共聚焦原理和样品制备技术
共聚焦显微镜实验报告
一、实验目的1. 熟悉共聚焦显微镜的基本原理和操作方法。
2. 利用共聚焦显微镜观察细胞结构、细胞器和细胞内分子的分布情况。
3. 掌握共聚焦显微镜在生物学研究中的应用。
二、实验原理共聚焦显微镜（Confocal Microscopy）是一种利用激光光源、共聚焦光学系统和计算机图像处理技术进行细胞和组织结构观察的显微镜。
其基本原理是利用激光光源在样品上形成点光源，通过物镜聚焦到样品的焦平面上，激发荧光物质发出荧光。
由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，只有焦平面上的光才能通过探测针孔，从而实现对焦平面的荧光信号采集，同时抑制了背景光的干扰。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：细胞样品（如酵母细胞、植物细胞等）、荧光染料（如DAPI、FITC 等）、荧光标记抗体等。
2. 实验仪器：共聚焦显微镜、激光光源、物镜、扫描模块、探测器、计算机等。
四、实验步骤1. 样品制备：将细胞样品固定、染色，并进行适当处理，使其适合共聚焦显微镜观察。
2. 设定共聚焦显微镜参数：包括激光光源的波长、扫描速度、扫描范围等。
3. 观察细胞结构：使用共聚焦显微镜观察细胞的结构，如细胞核、细胞质、细胞器等。
4. 观察细胞器：使用荧光染料和荧光标记抗体对细胞器进行染色，观察其分布和形态。
5. 观察细胞内分子：使用荧光标记抗体对细胞内分子进行染色，观察其分布和动态变化。
6. 图像采集与处理：使用共聚焦显微镜采集图像，并通过计算机图像处理技术进行图像分析和三维重建。
五、实验结果与分析1. 观察到细胞核、细胞质、细胞器等细胞结构清晰可见，荧光染料和荧光标记抗体在细胞内分布均匀。
2. 观察到线粒体、内质网、高尔基体等细胞器在细胞内的分布和形态，为细胞器功能研究提供依据。
3. 观察到细胞内分子在细胞内的分布和动态变化，为细胞信号传导和分子调控研究提供线索。
六、实验讨论1. 共聚焦显微镜具有较高的分辨率和信噪比，能够观察细胞内部精细结构，为生物学研究提供有力工具。
共聚焦激光显微镜原理
共聚焦激光显微镜原理共聚焦激光显微镜是一种高分辨率的显微技术，它利用激光光束对样品进行扫描，通过聚焦和探测来获取高分辨率的图像。
下面将详细介绍共聚焦激光显微镜的原理。
1. 激光扫描共聚焦激光显微镜使用一个激光束对样品进行扫描。
这个激光束可以是单色或多色的，并且可以调节其波长和功率。
在扫描过程中，激光束会被反射、散射或吸收，从而产生不同的信号。
2. 共聚焦共聚焦是指将激光束聚焦到一个非常小的点上，通常在几百纳米以下。
这个点称为焦点，在这个点上产生了强烈的电磁场，可以使样品中的荧光物质发出荧光信号。
同时，在这个点周围也会有一定程度的荧光信号。
3. 探测探测是指检测样品中发出的荧光信号，并将其转换成电子信号。
探测器通常使用光电倍增管或者CCD相机，可以捕捉到非常微弱的荧光信号。
4. 三维成像共聚焦激光显微镜可以进行三维成像。
通过改变激光束的焦距，可以在样品中扫描不同深度的区域。
这样就可以获得样品的三维结构信息。
5. 高分辨率共聚焦激光显微镜具有非常高的分辨率。
由于激光束被聚焦到一个非常小的点上，因此可以获得非常高的空间分辨率。
同时，由于只有在焦点处才会产生荧光信号，因此也可以获得非常高的时间分辨率。
6. 应用共聚焦激光显微镜广泛应用于生物医学研究领域。
它可以用于观察细胞、组织和器官中的结构和功能，并且还可以用于研究生物大分子如蛋白质、核酸等的结构和功能。
总之，共聚焦激光显微镜是一种高分辨率、非侵入性、三维成像技术，在生物医学研究领域具有广泛的应用前景。
共聚焦原理及操作
一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。
Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA 不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。
Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。
后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。
并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。
因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。
Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+ 的浓度。
但优于Fura-2/AM的是，Fluo-3与Ca2+ 结合时的荧光强度较未结合Ca2+ 的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。
