仪器分析第三章高效液相色谱分析
仪器分析第三章高效液相色谱分析ppt课件
2019/12/20
1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高压： HPLC采用高压输液设备, 150-350*105 Pa 高速： HPLC流速大增，分析速度极快，只需数分 钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小 时。 高效：化学键和固定相, >30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）
分析HPLC 目的
制备HPLC 目的
样品组成信息
纯品回收
通常研究大部分或全部样 通常只对一种或几种样品
§3-8 HPLC的应用
application of HPLC
1. 环境中有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：示差折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药 残留量进行分析。
2019/12/20
• 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
2019/12/20
§3-2 高效液相色谱法理论基础
1. 速率理论 P69
由• 于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：
H = A + B + Cu u
=
2l
dp
+
Cd Dm u
+
Cm dP2 Dm
+
CSmdP2 Dm
+
Cs df2 Ds
u
2019/12/20
2019/12/20
5、空间排阻色谱
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。 小分子可以进入到凝胶空隙， 由其中通过，出峰最慢；中等 分子只能通过部分凝胶空隙， 中速通过；而大分子被排斥在 外，出峰最快；溶剂分子小， 故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100105范围内的化合物按质量分离
《仪器分析》高效液相色谱法
《仪器分析》高效液相色谱法仪器分析是化学分析中的重要分支，是利用各种仪器设备对样品进行分析、测定和监控的科学方法。
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）作为仪器分析中的一种常用方法，具有快速、高效、灵敏度高等特点，在许多领域得到广泛应用。
高效液相色谱法是基于液相色谱原理发展起来的一种方法，其主要原理是利用色谱柱对样品中的化合物进行分离，再通过检测器对各个化合物进行定量测定。
高效液相色谱法相比传统的液相色谱法，具有流动相流速快、柱温控制稳定、色谱柱填充剂的粒径更小等优点，从而使样品得到更高的分离效果和更好的分辨率。
高效液相色谱法可以应用于多种不同类型的样品分析，例如药物分析、环境分析、食品安全监测等。
以药物分析为例，在药物研发和质量控制中，高效液相色谱法可以用于分析药物的纯度、含量和杂质等指标，从而保证药品的质量和安全性。
而在环境分析方面，高效液相色谱法可以用于检测水、土壤和空气中的有机污染物，为环境保护提供科学依据。
此外，高效液相色谱法还可以用于食品安全监测，检测食品中的农药残留和添加剂等有害物质，保障人民群众的身体健康。
高效液相色谱法的操作相对简单，但是在实际应用中也需要注意一些技巧和注意事项。
首先，需要选择合适的色谱柱和填充剂。
不同的分析目标和样品类型需要选择不同的色谱柱和填充剂，以获得最佳的分离效果和分辨率。
其次，需要合理选择流动相的组成和流速。
流动相的组成和流速会直接影响样品的分离效果和检测结果，因此需要经过调试和优化。
最后，还需要进行准确的定量分析。
在高效液相色谱法中，常用的定量方法包括外标法、内标法和标准曲线法等，可以根据实际情况选择合适的方法进行定量分析。
综上所述，高效液相色谱法是一种快速、高效、灵敏度高的仪器分析方法，具有广泛的应用领域和潜力。
在实际应用中，需要根据具体的分析目标和样品类型选择合适的色谱柱和填充剂，合理选择流动相的组成和流速，并进行准确的定量分析。
食品仪器分析-高效液相色谱参考答案
高效液相色谱习题一、填空题1.高效液相色谱分析是将流动相用高压泵输送，使压力高达 5 MPa以上，并采用新型的化学键合固定相，是分离效率很高的液相色谱法。
2.高效液相色谱法的特点是分离性能高、分析速度快、检测器灵敏度高、应用范围广。
3.高效液相色谱法和气相色谱法的共同之处是分离功能、分析功能、在线分析。
4.高效液相色谱分析根据分离机理不同可分为四种类型，即液固色谱、液液色谱、键合相色谱、凝胶色谱。
5.高效液相色谱中的液一液分配色谱采用的新型固定相叫化学键合相，它是利用化学方法将固定液官能团键合在载体表面上的。
6.通常把固定相极性大于流动相极性的一类色谱称为正相色谱。
反之称为反相色谱。
7.高效液相色谱仪通常由储液器、输液泵、梯度淋洗器、进样器、色谱柱、检测器、色谱工作站七部分组成。
