对瘦素的生物学性质及生理生化功能作一综述。 帕金森病的研究进展 唐宗琼(四川省达州中医学校,达州635000)多种因素导致帕金森病(PD)发病,归纳起来有以下几种学说:1遗传因素学说;环境因素学说;氧化应激学说;免疫学说;细胞凋亡学说;o对PD治疗的探索:细胞替代疗法(CRT)治疗PD是目前研究PD的热点,CRT治疗PD的目的是重建纹状体受损的多巴胺(D A)能神经支配,重建脑功能。根据供体的不同,PD的CRT治疗可分为:自体肾上腺髓质移植、同种异体胎脑移植、异种胎脑移植和干细胞移植。其中,自体肾上腺髓质移植经临床研究证实嗜铬细胞植入脑内后存活率极低,无肯定的治疗作用而已被淘汰。 胃肠肽类激素对摄食活动的调节 孙玉锦(雅安职业技术学院,雅安625000)摄食是复杂的行为,是一种精神活动,它包括觅食、食物的摄取、消化、吸收和利用,摄食是人类以及所有动物维持生命活动的最基本最重要的功能之一,摄入的食物经过消化和吸收过程为机体提供必须的能量和营养物质。虽然摄食作用作为一种本能生来即有,但实际上摄食活动是受体内复杂的神经和体液因素调节的,涉及到神经中枢、传入传出神经以及许多神经递质和激素。本文仅讨论胃肠肽类激素对摄食活动的调节。 将饱食大鼠的血液注入饿鼠血管内,可抑制饿鼠的摄食活动,这个事实提示血液中含有控制摄食的信息。这种信息是什么?推想饥饿使人或动物在短时间内大量进食,在食物未完全消化吸收之前,就因产生饱感而停止继续进食,究其原因很可能是食物与胃肠粘膜接触后,引起胃肠肽类激素释放,胃肠肽类激素通过血液循环,作用于下丘脑,兴奋饱中枢)下丘脑腹内侧核(VMH),抑制摄食中枢)下丘脑的外侧区(LHA),从而停止摄食。影响摄食活动的胃肠肽类激素较多,但其中只有少数胃肠肽类激素对摄食调节有生理意义,大多数胃肠肽类激素需要给予药理剂量才对摄食活动发生影响。本文介绍了体内多种胃肠肽类激素:胆囊收缩素、阿片肽、铃蟾肽、胰高糖素、胰岛素、酪神经肽、胃动素、甘丙素、生长抑素、雨蛙肽等对摄食有促进或抑制作用,目前对它们作用的许多环节还不完全清楚,但随着研究的不断深入,其与摄食有关的许多问题将会逐渐得到阐明。 实验研究摘要 松龄血脉康胶囊对自发性高血压 大鼠的降压作用及机制初探(摘要) 万莉红,熊文碧,朱玲,刘蓉,谢芬,刘嘉琴,周黎明*,李崇前1,张顺华1 (四川大学华西基础与法医学院药理教研室,四川成都610041;1成都康弘集团#博士后工作站,四川成都610036)目的:探讨中药松龄血脉康胶囊胶囊对自发性高血压大鼠是否具有降压作用,并初步探讨起作用的机制。方法:雄性自发性高血压大鼠(SHR)60只,随机分为高血压模型组、卡托普利组、Vc 组、松龄血脉康胶囊组四组,并设立正常血压大鼠(WKY)15只作为对照组,用BP26动物无创血压测试仪试验前测定各组动物的基础血压。(1)各组分别给予生理盐水、卡托普利12.5mg#kg-1、Vc50mg#kg-1、松龄血脉康胶囊胶囊750mg#kg-1灌胃,每日一 133 四川生理科学杂志2005;27(3)
蛋白质组学及其应用研究
现代商贸工业 ２０１９年第１６期 ７９ 一间不了解,往往会错过报名时间而与心仪的证书擦肩 而过.２．４一学生缺乏清晰的职业规划 据调查,大多数的学生对自己的所学专业并不是很了解.并认为自己在大学期间对本专业的学习比较浅显,缺乏实践.对自身未来就业感到十分迷茫,对自己专业的就业前景知之甚少.这种没有结合自身实际的职业规划,就会对学生考取证书的选择有较大的影响.２．５一学生的考证成本较大 大学生目前的考证方式主要有两种:自学和报班.报班的话,费用和时间成本会较高.且社会上的考证机构参差不齐,学生较难判断.自学的话,难度较大.时间成本会更高.学生考取证书所付出的精力会更多.这可能会影响学校的正常学习.可能会出现本末倒置的情况.且社会上考取证书的参考资料品质不一.学生难以判断选择最适合的考证资料. ３一考证问题相应的对策 ３．１一学生角度对策 (１)理性考证,切忌盲目跟风,证书并不是越多越好,分析自己所在的专业,了解与自己专业相关的证书,合理的安排考证和学校课程的时间,千万不要忽略学校授予的专业知识.证书或许能为你找工作提供一定的帮助,但真正让你立足于社会的是自身的能力,保持理智,不可本末倒置. (２ )做好自己的职业生涯规划,让自己对未来有一个明确的目标,然后根据这个目标,去选择能帮助到自己的证书,同时观察市场行情和国家形势,选择恰当的目标和时机去考取证书. (３)在考取证书的时候,一定要去了解该证书的详细信息,如考证费用二难易程度等,考取好的二知名度高的证书往往代表着你要投入大量的时间二金钱和精力,结合自身的实际情况来选择证书,适合自己的才是最好的.在选择培训机构的适合,一定要选择权威的二正式的机构,切勿贪小便宜而因小失大.３．２一学校角度对策 (１ )应帮助同学们建立起正确的三观二就业观,如东南大学成贤学院就应设立相应的讲座和课堂,为同学们讲解关于以后踏入社会的相关知识,培养大家独立二理性解决问题的能力. (２ )在校内设立与考证相关的导师机构,为同学们考证排忧解难,给出建议,避免学生盲目跟风,为考证不顾学业.