此外，Fluo-3与Ca2+ 亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+ 的快速、微量变化。
Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。
共聚焦显微镜原理
共聚焦显微镜原理
共聚焦显微镜是一种高分辨率显微镜，它利用共聚焦原理观察样品的表面形貌和结构。
共聚焦显微镜具有高分辨率、高对比度和三维表面重建的优点，因此在材料科学、生物医学和纳米技术等领域得到了广泛的应用。
首先，共聚焦显微镜的工作原理是基于共焦原理。
共焦原理是指在焦平面上同时聚焦激光束和检测信号，通过这种方式可以获得高分辨率的图像。
共聚焦显微镜利用激光光源照射在样品表面，样品表面反射的光信号被激光束收集，然后经过光学系统聚焦到探测器上，最终形成样品的高分辨率图像。
其次，共聚焦显微镜的成像原理是通过探测器接收样品表面反射的光信号，并将这些信号转换成电信号。
然后通过信号处理系统对这些电信号进行处理，最终形成样品的图像。
共聚焦显微镜的成像原理保证了其在观察样品表面形貌和结构时具有高分辨率和高对比度的特点。
另外，共聚焦显微镜在成像过程中还可以实现三维表面重建。
通过对样品表面反射的光信号进行处理，可以获取样品表面的高度信息，从而实现对样品表面的三维重建。
这种特点使得共聚焦显微镜在观察微纳米结构和纳米材料时具有独特的优势。
总的来说，共聚焦显微镜是一种基于共焦原理的高分辨率显微镜，其工作原理是利用激光束和检测信号在焦平面上同时聚焦，成像原理是通过探测器接收样品表面反射的光信号，并将这些信号转换成电信号，最终形成样品的图像。
共聚焦显微镜在观察样品表面形貌和结构时具有高分辨率、高对比度和三维表面重建的优点，因此在材料科学、生物医学和纳米技术等领域得到了广泛的应用。
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。
1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。
2 ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
扫描共聚焦显微镜原理
扫描共聚焦显微镜原理一、引言扫描共聚焦显微镜（Scanning Confocal Microscope，SCM）是一种先进的显微成像技术，它在生物学、医学、材料科学等领域有着广泛的应用。
与传统的显微镜相比，扫描共聚焦显微镜具有更高的分辨率和更好的成像质量。
本文将重点介绍扫描共聚焦显微镜的工作原理。
二、扫描共聚焦显微镜的工作原理扫描共聚焦显微镜的基本原理是通过逐点扫描样品，并对每个像素点的荧光信号进行检测和记录，从而获得高分辨率的图像。
以下是扫描共聚焦显微镜的工作原理：1.逐点扫描：扫描共聚焦显微镜使用快速振镜或声光器件等扫描装置，对样品进行逐点扫描。
在每个像素点上，激光束聚焦在样品上，激发荧光。
2.激发荧光：当激光束照射到样品上时，会激发荧光。
这些荧光信号是样品特性的反映，可以用于成像。
3.检测荧光信号：在每个像素点上，荧光信号被检测器收集并转换为电信号。
这个过程是在焦平面上完成的，因此每个像素点都有良好的焦深。
4.记录图像：电信号被记录并转换为数字信号，然后通过计算机进行图像处理和显示。
由于每个像素点的荧光信号都被独立记录，因此最终获得的图像具有高分辨率和高对比度。
5.图像重建：通过将所有像素点的图像信息组合起来，可以重建出整个样品的图像。
这个过程可以通过计算机软件实现。
三、扫描共聚焦显微镜的特点和优势扫描共聚焦显微镜具有以下特点和优势：1.高分辨率：由于逐点扫描和独立检测每个像素点的荧光信号，扫描共聚焦显微镜可以获得高分辨率的图像，远高于传统的显微镜。
2.更好的焦深：由于在焦平面上进行检测，每个像素点都有良好的焦深，使得获得的图像具有更好的立体感。
3.减少杂散光干扰：通过只检测焦平面的荧光信号，扫描共聚焦显微镜有效地减少了杂散光干扰，提高了图像的对比度。
4.定量分析：由于每个像素点的荧光信号都可以独立记录，因此可以对样品进行定量分析，如测量荧光强度、测量荧光光谱等。
5.适合各种样品：扫描共聚焦显微镜适用于各种样品，如生物切片、细胞培养物、组织样本等。
激光共聚焦显微镜样品制备
激光共聚焦显微镜样品制备激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率、高对比度的显微镜。
它采用了激光光源和共聚合焦系统，可以获得非常清晰的三维显微图像。
这种显微镜主要应用于生物学、药学和材料科学等领域，并且被广泛用于细胞和组织病理学研究，以及纳米材料表征等方面。
首先，样品制备的第一步通常是固定。
固定是指将样品中的细胞或组织固定在特定的位置和形态上，使其保持原有的结构和功能。
最常用的细胞固定方法是使用乙醛或甲醛进行化学固定。
这些化学试剂可以使细胞中的蛋白质交联并固定，保持细胞的形态和结构。
对于组织样本，常用的固定方法是将其浸泡在缓冲福尔马林中，然后进行脱水和浸渍。