8.高效液相色谱仪中使用最广泛的检测器为紫外检测器，另外还有折光检测器、荧光检测器等等。
9.高效液相色谱主要用于分析沸点高的、分子量大的、受热易分解的以及具有生理活性物质的分析。
二、判断题√、√、⨯、⨯、√、√、⨯、√、⨯、√、⨯、√、√、⨯、√、⨯、⨯、√、⨯、√、√、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、√、⨯1．液一液色谱流动相与被分离物质相互作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的改变。
（√）2．利用离子交换剂作固定相的色谱法称为离子交换色谱法。
（√）3．紫外吸收检测器是离子交换色谱法通用型检测器。
（×）4．检测器性能好坏将对组分分离产生直接影响。
（×）5．高效液相色谱适用于大分子，热不稳定及生物试样的分析。
（√）6．高效液相色谱中通常采用调节分离温度和流动相流速来改善分离效果。
（×）7．键合固定相具有机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。
（√）8．在液相色谱中为避免固定相的流失，流动相与固定相的极性差别越大越好。
（×）9．正相分配色谱的流动相极性大于固定相极性。
高效液相色谱法教程
由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗
全多孔型固定相
粒很细（5~10m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。 二、流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选 择性。 （2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选 用检测器波长比溶剂的紫外截止波长 要长。所谓溶剂
第二节 高效液相色谱仪
梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。
第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相
的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时， 溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不 透明的，它严重干扰组分的吸收测量。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较 大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。 （3）高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也 要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪 峰”。
固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0108~1.0109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相
仪器分析(第3章高效液相色谱分析)教材
三、应用范围
气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。
对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型 化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一 定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱 分析；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它 非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、 离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70 80%。 。
式中C m是与k (容量因子）函数。 d m固定相的粒度。 D m试样分子在流动相中的 扩散系数。u流动相线速度 .
仪器分析教程
ii.滞留的流动相中的传质阻力项Hsm 由于固定相的多孔性能使流动相滞留在其微孔内，微孔内 的流动相称为滞留区流动相（静止状态，不流动）。当流动 相中的试样分子与固定相进行质量交换时，必须先从流动相 扩散进入到滞留区。如果固定相中微孔既小又深，则滞留就 越严重，传质就越慢，对峰扩展影响也越大。 2 Cs m d p H sm u (3 4) Dm
(第五讲）
仪器分析教程
内容提要
1 高效液相色谱法的特点 2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 4 液相色谱法的固定相 5 液相色谱法流动相 6 高效液相色谱仪 7 高效液相色谱分离类型的选择 8 高效液相色谱法应用实例 9 液相制备色谱 10 毛细管电泳