同时要适当的疏导同学,避免对学习和就业产生过多的压力. (３ )学校需要做好一个合理引导的角色,应当不断完善学生的就业指导与服务体系,帮助学生树立正确的就业观念与明确的职业规划,端正考证动机,摒弃不良的考证心态,妥善处理好在校学习与考证学习的关系,让学生明白只有扎实提高自身能力与素质才会使自己终生获益.３．３一社会角度对策 (１ )用人单位应该完善用人的标准和要求,不以证书的数量来衡量学生的能力,用人标准和要求应多注重大学生的综合素质和实践能力. (２ )国家对于各种证书的认证要严格,对于各种培训机构要进行认真清理,不合法的要坚决取缔,考证不能成为不良居心的人利用应试考试赚取钱财的手段.同时加强考场管理,坚决反对作弊等现象的发生,为考证提供一个可信的平台,树立证书的权威性. (３)政府要做好用人单位和学校之间的沟通与交流,建立合作平台,保证人尽其用.优秀的大学生是社会紧缺的人力资源,为了避免这一人力资源的浪费,搭建企业与学校直接对接的桥梁是必不可少的,可以在为企业寻找需求的人才的同时,给予大学生实践和学习的机会. 参考文献 [１ ]关化少．我国本科应用型创新人才培养之特点二价值与理论期待[J ]．北京教育,２０１５,(０５)．[２]舒程． 考证热 背景下大学生创业与就业能力培养分析[J ]． 赤峰学院学报,２０１７,(０２)． [３]费芳．大学生 考证热 亟需正确引导[J ]．湘声报,２０１５,(０１)． [４]李晓娜．大学生 考证热 现象的经济学分析[J ]． 经济研究导刊,２０１４,(２４)． 蛋白质组学及其应用研究 魏东阳 (宝鸡中学,陕西宝鸡７２１０００ )摘一要:蛋白质组学的概念最早是由澳大利亚学者W i l k i n s 和W i l l i a m s 于１９９４年提出, 细胞二组织或者机体的基因组所表达的全部蛋白就称为蛋白质组学.蛋白质组学是一个研究蛋白质组及大范围蛋白质的分离二分析二应用的学科.它不同于传统的利用生物化学的方法研究单个蛋白质或某一类蛋白,而是在大规模水平上研究体系内全部蛋白质及其动态变化规律.随着学科的发展,蛋白质组学的研究范围也在不断完善和补充,通过查阅大量文献,总结蛋白质组学技术,并研究蛋白组学在生物医学二转基因技术二生物制药技术等领域的. 关键词:蛋白质组;蛋白质组学;蛋白质组学应用 中图分类号:F ２４一一一一一文献标识码:A一一一一一一d o i :１０．１９３１１/j ．c n k i ．１６７２Ｇ３１９８．２０１９．１６．０３４一一蛋白质组(P r o t e o m e )是由蛋白质(P r o t e i n )和基因组(g e n o m i c )两个词的组合而来,是指生命体(包括细胞二组织等)的一个基因组所表达的所有蛋白质.其主 要研究内容就是能在大规模水平上研究蛋白质的表 达二翻译后的修饰以及蛋白质与蛋白质之间的相互作用,从而来了解蛋白质参与细胞二人体代谢及其他生命
蛋白质组学蛋白质组学相关技术及发展文献综述
蛋白质组学蛋白质组学相关技术及发展文献综述 蛋白质组学相关技术及发展文献综述张粒植物学211070161概念及相关内容1994年澳大利亚Macquaie大学的Wilkins和Williams等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组proteome这个概念该英文词汇由蛋白质的“prote”和基因组的“ome”拼接而成并且最初定义为“一个基因组所表达的蛋白质”1。然而这个定义并没有考虑到蛋白质组是动态的而且产生蛋白的细胞、组织或生物体容易受它们所处环境的影响。目前认为蛋白质组是一个已知的细胞在某一特定时刻的包括所有亚型和修饰的全部蛋白质2。蛋白质组学就是从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态了解蛋白质之间的相互作用与联系提示蛋白质的功能与细胞的活动规律。2蛋白质组学的分类蛋白质组学从其研究目标方面可分为表达蛋白质组学和结构蛋白质组学。前者主要研究细胞或组织在不同条件或状态下蛋白质的表达和功能这将有助于识别各种特异蛋白3目前蛋白质组学的研究在这方面开展的最为广泛其运用技术主要是双相凝胶电泳Two-dimensional gel electrophoresis2DE技术以及图像分析系统当对感兴趣的蛋白质进行分析时可能用到质谱。由于蛋白质发生修饰后其电泳特性将发生改变这些技术可以直接测定蛋白质的含量并有助于发现蛋白质翻译后的修饰如糖基化和磷酸化等4。结构蛋白质组学的目标是识别蛋白质的结构并研究蛋白质间的相互作用。近年来酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用时常用的方法同时研究者也将此方法不断改进5。有研究者最近发现在研究蛋白质相互作用时通过纯化蛋白复合物并用质谱进行识别是很有价值的4。3蛋白质组学相关技术目前蛋白质组学研究在表达蛋白质组学方面的研究最为广泛其分析通常有三个步骤第一步运用蛋白质分离技术分离样品中的蛋白质第二步应用质谱技术或N末端测序鉴定分离到的蛋白质第三步应用生物信息学技术存储、处理、比较获得的数据。3.1蛋白质分离技术这类技术主要是电泳其中应用最多的是双向电泳技术其他还有SDS-PAGE、毛细吸管电泳等。