然后，经过固定的样品通常需要进行处理和染色。
处理包括去除不需要的物质，如脂肪和胆固醇等。
通常使用洗涤剂，如Tween 20或Triton X-100来帮助去除这些物质。
染色是为了增强对细胞或组织的观察，通常使用DNA染料，如荧光素和硫醇葡萄糖等。
这些染料可以与DNA结合，形成荧光信号，从而使细胞核和染色体能够清晰可见。
接下来，样品需要进行脱水和包埋。
脱水是为了将样品中的水分逐渐去除，从而使其适应显微镜对环境要求。
这通常通过逐渐加入浓度递增的乙醇溶液来实现。
包埋是将样品固定在透明块中，以便于显微观察。
常用的包埋介质有琼脂和覆盖玻璃等。
总结起来，激光共聚焦显微镜样品制备是一项复杂的工作。
它需要对样品进行固定、处理、染色、脱水、包埋等一系列步骤，以便获得高质量的成像结果。
正确选择和操作样品制备方法是确保显微镜成像质量和结果准确性的关键。
因此，在进行激光共聚焦显微镜样品制备时，科研人员和实验室人员应该仔细参考上述步骤和技巧，以获得理想的实验结果。
激光共聚焦样品制备步骤
激光共聚焦使用步骤总结共聚焦实验步骤1.提前将PBS放在37度水浴锅中。
2.将小皿从细胞培养箱中取出，弃掉培养液，用PBS洗2——3次，轻晃几下即可。
注，此步加PBS时一定要轻一点，否则细胞会漂浮起来。
3.弃掉PBS后加1ml 4%多聚甲醛，固定细胞，室温静置30min。
4.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。
5.弃掉后加0.1%Triton-X100 1ml，室温透膜静置15min。
6.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。
7. 5%PBS脱脂乳，封闭1h，可在摇床上轻晃，也可以室温静置。
8.一抗1h，可在摇床上轻晃。
9. PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃10.二抗1h。
避光可在摇床上轻晃11. PBS，1ml，3次，5min/次避光，可在摇床上轻晃12.DAPI染色15min避光，室温静置13. PBS，1ml，3次，5min/次，避光，可在摇床上轻晃14.激光共聚焦显微镜观察。
激光共聚焦显微镜使用步骤1.打开五个绿色按钮和一个钥匙2.将物镜调至最低点。
3.电脑开启，选择TCS_User4.双击LAS AF 注意，双击软件后就耐心等待不要碰显微镜上任何东西，此时系统正在校准数据。
5.点击OK6.选择configuration7.点击像“注射器”一样的图案Laser，此时后便会出现一个画面，四个小格405 Diode，Ardon，HeNe543，HeNe633和一个尺子一样的长线Stand by。
8.点击选择前三个小格405 Diode，Ardon，HeNe543，将Stand by拉到45左右。
9.选择Acquire10.先确定右侧区域油镜型号是Objective：63×1.4，如果不是点击下拉菜单选择。
11.选择seq，最下面会弹出Sequential Scan区域，该区域作用是根据自己实验需求选择相应激光通道，其中“＋”代表增加激光通道，“－”代表删除激光通道。
激光共聚焦样品制备步骤
激光共聚焦样品制备步骤激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy，简称LSM）是一种高分辨率的光学显微技术，广泛应用于细胞和组织的研究领域。
在进行激光共聚焦样品制备之前，需要确保实验环境干净整洁，仪器设备正常运行。
下面是激光共聚焦样品制备的一般步骤。
1.样品准备：选择合适的细胞或组织样品。
可以使用活体细胞、培养细胞、切片等多种样品。
样品应该具备较好的生物活性和显微结构。
2.样品固定：为了保持样品的形态和结构，需要进行样品的固定处理。
根据不同的样品类型和研究目的，可以选择适合的固定方法，如甲醛、乙醇、冰醋酸、戊醛等。
3.渗透处理：有些样品在固定后会出现浸泡不透的情况，需要进行渗透处理，使固定液更好地渗透进入样品中。
常用的渗透处理方法有冷冻冰醋酸渗透、冷冻减压渗透、甘油渗透等。
4.包埋：将处理好的样品包埋到透明的固定剂中，以保持形态和结构。
常用的包埋材料有琼脂糖、明胶、聚乙二醇、树脂等。
包埋时要注意使样品均匀分布在包埋剂中，以免出现偏移或扭曲。
5.切片：将包埋好的样品切割成适当的厚度，通常为几十微米至几百微米。
切片的方法有冰刀切片、冷冻切片、石蜡切片等。
切片时需保持样品的完整性和结构。
6.平片处理：将切好的样品平片放在载玻片上，用适当的方法将其固定在玻片上。
常用的固定方法有热熔、冷冻、电荷吸附等。
固定后要确保样品牢固地固定在玻片上并保持平坦。
7.染色：根据需要，可以对样品进行染色增强显微镜观察的效果。
常用的染色方法有荧光染色、荧光蛋白标记、核酸染色等。
8.抗体处理：对于需要检测其中一种特定蛋白质的样品，可以使用特异性抗体进行处理，以增强该蛋白质的信号。
9.清洗：处理完样品后，要对样品进行适当的清洗，去除余留的固定剂、染色剂等。