仪器分析教程
因此，高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不 需要气化，不受试样挥发性的限制。
仪器分析教程
§3.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 • 与GC 比较65/1；基本概念及理论基础与GC一致； 主要区别：流动相不同. 影响的因素：柱内展宽和柱外展宽。 一、柱内展宽 1.涡流扩散项 ： He = 2λdp λ:填充不均匀因子；dp填充粒度直径 高效液相色谱法的固定相是高效填料，其颗粒直 径比气相色谱法更小；且装柱多采用匀浆法装柱， 填充很均匀， λ变得很小，所以He值比较小。
高效液相色谱法—高效液相色谱仪(仪器分析课件)
• 内梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入梯度混 合室，混合后进入色谱柱。
• 外梯度：一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混合。
柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为4.6或 3.9 mm ，长度为15～30 cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度5 ～10 μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000～10000。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
（三）检测器 1. 紫外吸收检测器 紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。 2. 光电二极管阵列检测器（PDAD） 3. 示差折光检测器（DRD） 4. 电导检测器 5. 荧光检测器 6. 蒸发激光散射检测器
HPLC
HPLC
高效液相色谱仪 一、高效液相色谱仪工作流程及组成
• 1.高效液相色谱仪的工作流程图
一、高效液相色谱仪工作流程及组成 流 动 相
高压泵
2.高效液相色谱仪组成
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
检测器
二、仪器操作 （一）开机前 的准备
• 在开机前应详细阅读 仪器使用说明书，了 解仪器的参数、熟悉 仪器操作规程。
高压输液泵
3.. 梯度洗脱装置
高压梯度： 用于二元梯 度，用两个泵分别按设定 的比例输送A和B两溶液 至混合器
（二）进样装置 常见的 进样装置有： 1.隔膜进样 2.停留进样 3.六通进样 4.自动进样
（三）色谱分离系统
色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）。通常用后壁玻璃 管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样 品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
仪器分析 第三章高效液相色谱分析
主要分离机理
吸附能，氢键 疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力 立体效应 生化特异亲和力
主要分析对象或应用领域
异构体分离、族分离，制备 各种有机化合物的分离、分析与制备 高分子分离，分子量及其分布的测定 无机离子、有机离子分析 手性异构体分离，药物纯化 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
同时消耗样品少。
2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
（1）速度快-通常分析一个样品在15～30 min，有些样 品甚至在5 min内即可完成。 （ 2 ）分辨率高 - 可选择固定相和流动相以达到最佳分离 效果。 （3）灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学 检测器可达0.1pg。 （ 4 ）柱子可反复使用 - 用一根色谱柱可分离不同的化合 物。 （ 5 ）样品量少，容易回收 - 样品经过色谱柱后不被破坏， 可以收集单一组分或做制备。
基本要求： ①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定 量的准确性至关重要；②流量准确可调，0.1～10 ml/min， ③输出压力高，一般应能达到 150 ～ 300kg/cm2 ；④液流稳 定，无脉动；⑤ 死体积小，要求小于0.5ml。⑥密封性能好， 耐腐蚀。