除了电泳外还有液相色谱通常使用高效液相色谱HPLC和二维液相色谱2D-LC。另外还有用于蛋白纯化、除杂的层析技术、超离技术等。 3.1.1双相凝胶电泳双相凝胶电泳two-dimensional gel elec—trophoresis2DE这是最经典、最成熟的蛋白质组分离技术产生于20世纪70年代中叶但主要的技术进步如实验的重复性、可操作性蛋白质的溶解性、特异性等是在近lO年取得的。它根据蛋白质不同的特点分两相分离蛋白质。第一相是等电聚焦IEF电泳根据蛋白质等电点的不同进行分离。蛋白质是两性分子根据其周围环境pH可以带正电荷、负电荷或静电荷为零。等电点pI是蛋白质所带静电荷为零时的pH周围pH小于其pI时蛋白质带正电荷大于其pI时蛋白质带负电荷。IEF时蛋白质处于一个pH梯度中在电场的作用下蛋白质将移向其静电荷为零的点静电荷为正的蛋白将移向负极静电荷为负的将移向正极直到到达其等电点如果蛋白质在其等电点附近扩散那么它将带上电荷重新移回等电点。这就是IEF的聚焦效应它可以在等电点附近浓集蛋白从而分离电荷差别极微的蛋白。pH梯度的形成最初是在一个细的包含两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶管中进行。在电流的作用下两性电解质可形成一个pH梯度。但由于两性电解质形成的pH梯度不稳定、易漂移、重复性差80年代以后研究人员研制了固定pH梯度的胶条IPG。此种胶条的形成需要一些能与丙烯酰胺单体结合的分子每个含有一种酸性或碱性缓冲基团。制作时将一种含有不同酸性基团的此分子溶液和一种含有不同碱性基团的此分子溶液混合两种溶液中均含有丙烯酰胺单体和催化剂不同分子的浓度决定pH的范围。聚合时丙烯酰胺成分与双丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺凝胶。第二相是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE根据蛋白质的分子量不同进行分离。此相是在包含SDS的聚丙烯酰胺凝胶中进行。SDS是一种阴离子去污剂它能缠绕在多肽骨架上使蛋白质带负电所带电荷与蛋白质的分子量成正比在SDS聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质分子量的对数与它在胶中移动的距离基本成线性关系。SDS-PAGE装置有水平和垂直两种形式垂直装置可同时跑多块胶如Amersham pharmacia Biotech的Ettan DALT II系统可同时跑12块胶提高了操作的平行性。经过2DE
蛋白质组学技术在各领域的解决方案
蛋白质组学技术在农业生物科研领域、疾病机理机制研究、药物研究、海洋环境、植物胁迫机制研究等方面具有广泛应用。蛋白组学的研究通常遵循以下思路： 蛋白质组学研究思路 图 1 蛋白质组学研究思路 一、蛋白质组学在农业生物科研领域的应用 蛋白质组学技术在农业生物科研领域的应用为作物生长发育、病虫害防治、遗传育种、畜牧兽医学疾病诊断和治疗等方面发挥重要的作用，为现代农业发展开辟新途径。 1 .蛋白质组学在农作物研究中的应用 农业是我国人口赖以生存的基础，而提高粮食产量和品质则是农业发展的关键。蛋白质组学关键技术在作物遗传育种、品系鉴定、品质改良、逆境胁迫应答等关键环节的应用，为农业作物的进一步开发利用提供巨大的参考价值。蛋白质组学可系统研究农作物在特定环境或某个发育阶段的组织和器官中蛋白质的表达变化，有助于作物发育过程机制的理解。 Jia等人利用SWATH等技术对四种玉米组织中的蛋白质进行定量分析：包括未成熟雌穗，未成熟雄穗，授粉后20天的幼胚和14日龄幼苗的根。在玉米的4种组织中总共鉴定到4551个蛋白质，其中在雌穗，雄穗，幼胚和幼根中分别鉴定到3916、3707、3702和2871种蛋白质。利用生物信息学技术将蛋白质组和转录组进行关联分析，并且进一步分析组织特异性高表达的基因和蛋白，以了解玉米组织结构和器官发生的调节机制，为研究玉米发育生物学研究提供了新的线索。相关成果2017年发表在Journal of Proteome Research上。
图 2 实验流程图 文献来源：Jia HT, Sun W, Li MF, et al. An integrated analysis of protein abundance, transcript level and tissue diversity to reveal developmental regulation of maize [J]. J. Proteome Res, December 18, 2017. 2.蛋白质组学在食品科学中的应用 在食品安全研究中，蛋白组学的出现为食品科学的研究指明了方向，同时也为食品科学的研究奠定了良好的发展平台。蛋白质组学在粮油食品、肉类食品、水产食品、乳品食品等方面的应用，不仅可以提高食品安全，并且在改善食品制作以及储存条件的同时，还可以提高食品的口感以及营养程度。 在热处理过程中，肉类的主要成分蛋白质会发生结构性变形，如氧化、降解、变性和聚集。