10.封片：将处理好的样品加入封片介质，如卡宾胶、密封剂等，以减少光透射损失和防止样品变干。
11.显微镜观察：将制备好的样品放入激光共聚焦显微镜中，调整焦距和曝光时间，进行观察和拍摄。
激光共聚焦显微镜样品制备方法_一_细胞培养样品
第29卷第2期2010年4月电子显微学报Journal of Chinese Electron Microscopy SocietyVol-29，No.22010-04文章编号：1000-6281（2010）02-0185-04激光共聚焦显微镜样品制备方法（一）———细胞培养样品余礼厚（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海200031）摘要：随着激光共聚焦显微镜在生物学研究中的广泛应用，绿色荧光融合蛋白能够提供蛋白质在细胞体内的精确时空信息。
因此免疫荧光样品的制备也成为基本的细胞生物学实验方法。
本文主要介绍在培养细胞中表达绿色荧光融合蛋白及免疫荧光样品的制备过程。
关键词：绿色荧光蛋白；细胞培养；免疫荧光；激光共聚焦显微镜中图分类号：Q336文献标识码：A收稿日期：2010-03-20作者简介：余礼厚（1982－），男（汉族），四川自贡人，博士，E-mail ：lhyu@.随着生物学研究的不断深入，越来越多的研究要求在细胞体内（in vivo ），甚至是动物体水平上研究蛋白质功能或动态变化。
而随着检测设备的提升、各种显微技术的发展和标记手段的提高，使得研究者能够迅速、准确地观察到蛋白质在细胞内的表达情况和定位。
通过激光共聚焦显微镜观察荧光标记细胞内的蛋白质和分子，为生物学的研究提供了更直观的观测手段。
因此免疫荧光样品的制备也成为生物学研究中的基本技术方法。
鉴于生物体内的复杂多样性，制备免疫荧光样品的方法也存在一些差异。
本文主要介绍构建绿色荧光融合蛋白表达载体，并在培养细胞中表达绿色荧光融合蛋白及免疫荧光样品的制备过程。
1绿色荧光融合蛋白表达载体的构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP ）及其突变体能在各种不同的生物系统中表达，这对细胞生物学的研究具有重要意义［1］。
而荧光蛋白的折叠能力及其同细胞内蛋白的融合能力，使研究者能直接在细胞体内观察到蛋白质的特性。
激光共聚焦显微镜样品制备方法_二_组织切片样品_边玮
第29卷第4期2010年8月电子显微学报Journal of Chinese Electron Microscopy SocietyVol.29，No.42010-08文章编号：1000-6281（2010）04-0399-04激光共聚焦显微镜样品制备方法（二）———组织切片样品边玮（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海200031）摘要：应用激光共聚焦显微镜技术对荧光标记的组织切片样品进行三维观察成像是生物学研究的常规手段。
本文主要介绍实验室制备用于激光共聚焦显微镜成像的冷冻组织切片及免疫荧光标记过程。
关键词：冷冻组织切片；免疫荧光；激光共聚焦显微镜成像中图分类号：Q336；TG115.21+5.3文献标识码：A收稿日期：2010-05-07作者简介：边玮（1964－），女（汉族），吉林蛟河人，高级工程师.E-mail ：weibian@.应用于激光共聚焦显微镜的组织切片样品多采用冷冻组织切片，可尽量保持组织样品的抗原活性。
组织采集后，经固定、冷冻包埋、冷冻切片、晾片，进行免疫荧光抗体标记。
1组织的采集、固定和保存不同来源的组织可依据实验条件和实验目的而采用不同的固定和保存方法。
实验室通常采用液氮冷冻法和多聚甲醛（PFA ）固定法。
液氮冷冻法：采取新鲜组织后，即可放入液氮中保存。
多聚甲醛固定法：小鼠、大鼠等实验动物经生理盐水和4%PFA 灌流，采取组织，组织块尽量小于1cm ˑ1cm ˑ1cm ，置于4%PFA 中进行后固定，后固定的时间可根据组织块的大小和致密程度而调整，可以4ħ固定过夜，或室温1 4h 。
之后，用0.01mol /L PBS 缓冲液洗3次，每次10 30min 。
在20%蔗糖中4ħ浸泡1h 以上，待组织块下沉后，即可进行冷冻切片。
组织块可置于4ħ冰箱保存于20%蔗糖（含0.05%NaN 3）中，一个月内完成切片。
表达荧光蛋白的实验动物组织，可遵循以上方法处理样品。
免疫荧光共聚焦步骤
免疫荧光共聚焦步骤
免疫荧光共聚焦（IF-C）是一种用于研究细胞和组织中蛋白质
分布和相互作用的强大技术。
IF-C步骤包括以下几个关键步骤：
1. 样品制备，首先，需要准备样品。
这可能涉及固定和包埋细
胞或组织样品，以保持其形态和蛋白质结构。
2. 抗体染色，接下来，样品需要被染色以显示感兴趣的蛋白质。
这涉及使用特异性的一抗体结合到目标蛋白质上。
3. 第二抗体染色，随后，样品需要与荧光标记的第二抗体结合。
这种抗体通常与一抗体的宿主物种相对应，以确保其特异性。
4. 共聚焦显微镜成像，最后，使用共聚焦显微镜进行成像。
共
聚焦显微镜利用激光来激发荧光标记，同时消除样品其他平面的信号，从而获得清晰的三维图像。