泵的使用及注意事项： ①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂 质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预 先过滤除去流动相中的任何固体微粒，泵的入口都应连接 砂滤棒。 ②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动 相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况 下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏， 甚至只是由于溶液的静臵，就可能析出盐的微细晶体，这 些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。 因此，用后必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于 色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（如对于反相键合硅胶 固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。
高效液相色谱法—高效液相色谱法的应用(仪器分析课件)
二、流动相的制备
• 新型的高效液相色谱仪多用专用的在线真空 脱气技术。真空脱气装置串联到储液系统中， 并结合膜过滤器，实现流动相在进入输液泵 前的连续真空脱气。
仪器分析
模块三 高效液相色谱法
项目三高效液相色谱法应用
目标
01 掌握高效液相色谱仪使用操作技 能
02 掌握高效液相色谱仪各部分操作技能 相关标题文字
高效液相色谱法实验技术
学生分组练习
根据实验室的实际情况，安排学生分组练习， 一部分学生练习配制流动相，一部分学生练习 操作仪器(以苯试样为例）。
仪器分析
模块三 高效液相色谱法
项目三高效液相色谱法应用
目标
01 掌握高效液相色谱法的应用技
术
02 掌握流动相配制及制备技术
项目三 高效液相色谱法应用
03
——流动相的配制
·流动相的配制 ·流动相的脱气方法
复习： 高效液相色谱仪是以液体为流动相，高压泵将贮 液瓶中流动相经过进样器送入到色谱柱，然后从 废液口中流出；样品经进样器注入后，流动相将 样品带入到色谱柱进行分离，分离后的组分依次 先后顺序进入检测器。记录仪将检测器的信号记 录下来，得到液相色谱图。
➢2.取混合均匀的溶液， 经0.45µm的有机膜过滤， 再脱气15分钟即可
二、流动相的制备
➢3.将过滤好的流动相装入到流动相的储液瓶中， 然后进行脱气
二、流动相的制备
• 4.脱气方法：
• 常用的方法有吹氦脱 气法、加热回流法、 抽真空脱气法、超声 脱气法。以上几种方 法是离线脱气法，在 流动相存放过程中又 会有空气重新溶解在 储液系统中，
高效液相色谱法实验技术 操作过程演示3
观察废液出口，若没有气泡，按“Purge”鍵，停止排 放，关闭排放阀。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是目前广泛应用于仪器分析领域的一种重要分析方法。
它通过利用柱子中流动的流动相和样品的物理化学性质的相互作用，使样品组分在柱子中发生分离，再通过检测器对各组分进行定量或定性分析。
仪器分析高效液相色谱法主要由流动相供给系统、进样器、柱子、检测器和数据处理系统等组成。
流动相供给系统通过恒压或恒流的方式将流动相送入进样器中，进样器将样品注入柱子中，柱子根据物理化学性质的差异，使不同组分发生分离，之后检测器检测进入检测器的各组分的浓度，并通过数据处理系统对数据进行分析和整理。
高效液相色谱法具有分离效率高、分离时间短、适用范围广等特点。
与传统的液相色谱法相比，高效液相色谱法的流动相的流速更高，柱子填充物颗粒更小，从而大大提高了分离效率。
同时，高效液相色谱法对样品的需求量较小，具有较好的分析灵敏度。
因此，高效液相色谱法被广泛应用于生物、环境、食品、药物、化工等领域的组分分析和质量控制。
在生物领域中，高效液相色谱法常用于生物样品中代谢产物和药物的分析。
通过绑定柱子、手性柱子以及使用不同的检测器，可以对复杂的生物样品中的不同组分进行准确的分析和定量测试。
例如，对尿液中的代谢产物进行分析可以帮助人们了解人体健康状态，对药物的残留物进行分析可以保证食品和水的安全等。
在环境领域中，高效液相色谱法常用于水质、大气和土壤等环境样品中有机污染物的分析。
通过连接各种不同相的柱子，可以对复杂的环境样品中的有机污染物进行有效的分离，使用紫外-可见光检测器或质谱检测器可以对分离后的各组分进行检测和定量。
在食品领域中，高效液相色谱法常用于食品中添加剂、农药残留物和食品中的有害物质的分析。
通过选择合适的柱子和检测器，可以对复杂的食品样品进行分离和检测，以保证食品的安全性和质量。
在药物领域中，高效液相色谱法常用于药品中活性成分和杂质的分析。
仪器分析高效液相色谱法
离子交换色谱法适用于分离离子化合物，如氨基酸、核酸等。在分离过程中，离子交换剂对不同离子的亲和力不 同，通过改变流动相的离子强度和种类，可以实现对不同离子的分离。
体积排阻色谱法
总结词
利用固定相孔径大小排除不同大小的分子进行分离。
详细描述