蛋白质的这些变化对最终肉制品的质量、颜色、嫩度和风味有重要影响，并最终影响适口性和可接受性。Tian等人利用2-DE等技术手段研究了在加热中心温度为72℃时用不同的烹饪方法，例如水浴烹饪-WB、短时欧姆烹饪-STOH和长时间欧姆烹饪-LTOH，对牛肉的颜色、烹饪损失、剪切值和蛋白质组变化的影响。蛋白质组学分析表明，欧姆烹饪的烹饪损失、剪切值显著低于水浴烹饪（P<0.05）。利用2-DE蛋白组学技术成功鉴定到STOH和WB烹饪样品之间的17个差异蛋白质，并鉴定出LTOH和WB样品之间的13个差异蛋白质。大多数差异蛋白是肌原纤维和肌浆蛋白，可能与肉质的变化相关。WB烹饪可改变蛋白质溶解度并降低2-DE图像中的蛋白质斑点强度。应用欧姆烹饪会产生更高质量的牛肉产品，并减少烹饪时间。相关成果2016年发表在Innovative Food Science & Emerging Technologies上。
蛋白质组学与分析技术课复习思1考
蛋白质组学与分析技术课复习思考 一、名词解释 1、蛋白质组学： 蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 2、二维（双向）电泳原理： 根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。 3、三步纯化策略： 第一步:粗提。纯化粗样快速浓缩(减少体积) 和稳定样品(去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第二步：中度纯化。去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第三步：精细纯化。达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析 4、高效纯化策略 在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。5、离子交换色谱： 离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。 6、吸附色谱 吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。 7、PCR扩增 PCR技术（polymerase chain reaction）技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。进而推断出因序列的情况下使用。PCR 的每次扩增循环包括三步:1）变性,在高温下把双链靶DNA拆开；2）在较低的温度下使
蛋白质组学及其主要技术
蛋白质组学及其主要技术 朱红1 周海涛2 (综述) 何春涤1, (审校) (1.中国医科大学附属第一医院皮肤科,辽宁沈阳110001； 2.北京大学深圳医院核医学 科，广东深圳518036) 【摘要】蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新兴学科，近年来发展迅速，已成为后基因组时代的研究热点。目前，蛋白质组学研究技术主要包括：样品的制备和蛋白质的分离、蛋白质检测与图像分析、蛋白质鉴定及信息查询。本文就蛋白质组学概念及主要技术进行综述。 【关键词】蛋白质组，蛋白质组学 1蛋白质组学的概念 随着人类基因组测序计划的完成，人们对生命科学的研究重点由结构基因组转向功能基因组，1994年Wilkins和Williams首先提出蛋白质组一词[1]，蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。从基因到蛋白质存在转录水平、翻译水平及翻译后水平的调控，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度不完全符合[2]。蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等也无法从DNA／mRNA水平来判断。因此，只有将功能基因组学与蛋白质组学相结合，才能精确阐明生命的生理及病理机制。 蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，对组织、细胞的整体蛋白进行检测，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质的相互作用,在蛋白质水平上了解细胞各项功能、各种生理、生化过程及疾病的病理过程等[3,4]。蛋白质组学有两种研究策略。一种是高通量研究技术，把生物体内所有的蛋白质作为对象进行研究，并建立蛋白质数据库，从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，更符合蛋白质组学的本质。但是，由于剪切变异和翻译后修饰，蛋白质数量极其庞大，且表达随空间和时间不断变化，所以分析生物体内所有的蛋白质是一个耗时费力，难以实现的理想目标。另一种策略是研究不同状态或不同时期细胞或组织蛋白质组成的变化，主要目标是研究有差异蛋白质及其功能，如正常组织与肿瘤组织间的差异蛋白质，寻找肿瘤等疾病标记物并为其诊断治疗提供依据。 