在进行IF-C实验时，还需要进行负对照和阳性对照来确保结果
的准确性。
此外，对于不同类型的样品，可能需要针对特定步骤进
行一些调整，以获得最佳的结果。
总的来说，免疫荧光共聚焦是一种复杂而强大的技术，可以提
供关于蛋白质定位和相互作用的详细信息。
通过严格遵循上述步骤，并结合适当的对照实验，可以确保获得可靠和准确的结果。
激光共聚焦原理
激光共聚焦原理
激光共聚焦（Laser scanning confocal microscopy）是一种高分辨率的三维显微技术，可以用于观察不同物质的细胞组织或材料的内部结构。
其工作原理包括以下几个步骤：
1. 激光器：首先，使用激光器产生单一波长的激光，并通过一系列光学元件使光束聚焦到一个非常小的点上。
这个点称为焦斑或焦点。
2. 物镜和样品：通过使用物镜将激光束聚焦在样品的表面上。
样品可以是生物组织、细胞或材料表面。
3. 反射镜和偏振镜：样品表面反射的光经过一个反射镜和一个偏振镜，以排除非焦点位置的散射光。
4. 光阑和光学扫描：样品反射的光通过一个光阑进一步排除非焦点位置的散射光，并通过一个光学扫描系统将焦点点在样品上扫描。
5. 探测器和图像处理：通过一个探测器收集激光扫描过程中样品反射的光，并将其转化为电信号。
这些信号经过图像处理，可以得到高分辨率的三维图像。
激光共聚焦显微镜可以消除样品深度方向的散射光，从而提高分辨率和对比度。
由于共聚焦的特性，它可以仅获得焦平面上
的样品信息，而不会受到其他位置的影响。
这使得激光共聚焦成为一种强大的显微镜技术，用于研究生物组织结构和功能、细胞内的动态进程以及材料的表面形貌等。
激光共聚焦样品制备步骤
激光共聚焦使用步骤总结共聚焦实验步骤1.提前将PBS放在37度水浴锅中。
2.将小皿从细胞培养箱中取出，弃掉培养液，用PBS洗2——3次，轻晃几下即可。
注，此步加PBS时一定要轻一点，否则细胞会漂浮起来。
3.弃掉PBS后加1ml 4%多聚甲醛，固定细胞，室温静置30min。
4.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。
5.弃掉后加0.1%Triton-X100 1ml，室温透膜静置15min。
6.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。
7. 5%PBS脱脂乳，封闭1h，可在摇床上轻晃，也可以室温静置。
8.一抗1h，可在摇床上轻晃。
9. PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃10.二抗1h。
避光可在摇床上轻晃11. PBS，1ml，3次，5min/次避光，可在摇床上轻晃12.DAPI染色15min避光，室温静置13. PBS，1ml，3次，5min/次，避光，可在摇床上轻晃14.激光共聚焦显微镜观察。
激光共聚焦显微镜使用步骤1.打开五个绿色按钮和一个钥匙2.将物镜调至最低点。
3.电脑开启，选择TCS_User4.双击LAS AF 注意，双击软件后就耐心等待不要碰显微镜上任何东西，此时系统正在校准数据。
5.点击OK6.选择configuration7.点击像“注射器”一样的图案Laser，此时后便会出现一个画面，四个小格405 Diode，Ardon，HeNe543，HeNe633和一个尺子一样的长线Stand by。
8.点击选择前三个小格405 Diode，Ardon，HeNe543，将Stand by拉到45左右。
9.选择Acquire10.先确定右侧区域油镜型号是Objective：63×1.4，如果不是点击下拉菜单选择。
11.选择seq，最下面会弹出Sequential Scan区域，该区域作用是根据自己实验需求选择相应激光通道，其中“＋”代表增加激光通道，“－”代表删除激光通道。
激光共聚焦显微镜样品制备方法讲解
电子显微学报J.Chin.Eleetr.Microse.Soc.第29卷图I气体CO:冷冻装置。
Fig.1Gas C02frozen equipment.镜下操作后,置于干冰上(临时无干冰,也可置于一80℃冰箱,待冷冻完全后,将样品移至冷冻切片机中,温度平衡后,将样品从冷冻包埋模具中取出,进行冷冻切片。
冷冻包埋模具见图2。
图2冷冻包埋模具。
Fig.2Frozen embedding mold.液氮冷冻法:成年小鼠和大鼠的脑及稍大一些的组织块也可采用此方法冷冻。
将组织块置于样品台的OCT中,为防止组织块爆裂,先在液氮中迅速浸提几次,时间从1s开始逐渐增加,直至样品温度与液氮温度平衡,之后移至冷冻切片机中,使温度与切片机箱体温度一致,进行冷冻切片。
直接冷冻法:将样品直接粘着在涂有OCT的样品台上,于冷冻切片机(箱体温度在一20℃以下中直接冷冻。
3冷冻组织切片的免疫荧光标记将冷冻组织切片从一80℃冰箱中取出,室温放置10min,待切片回温并干燥,浸于PBS中10min 洗去OCT,可以无需Triton处理,即可进行免疫荧光抗体标记,操作步骤与培养细胞反应方法相同口]。