体积排阻色谱法适用于分离大分子物质，如蛋白质、多糖等。在分离过程中，固定相的孔径大小不同 ，能够排除不同大小的分子，从而实现分离。该方法具有较高的分辨率和分离效果。
检测
通过检测器对分离后的组分进 行检测，记录数据并进行后续
分析。
03
高效液相色谱法的分离模式
正相色谱法
总结词
利用极性固定相吸附剂，对极性物质的吸附作用进行分离。
详细描述
正相色谱法适用于分离极性物质，如醇、胺、水溶性氨基酸 等。在分离过程中，固定相的极性大于流动相的极性，极性 物质在固定相上的吸附力较强，因此能够得到较好的分离效 果。
金属、霉菌毒素等，保障食品安全。
生物医学研究中的应用
生物分子分离纯化
高效液相色谱法可用于分离和纯化生物分子，如蛋白质、核酸等， 为生物医学研究提供高质量的样品。
药物代谢和药代动力学研究
通过高效液相色谱法检测药物在体内的浓度和代谢产物，有助于了 解药物的作用机制和代谢途径。
临床诊断和生物标志物分析
高效液相色谱法能够检测生物体中的生物标志物，如氨基酸、脂肪 酸、激素等，为临床诊断和疾病研究提供重要信息。
食品分析中的应用
食品添加剂分析
01
高效液相色谱法可用于检测食品中的添加剂，如防腐剂、色素、
甜味剂等，确保食品质量和安全。
营养成分分析
02
通过高效液相色谱法测定食品中的维生素、矿物质和其他营养
大学 师范类 化学专业 仪器分析学科 第三章高效液相色谱法
阳离子交换
- + M++ RSO3 H
H+ + RSO3 M+
-
阴离子交换
Cl X RNR+ + 3
阳离子交换树脂
RNR3 X + Cl-
+
-
3、流动相
水相缓冲液+有机溶剂
调节选择性的 主要参数
盐种类及浓度 pH值
各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：
2 2 2 柠檬酸离子 SO4 C 2O4 I NO3 CrO4 Br
( BH+ RSO3 )m ( BH+ RSO3 ) s
离子对
+ + 通式 B+ + A ( ) ( B B A A )s m 疏水性离子对不易在水中离解而迅速进入有机相中， 存在下述萃取平衡：
X+水相+ Y-水相
[B A ]s [ B A ]s KB A [B ]m [B ]m [A ] m
故要减小He，提高柱效，应采用小颗粒固定 相并填充均匀。
HPLC
2、分子扩散相Hd（纵向扩散项）
cd Dm Hd u
cd ：常数
Dm ：分子在流动相中的扩散系数
u :
流动相流速
Dm 一般很小，当u较大时，Hd很小，Hd可忽略
HPLC
3、传质阻力项
HPLC
（1） 固定相传质阻力项
Hs Cs d f Ds u
硅烷化反应
硅胶
十八烷基 氯硅烷
ODS(C18)键合相 非极性
键合固定相类 型 疏水基团 烷烃（C8和C18）、苯基等 极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
仪器分析—高效液相色谱法
仪器分析—高效液相色谱法高效液相色谱（HPLC）是一种分离和定量化学物质的分析技术。
它广泛应用于生物医药、食品安全、环境监测等领域。
HPLC的原理基于样品在流动相中的分配行为，通过调节流动相成分和流速，实现对样品中化合物的分离和定量。
HPLC的特点之一是分离效率高。
其分析柱内有高效填料，通常是细小颗粒的吸附剂，能够提供大的表面积，有效地增加了分析柱与流动相接触的面积，从而提高了分离能力。
此外，在HPLC中还可以根据需要选择适当的流动相，调节柱温和压力等条件，进一步优化分析条件，提高分离效果。
其次，HPLC的灵敏度高。
在HPLC中，使用的检测器通常有紫外-可见光谱法、荧光法、质谱法等。
这些检测器可以实现对特定化合物的高选择性检测，而且还能够对不同化合物进行同时检测。
对于低浓度的化合物，可以通过选择合适的检测器和优化分析条件，提高检测灵敏度，使得即使在样品中含量很低的化合物也能够被准确地检测到。
此外，HPLC在分析速度和样品处理方面也比较快捷。
与传统的柱色谱技术相比，HPLC使用的高压泵可以提高流动相的速度，从而缩短分析时间。
对于样品预处理方面，使用HPLC时只需要进行简单的处理，如溶解样品并过滤，就可以直接进入分析阶段。
这使得HPLC具有高通量分析的优势，能够在短时间内快速分析大量样品。
此外，HPLC还可与其他技术结合应用。
例如，HPLC-质谱联用技术可以实现对样品中化合物的分离和结构的同时鉴定，具有非常高的分析灵敏度和选择性。
HPLC还可以与色谱预处理、液相萃取和样品前处理等技术结合，提高样品的净化效果和检测灵敏度。
综上所述，HPLC是一种高效、灵敏和多功能的分析技术，被广泛应用于各个科学领域。
它的分离效率高，灵敏度高，分析速度快，样品处理简便，可以与其他技术结合使用，提高分析的效果和可靠性。
在今后的科学研究和实际应用中，HPLC将继续发挥重要的作用。
仪器分析课后题答案（第四版）