2蛋白质组学的常用技术 2.1样品的制备和蛋白质的分离技术 2.1.1样品的制备样品制备包括细胞裂解与蛋白质溶解，以及去除核酸等非蛋白质成分。 激光捕获显微切割(Laser-captured microdissection, LCM)[5]技术可大量获得足够用于蛋白质组学研究的单一细胞成分，避免其他蛋白成分对电泳结果的干扰。尤其是肿瘤的蛋白质组学研究常用LCM技术来获取单一的肿瘤细胞。 2.1.2蛋白质的分离技术 ①双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis, 2-DE)：双向电泳方法于 l975年由O'Farrell[6]首先提出，根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。 第一向为等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。较早出现的IEF是载体两性电解质pH梯度，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度；20世纪80年代初建立起来的固相pH梯度(Immobilized pH gradients，IPG)IEF，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度。IPG胶实验的重复
质谱技术在蛋白质组学研究中的应用_甄艳
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) J o u r n a l o f N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ) V o l .35,N o .1 J a n .,2011 h t t p ://w w w .n l d x b .c o m [d o i :10.3969/j .i s s n .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10K J B 220002) 作者简介:甄艳(1976—),副教授,博士。＊施季森(通信作者),教授。E -m a i l :j s h i @n j f u .e d u .c n 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J ].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 ＊ (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q 81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 A p p l i c a t i o n o f m a s s s p e c t r o m e t r y i n p r o t e o m i c s s t u d i e s Z H E NY a n ,S H I J i s e n ＊ (K e y L a b o r a t o r y o f F o r e s t G e n e t i c s a n d B i o t e c h n o l o g y M i n i s t r y o f E d u c a t i o n , N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210037,C h i n a ) A b s t r a c t :W i t ht h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f p r o t e o m i c s ,m a s s s p e c t r o m e t r y i s m a t u r i n g t o b e a p o w e r f u l t o o l a n dc o r e t e c h -n o l o g y f o r p r o t e o m i c s s t u d i e s d u r i n g t h e r e c e n t y e a r s .T h e s u p e r i o r i t y o f m a s s s p e c t r o m e t r y l i e s i n p r o v i d i n g t h e t h r o u g h -p u t a n d t h e m o l e c u l a r i n f o r m a t i o n ,w h i c hn o o t h e r t e c h n o l o g y c a n b e m a t c h e di np r o t e o m i c s .I nt h i s r e v i