反应在避光湿盒中进行,反应结束时用无荧光封固剂封片,4oC保存。
先用荧光显微镜观察,确认标记成功,移至激光共聚焦显微镜扫描成像。
4荧光染料及荧光蛋白传统应用于荧光标记的染料如异硫氰酸荧光素(fluoreseinisothiocyanate,FITC,ex490nm/em520 nm、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC,ex550nm//em 620am、罗丹明(Rhodamine,ex560nm/em540~ 660nnl、四甲基罗丹明(tetramethyl rhodamine, TMR,ex570nm/em595—600nm、德克萨斯红(Texas red,ex592nm/em610rim、氨甲基香豆素(Aminomethylcoumarin aceticacid,AMCA,ex345 nm/em425am等,结合激光共聚焦显微镜技术的发展,这些经典的荧光染料逐渐被层出不穷的新的荧光染料所替代。
激光共聚焦制样
非损伤性导入法：在正常的生理条件下加入Ca2+荧光探针与植物细胞共同孵育, 使探针渗入到细胞内的方法。
在培养液中加人荧光探针和增强膜透性的药物, 如去垢剂digitonin(毛地黄甘)、表面活性剂Pluronic F-127等, 药物使细胞膜通透性增强, 利于荧光探针的导入【1】。
周平等发现：在PH5.6条件下，绿豆、花生、水稻、烟草等细胞原生质体用5~10um ol/L Indo-1-K+或Fura-2-AM共同孵育1.5h,荧光探针可导入部分原生质体【2】。
样品的制备1：样品制备是上机检测前的关键步骤。
样品需经荧光探剂标记( 单标、双标、三标) 。
标本可以是固定的或活的组织, 也可以是固定的或活的贴壁培养, 细胞应培养在Confocal 专用小培养皿或盖玻片上, 悬浮细胞, 甩片或滴片后, 用盖玻片封片。
样品的最大厚度约1~ 2 mm, 使用的盖玻片厚度应小于0117mm, 载玻片厚度应在018~ 112 mm 之间, 而且表面光洁, 厚度均匀, 没有明显的干扰荧光。
固定样品常用封片剂进行封片,常用PH815- 9 的PBS 配制的甘油封片。
样品准备2：样品的最大厚度大约1~2mm(10×/ 0.4 物镜), 它取决于物镜的数值孔径(NA) 、物镜的工作距离、激光的穿透力以及样品的透明度。
一般要求是单层贴壁细胞, 可以是经荧光探针标记(单标、双标、三标)固定的或活的组织; 固定的或活的贴壁培养细胞(Confocal 专用小培养皿, 盖玻片); 用盖玻片封片的经甩片或滴片后的悬浮细胞。
对于非贴壁细胞的粘贴, 一般常用的粘贴剂有多聚赖氨酸﹑伴刀豆球蛋白﹑cell- tak﹑vectabond﹑琼脂凝胶等。
选择粘贴剂的标准是: 不影响实验目的, 对标本无损害[1]。
激光扫描共聚焦显微镜的样品制备技术3：3.1 取材组织标本：包括活检标本、手术切除标本、动物模型标本及尸检解剖标本等，应在标本离体后立即冰冻切片或贮存于-70℃冰箱备用，以充分保存组织的抗原性。
共聚焦制片方法
共聚焦制片方法共聚焦制片方法是一种在生物学和医学领域中广泛使用的技术，主要用于制作高分辨率、三维的样品图像。
其基本原理是利用激光束扫描样品，同时收集每个点的荧光信号，并通过对这些信号的精确分析，生成样品的三维图像。
下面将详细介绍共聚焦制片方法的基本原理、操作步骤和优缺点。
一、基本原理共聚焦制片方法基于共聚焦显微镜的原理，通过将激光束聚焦在样品上的某一特定点，激发该点的荧光。
然后收集该点的荧光信号，并将其传递给光电倍增管（PMT）进行检测。
由于激光束的聚焦点非常小，因此可以获得高分辨率的图像。
同时，通过对样品进行扫描，可以得到整个样品的图像。
二、操作步骤1.样品准备：选择适当的固定剂和染料，将样品固定在载玻片上，并进行染色。
2.扫描步骤：将样品放置在共聚焦显微镜下，调整焦距和光源，启动扫描程序。
扫描过程中，激光束会逐点扫描样品，同时收集每个点的荧光信号。
3.图像重建：通过对收集到的荧光信号进行分析和处理，可以重建出样品的三维图像。
三、优缺点1.优点：共聚焦制片方法具有高分辨率、高灵敏度和高轴向分辨率等优点。
它能够清晰地呈现出样品的细节和结构，适用于各种不同类型的样品，如细胞、组织、蛋白质等。
此外，共聚焦制片方法还可以进行多通道检测和定量分析，为研究提供了更多的信息。
2.缺点：共聚焦制片方法也存在一些缺点。
首先，由于激光束的聚焦点很小，因此需要逐点扫描样品，这使得扫描速度较慢。
其次，由于需要使用激光束和光电倍增管等昂贵的设备，因此共聚焦制片方法的成本较高。
此外，操作共聚焦显微镜需要一定的专业技能和经验，这也增加了使用难度。
最后，由于样品需要经过固定和染色等处理，可能会对样品的结构和活性产生影响。
四、应用领域共聚焦制片方法在生物学、医学、材料科学等领域中得到了广泛应用。
例如，在生物学中可以用于研究细胞结构和功能；在医学中可以用于诊断和治疗各种疾病；在材料科学中可以用于研究材料的微观结构和性能。
此外，共聚焦制片方法还可以用于制备高质量的荧光图像，用于科学研究、临床诊断和工业生产等领域。