仪器分析课后题答案（第四版）第⼆章⽓相⾊谱分析1. 当下列参数改变时:(1)柱长缩短,(2)固定相改变,(3)流动相流速增加,(4)相⽐减少,是否会引起分配系数的改变?为什么?答:固定相改变会引起分配系数的改变,因为分配系数只与组分的性质及固定相与流动相的性质有关.所以（1）柱长缩短不会引起分配系数改变（2）固定相改变会引起分配系数改变（3）流动相流速增加不会引起分配系数改变（4）相⽐减少不会引起分配系数改变2.当下列参数改变时: (1)柱长增加,(2)固定相量增加,(3)流动相流速减⼩,(4)相⽐增⼤,是否会引起分配⽐的变化?为什么?答: k=K/b,⽽b=VM/VS ,分配⽐除了与组分,两相的性质,柱温,柱压有关外,还与相⽐有关,⽽与流动相流速,柱长⽆关.故:(1)不变化,(2)增加,(3)不改变,(4)减⼩3．能否根据理论塔板数来判断分离的可能性?为什么?答: 不能,有效塔板数仅表⽰柱效能的⾼低,柱分离能⼒发挥程度的标志,⽽分离的可能性取决于组分在固定相和流动相之间分配系数的差异.4．在⼀根2 m 长的⾊谱柱上,分析⼀个混合物,得到以下数据:苯、甲苯、及⼄苯的保留时间分别为1?20“, 2…2”及3?1“；半峰宽为0.211cm, 0.291cm, 0.409cm ，已知记录纸速为1200mm.h-1,求⾊谱柱对每种组分的理论塔板数及塔板⾼度。
解：三种组分保留值⽤记录纸上的距离表⽰时为：苯：（1+20/60）×[（1200/10）/60]=2.67cm甲苯：(2+2/60) ×2=4.07cm⼄苯: (3+1/60) ×2=6.03cm甲苯和⼄苯分别为：1083.7,0.18cm; 1204.2,0.17cm5．试述速率⽅程中A, B, C三项的物理意义. H-u 曲线有何⽤途?曲线的形状主要受那些因素的影响?解: A 称为涡流扩散项, B 为分⼦扩散项，C 为传质阻⼒项。
仪器分析第3章高效液相色谱分析
仪器分析第3章高效液相色谱分析第3章高效液相色谱分析教学时数：2学时教学要求：1、了解高效液相色谱法的基本原理及使用范围。
2、理解常用检测器的原理、优缺点及适用范围。
3、理解各种分离方式（液固色谱；液液色谱；键合相色谱；离子交换色谱；离子对色谱；排阻色谱）的原理、适用的分析对象及选择原则。
教学重点与难点：1、高效液相色谱与气相色谱的异同点。
2、高效液相色谱仪的组成及工作原理。
3、高效液相色谱的分离方式。
3.1 概述高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末发展起来的一种新型分离分析技术，已成为化学、生物化学与分子生物学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术。
它在技术上采用了高压泵、高效（化学键合）固定相和高灵敏度检测器，具备高压、高速、高效的特点。
一、液相色谱的特点：二、与气相色谱法比较，HPLC的优点：1、分析对象广气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化合物；HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制，适用于高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质。
原则上讲，几乎可以分析除永久气体外所有的有机和无机化合物。
2、流动相对分离起作用气相色谱的流动相仅起运载作用，对组分不产生相互作用力；HPLC 的流动相对组分产生相互作用力，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数。
3、经常在室温条件下操作气相色谱法一般在较高温度下进行三、固定相与流动相液相色谱固定相液相色谱流动相四、高效液相色谱仪高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。
图高效液相色谱仪的流程一、高压输液泵高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。
输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。
基本要求：⑴流量准确可调，0.1～10ml/min⑵耐高压，40～50 MPa⑶液流稳定，无脉动⑷死体积小，要求小于0.5ml二、梯度洗脱装置梯度洗脱是使流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断改变流动相的组成，以调节它的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子，并使样品中的所有组分可在最短的分析时间内，以适用的分离度获得圆满的选择性分离。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2021/2/10
可编辑版
11
2、液-固吸附色谱
基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样 缺点：非线性等温吸附常引起峰的拖尾；
2021/2/10
可编辑版
12
3、 离子对色谱（分离有机酸、有机碱）
原理：流动相中加入离子对试剂，使被测组分的溶质离
制备方法： a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅碳键型： ≡Si—C c. 硅氮键型： ≡Si—N d. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；
