分子生态学课程小论文

分子生态学

课程小论文

题目：DNA-SIP技术及其应用学生姓名：张家明

指导教师：贺治国教授

学院：资源加工与生物工程学

院

专业班级：生物系研究生15级

2016年6月

摘要

稳定性同位素核酸探针技术DNA-SIP( Stable isotope probing)，是采用稳定性同位

素示踪复杂环境中微生物基因组DNA 的分子生态学技术，是将复杂环境中微生物物种组成及其生理功能耦合分析的有力工具。自然环境中微生物群落生理过程的发生、发展，其新陈代谢物质在环境中累积与消减的动力学变化规律，形成了微生物生理生态过程，决定了生态系统物质和能量的良性循环。利用稳定性同位素示踪复杂环境中微生物基因组DNA，实现了单一微生物生理过程研究向微生物群落生理生态研究的转变，能在更

高更复杂的整体水平上定向发掘重要微生物资源，推动微生物生理生态学和生物技术开发应用。

关键词：同位素DNA分子探针分子生态学环境微生物

一、DNA-SIP 技术原理

DNA-SIP 技术的基本原理与DNA 半保留复制实验类似，主要区别在于后者以纯菌为研究对象，证明子代DNA 源于父代DNA，而前者主要针对微生物群落，揭示复杂环境中参与标记底物代谢过程的微生物作用者。一般而言，重同位素或轻同位素组成的化合物具有相同的物理化学和生物学特性，因此，微生物可利用稳定性重同位素生长繁殖。由于合成代谢是所有生命的基本特征之一，碳氮是生命的基本元素，采用稳定性同位素如13C-标记底物培养环境样品，利用标记底物的环境微生物细胞不断分裂、生长、繁殖并合成13C-DNA，提取环境微生物基因组总DNA并通过超高速密度梯度离心将13 C-DNA 与12C-DNA分离后，进一步采用分子生物学技术分析13C-DNA，将能揭示复杂环境样品中同化了标记底物的微生物作用者，将特定的物质代谢过程与复杂的环境微生物群落物种组成直接耦合，在微生物群落水平，以13C-物质代谢过程为导向，发掘重要功能基因，揭示复杂环境中微生物重要生理代谢过程的分子机制。

DNA-SIP 的技术核心是超高速密度梯度离心分离稳定性同位素标记和非标记DNA。根据我们的经验，氯化铯介质中超高速离心后2个相邻梯度区带的浮力密度差为0. 004 ~0. 006 g /mL。理论上，浮力密度差大于0. 012 g /mL的两种DNA 离心后相隔一个区带，能被有效分离。因此，影响DNA 浮力密度的两个因素是DNA-SIP技术的关键: (1) DNA 被稳定性重同位素标记的程度；(2) 微生物基因组GC含量。一般情况下，环境样品中

的目标微生物很难被重同位素100% 标记。因此，DNA-SIP实验必须设计一个非标记底物处理的对照实验，提高实验可信度。最近有研究者根据双苯酰亚胺与DNA嵌合，改变其浮力密度并提高DNA分离精度的原理，首先通过超高速密度梯度离心从环境微生物基因组总DNA中分离获得重浮力密度DNA，进一步将其与双苯酰亚胺混合后进行二次离心，可有效去除重浮力密度梯度区带中高GC含量的非标记DNA污染，获得高质量15N-DNA。

二、DNA-SIP技术要点

DNA-SIP 包括4个主要步骤：标记底物培养环境样品；环境微生物基因组总DNA 超高速密度梯度离心；不同浮力密度梯度区带中13 C-DNA 的富集程度鉴定；13C-DNA 的下游分析。以土壤苯酚和二氯苯酚降解过程为例，DNA-SIP 的具体技术路线如图所示，采13C-苯酚或二氯苯酚培养土壤，土壤中某些特定的、未知的微生物会利用标记底物生长并合成13C-DNA；提取土壤微生物基因组总DNA，包括能分解苯酚或二氯苯酚微生物的13C-DNA和没有利用13C的微生物12C-DNA，超高速离心后形成氯化铯密度梯度区带，获得由轻到重不同浮力密度DNA采用单链构象多态性分析SSCP、分子指纹图谱、荧光实时定量PCR 等技术分析不同浮力密度DNA 的微生物物种组成和数量，特别是比较13C-苯酚或二氯苯酚处理与12C-苯酚或二氯苯酚处理的重浮力密度DNA，即可根据微生物群落结构的差异，明确鉴定13C-DNA 在重浮力密度DNA 中的富集程度；进一步对13 C-DNA 开展针对性的分子分析，揭示参与标记底物代谢过程的微生物群落。

单链构象多态性分析SSCP原理：单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立

体结构主要是由于其内部碱基配对、氢键等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中所受阻力大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。主要方法为：对梯度离心得到的各个密度梯度层的DNA进行PCR扩增，即对于细菌使用COM1和COM2引物扩增16s rDNA，对于真菌使用NSI1和58A2R引物扩增18S-ITS1-5.8S rDNA。对其中的反向引物进行磷酸化。扩增之后，加入λ-核酸外切酶，使DNA成为单链，之后进行PCR。

由于实验所提供的环境不一定是样品中功能微生物生存的最佳条件，因此会影响功能微生物的繁殖和细胞分裂，从而使合成的DNA 减少，不能达到成功密度梯度分离同位素标记DNA 的要求。对此，通常有以下几个解决办法：(1) 增加同位素标记底物的浓度。如：利用全标记的13C 化合物作为基质加入培养环境样品。如果标记化合物为环境样品中微生物的唯一碳源，细胞每分裂一次DNA 中含13C 的部分会增加50%，细胞分裂的次数越多，DNA 中13C所占的比例越大，密度梯度离心分离重轻DNA 的可能性也越大。但是此种方法会产生一种副作用——富集偏差，即不能反映自然状态下目标污染物的代谢途径。研究表明，SIP实验中，环境样品中13C的浓度为50umol/g (土壤或沉积物)，5umol/L(水溶液)就可以将同位素标记DNA从背景中分离出来。(2) 延长SIP 实验的培养时间。延长培养时间虽然可以增加DNA中13C 的含量，但是有可能出现交叉喂食的情况。(3) 向CsCl 梯度溶液中加入合成或者天然13C 载体DNA (酵母菌或者古菌)，增加13C标记DNA 检测的灵敏度。Callagher等通过向CsCl 梯度溶液中加入13C 载体古菌DNA，在较短的时间内检测到了13C 标记的目的基因。

三、DNA-SIP 技术应用

2000年英国J.Colin Murrell 教授实验室采用13C-甲醇培养森林土壤，成功获得13C-DNA，发现甲基营养微生物以及酸性细菌具有同化甲醇的能力，开拓了稳定性同位素示踪环境微生物基因组DNA 的研究领域。过去10年来，DNA-SIP 技术在微生物生态学和生物技术领域得到广泛关注和应用，是耦合微生物遗传多样性与代谢多样性最有力的工具之一。

针对我国华北平原典型潮土，采用DNA-SIP 技术培养河南封丘农田土壤，提取土壤微生物基因组总DNA 并超高速离心获得不同浮力密度DNA。利用16S rRNA 基因通