共聚焦原理及操作
一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。
Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA 不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。
Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。
后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。
并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。
因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。
Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+ 的浓度。
但优于Fura-2/AM的是，Fluo-3与Ca2+ 结合时的荧光强度较未结合Ca2+ 的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。
此外，Fluo-3与Ca2+ 亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+ 的快速、微量变化。
Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。
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淬灭现象
7
荧光探针的性质
染料分子对环境的敏感性 溶剂的极性 淬灭剂的浓度及其与染料的亲和性 水相的PH值
S1 Absorption
Heat
Emission
S0
5
Stokes' Law: fluorescence is always at longer wavelength
Absorption
Fluorescence
500
550
600
650
700
Wavelength (nm)
6
荧光探针的性质
激λ发ex波（长Stoλcemk和es)发，射根波据长λλeemx 和---λ--e-x--选---择λem激总光是和小滤于片 E=h*m/ λ
2 dichroics to separate F1 & F2
Fluor 2
400
500
600
700
800
Wavelength (nm)
20
Double label
Abs 1
Fluor 1
Cannot separate F1 & F2, => excite separately
Abs 2
Fluor 2
BP 490/20 505 BP 575/30 600
BP 525/20 CFP/YFP
BP 635/40
TEXAS RED/green
BP 560/40 595
DAPI/FITC/TEXAS RED BP 420/30 415
BP 645/75 C/Y/R
BP 465/20
UV/blue/green
27
常见的商品形式
³ Fluo-3, AM ester (purity: >95% )
10x100 μg $203.00
³ Fluo-3, AM ester (purity: >95% by HPLC)
1 mg
$175.00
³ Fluo-3, AM ester, 1 mM in dry DMSO (purity: >95% by HPLC) 1 ml $203.00
CY7 red
BP 710/75 750
BP 810/90
GFP-blue
BP 470/40 500
BP 525/50
FITC/rhodamine BP 490/15 500
BP 525/20
blue/green
BPቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ560/25 580
BP 605/30
blue
BP 500/20 515
BP 535/30
16
显微镜的荧光CUBES
Filter cube
A A4 D E4 H3 I3 K3 L5 M2 N2.1 N3 G/R
TX2 B/G/R
Excitation range
Exitation Dichroic Suppressi on
Filter cube
UV
BP 340-380 400
LP 425
15
Filter sets
Exciter: 61000v2x Dichroic 61000v2bs Emitter 61000v2m
Some very cunning things are possible with interference filters, such as this triple dichroic set, which excites & detects at 3 wavelengths.