e w ,w e m a d e a g l a n c e o n t h e o u t l i n e o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e d p r o t e o m i c s .A n dt h e nw e a d d r e s s e d o n t h e a d v a n c e s o f d a t a a n a l y s i s o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,q u a n t i t a t i v em a s ss p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,p o s t -t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s b a s e d m a s s s p e c t r o m e t r y ,t a r g e t e d p r o t e o m i c s a n df u n c t i o n a l p r o t e o m i c s b a s e d -m a s s s p e c t r o m e t r y . K e yw o r d s :m a s ss p e c t r o m e t r y ;p r o t e o m i c s ;q u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c s ;p o s t -t r a n s l a t i o n m o d i f i c a t i o n ;t a r g e t e d p r o -t e o m i c s ;f u n c t i o n a l p r o t e o m i c s 蛋白质组学(P r o t e o m i c s )是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ,E S I )和基质辅助激光解析离子化(m a -t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ,M A L D I )的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(i o n t r a p ,I T ),飞行时间(t i m e o f f l i g h t ,T O F ),串联飞行时间(T O F -T O F ),四级杆/飞行时间(q u a d r u p o l e /T O F h y b r i d s ),离子阱/轨道阱(I T /o r b i t r a ph y b r i d ) 和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /F o u r i e r t r a n s f o r m i o n c y c l o t r o nr e s o n a n c em a s s s p e c t r o m e t e r s h y b r i d s ,I T /F T M S ),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化
蛋白质组学的研究进展及应用
《蛋白质工程》 （课程论文）题目名称：蛋白质组学技术的研究进展及应用 所在学院：生命科学与技术学院 专业（班级）：生技131班 学生姓名：梁健 授课教师：韩晓菲
蛋白质组学技术的研究进展及应用 生技131班梁健13772025 摘要：随着人类基因组计划全部测序的初步完成，研究重点转到对基因功能的研究上。蛋白质作为基因功能的主要体现者，对其表达模式和功能的研究成为热点，出现了蛋白质组学。研究蛋白质组学有助于了解蛋白的结构、细胞的功能、生命的本质及活动规律，为疾病的诊断、治疗、疫苗及新药开发提供科学依据。关键词：蛋白质组学；进展；应用 蛋白质组学(proteomics)是产生于20世纪90年代中期的一门新兴学科，以 细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象，是后基因组时代生命科学研究的核心内容。蛋白质组学的产生与发展经历了一个漫长的过程，在这个过程中，研究者不断修正蛋白质组学的发展方向和推进蛋白质组学相关支撑技术的快速 发展，进而拓展蛋白质组学在整个生命科学和生物医学研究中的应用，成为后基因组时代重要的研究新领域，并成功地应用到基础研究及医学研究等各个领域，推进其迅速发展。 1 蛋白质组学的概念及研究内容 1.1蛋白质组学的概念 蛋白质组(proteome)源于protein和genome两词的杂合，最早是由澳大利亚 的WILKINS等于1995年提出，其定义为“一种基因组所表达的全部蛋白质”。