8
Epi-fluorescence
DCLP 520
LP 550
Beyond the dichroic mirror is a barrier filter to ensure that any residual excitation light is blocked. It can also be used to separate the light from different fluorochromes.
Longer wavelength = lower energy
}Infrared 700 nm
}Visible } 400 nm
Ultraviolet Shorter wavelength = higher energy
4
Absorption / emission
Emission is lower energy = longer wavelength
There are several ways to protect against the effects of photobleaching:
D You can reduce the light intensity (although this will also reduce your fluorescence intensity).
blue
BP 470-490 510
LP 515
YFP
blue
BP 480/40 505
BP 527/30 RFP
green
BP 546/14 580
LP 590
CFP
green green
BP 515-560 580 BP 546/12 565
LP 590 BFP/GFP
BP 600/40
FITC/TEXAS RED blue/green
green
BP 546/12 560
BP 605/75
violet + blue
BP 436/20 455
BP 480/40
UV
BP 385/15 420
BP 460/20
blue
BP 485/20 510
BP 437/45
violet + blue
BP 436/12 445
BP 467/37
blue
D You can de-oxygenate your sample (O2 is the main reactant in photobleaching).
D You can use an anti-fade agent.
Linan 2004 .
26
荧光探针的使用
根据研究目的、研究方法、所用机器类 型选择合适的荧光探针种类和商品形式。
BP 500/20 515
BP 545/45
violet + blue
BP 436/8 445
BP 460/25
blue
BP 495/12
510 BP 535/35
green
BP 580/20
595 BP 630/55
17
Double label
Abs 1
Fluor 1
Abs 2
Fluor 2
400
Y3
UV
BP 360/40 400
BP 470/40 Y5
UV + violet
BP 355-425 455
LP 470
Y7
blue
BP 436/7 455
LP 470
GFP
violet + blue
BP 420-490 510
LP 515 FI/RH
blue
BP 450-490 510
LP 515
BP 480-490
9
Filter 的设置
10
Short Wave Pass Filter (SWP)
Transmission (%)
100
80
60 Passes short wavelength
40
20
Absorbs or reflects long wavelength
300
400
500
600
BP 495/15 510
BP 530/30
BP 570/20 590
BP 640/40
Excitation range Exitation Dichroic Suppressi on
CY3 green
BP545/30 565
BP 610/75
CY5 red
BP 620/60 660
BP 700/75
Wavelength
12
Bandpass Filter
Transmission (%)
100 80 60 40 20
300
Transmits only this “band”of wavelengths
FWHM
400
500
600
700
800
Wavelength
13
Filter sets
Exciter: D470/40x Dichroic 500DCLP Emitter: OG515LP
³ Fluo-3, AM ester (purity: >95% by HPLC)
20x50 ug $252.00
³ Fluo-3, pentaammonium salt
1 mg
$161.00
³ Fluo-3, pentasodium salt
1 mg
$161.00
28
荧光指示剂的主要种类
1、Protein Conjugates for Biological Detection 2、Nucleic Acid Detection 3、Peptide and Protein Detection, Analysis and Synthesis 4、Enzymes and Enzyme Substrates 5、Probes for Actin, Tubulin and Nucleotide-Binding Proteins 6、Probes for Organelles 7、Probes for Lipids and Membranes 8、Fluorescent Tracers of Cell Morphology and Fluid Flow 9、Assays for Cell Viability, Proliferation and Function 10、Probes for Endocytosis, Receptors and Ion Channels 11、Photoactivatable (Caged) Probes 12、Probes for Signal Transduction 13、Probes for Reactive Oxygen Species 14、Indicators for Ca(2+), Mg(2+), Zn(2+) and Other Metals 15、pH Indicators 16、Indicators for Na(+), K(+), Cl(-) and Other Anions 17、Probes for Membrane Potential