早期相对狭义的蛋白质组的概念是指在某一特定的时间和空间条件下，1个细胞的基因组所表达的蛋白质数目的总和。随着研究的深入，人们提出了广义的蛋白质组的概念，用来描述1个细胞、组织、器官或1个物种的生命个体，在其不同的生存及发育条件下所表达的各种蛋白数目的总和。所以蛋白质组所含的蛋白数目及其表达量是随着时间和空间的不同而不断发生变化的。蛋白质组学最有价值的优势是它可以观察在特定的时间下一个完整的蛋白质组或蛋白亚型在某种生理 或病理状态中，发生的相应的变化。 1.2 研究内容 根据研究内容的不同，蛋白质组学可分为差异蛋白质组学(或称表达蛋白质 组学)、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学，其中差异蛋白质组学在蛋白质组学 研究中十分常用且应用广泛。差异蛋白质组学主要是研究比较在2种或多种不同条件下蛋白质组表达的差异变化。结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析。蛋白质表达模式的研究是蛋白质组学研究的基础内容，主要研究特定条件下某一细胞或组织的所有蛋白质的表征问题。功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质的功能和蛋白
生物信息学在蛋白质组学中的应用
生物信息学在蛋白质组学中的应用 摘要：生物信息学是现代生命科学与信息科学、计算机科学、数学、统计学、物理学、化学等学科相互渗透而高度交叉形成的一门新兴前沿学科。而蛋白质组学是后基因时代标志性的研究新领域, 其快速发展很大程度上依赖于生物信息学的蓬勃壮大。从生物信息学与蛋白质数据库、蛋白质分析、蛋白质功能的联系3个方面, 对生物信息学在蛋白质组学上应用的研究进展进行综述。 关键词：生物信息学; 蛋白质组学; 蛋白质数据库; 蛋白质分析; 蛋白质功能随着人类基因组测序计划的完成, 生命科学的重心开始转移到对基因的表达产物—蛋白质的研究上来, 蛋白质组学遂成为后基因时代的研究前沿和热点领域。因为蛋白质是基因功能活动的最终执行者, 是生命现象复杂性和多变性的直接体现者, 因此人类要揭示整个生命活动的规律, 就必须研究基因的产物—蛋白质, 从基因水平向蛋白质水平的深化成为了生物学研究发展的必然趋势。蛋白质具有自身特有的活动规律, 随着生命活动的进程表现出极其动态的紧密协调的变化。蛋白质在合成之后具有相对独立的修饰、转运和相互间作用能力, 同时还具有对外界因素发生反应的能力。因此, 蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化着的整体, 只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究, 即开展蛋白质组学研究, 才能更加贴近对生命现象和本质的掌握, 生命活动的本质和活动规律才能找到答案[ 1]。 1 生物信息学、蛋白质组学的相关概念 1.1 生物信息学生物信息学(Bioinformatics)是随着人类基因组计划的启动而兴起的一门新的交叉学科,由林华安博士在1987年首次提出的。生物信息学是在生命科学、计算机科学和数学的基础上逐步发展而形成的一门新兴交叉学科, 是以理解各种数据的生物学意义为目的,运用数学与计算机科学手段进行生物信息的收集、加工、存储、传播、分析与解析的科学[2]。生物信息学在基因组学和蛋白质组学的研究中起到了特殊的重要作用,因为基因组和蛋白质组研究提供的数据的数量之巨大在生物学史上是史无前例的。而且, 蛋白质组比基因组具有更大的复杂性, 因而蛋白质组信息学更有挑战性。 1.2 蛋白质组学蛋白质组(proteome)一词,源于蛋白质(protein)与基因组( genome) 两个词的结合,最早由澳大利亚学者Wilkins和Willian 等人1994年提出,是指基因组所表达的全部蛋白质。它与基因组相对应,也是一个整体的概念。从这个定义上来看,蛋白质组内蛋白质的数目应该等于基因组内编码蛋白质的基因( 准确地说应为开放阅读框,ORF)的数目,但在生物体内这样的蛋白质组是不存在的[3]。 蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别,它随着组织、甚至环境状态的不同而改变。蛋白质组具有复杂多变的特点,蛋白质的种类数量即使在同一生物体相同细胞中在不同时期和环境下也是不同的。故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物,蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目。蛋白质组学是研究蛋白质组及大范围蛋白质的分离、分析、应用的学科。它不同于传统的单个蛋白质或某一类蛋白质研究, 研究体系内全部的蛋白质及其动态变化规律，蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战,蛋白质间相互作用的研究也已被纳入蛋白质组学的研究范畴[4]。 2 生物信息学在蛋白质组学上的应用 目前对蛋白质组研究的技术手段很多,常用的主要有双向凝胶电泳和测序质