2021/2/10
可编辑版
17
化学键合固定相的特点
（1）表面无液坑，比一般液体固定相传质快； （2）无固定液流失，增加了色谱柱稳定性和寿命 （3）可键合不同官能团，选择性好 （4）有利于梯度版
4
2、HPLC与GC的区别
• 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而 这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子 量、热稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。
• 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体， 只起运载作用，和组分之间没有相互的作用力；HPLC采用的流 动相为各种极性不同的液体或液体的混合，可供选择的机会多。 它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作 用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和 改进分离。
固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 基本原理：组分在固定相上发生的离子交换反应；不同 组分与离子交换剂之间亲和力的大小不同。 应用：在溶液中可电离的物质，氨基酸、核酸、蛋白质 等生物大分子。
2021/2/10
可编辑版
14
5、空间排阻色谱
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；
原理：按分子大小分离。 小分子可以进入到凝胶空隙， 由其中通过，出峰最慢；中等 分子只能通过部分凝胶空隙， 中速通过；而大分子被排斥在 外，出峰最快；溶剂分子小， 故在最后出峰。
子与其电荷相反的对离子形成中性离子对，以改善分离
分析酸（阴离子分离）：常采用烷基铵类，如：氢氧化
四丁基铵
分析碱（阳离子分离）：常采用烷基磺酸类，如：己烷
磺酸钠；
反相离子对色谱：
固定相：非极性的疏水键和相 (C-18柱)
流动相：含有对离子的甲醇-水或乙腈-水
2021/2/10
可编辑版
13
4、 离子交换色谱
2021/2/10
可编辑版
10
正相色谱与反相色谱比较
正相色谱——固定液极性 > 流动相极性 ➢ 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 ✓ 适于分离极性组分 反相色谱——固定液极性 < 流动相极性 ➢ 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 ✓ 适于分离非极性组分
反相色谱：固定相： C-18柱 流动相：甲醇-水或乙腈-水
• 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
2021/2/10
可编辑版
5
§3-2 高效液相色谱法理论基础
1. 速率理论 P69
由• 于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：
H = A + B + Cu u
=
2l
dp
+
Cd Dm u
+
Cm dP2 Dm
+
CSmdP2 Dm
+
Cs df2 Ds
全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100105范围内的化合物按质量分离
2021/2/10
可编辑版
15
§3-4 液相色谱固定相
1. 液-液分配及离子对分离固定相
（1）全多孔型担体
由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用 100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳。
现采用10μm以下的小颗粒
（2）表面多孔型担体
（薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，表面 附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅 胶。表面积小，柱容量低；需要高 灵敏度的检测器。
现在5~10 μm全多孔型担体使用广泛
2021/2/10
可编辑版
16
化学键合固定相
定义：用化学反应的方法通过化学键把有机物分子结合到 担体表面。（目前应用最广、性能最佳的固定相）
u
2021/2/10
可编辑版
6
• 速率方程： H=A+B/u+Cu
• （1）液体的扩散系数仅为气体的万分之一，HPLC中 速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，
• （2）影响柱效的主要因素是传质项。
2021/2/10
可编辑版
7
2、提高柱效的途径：
• 提高柱内填料均匀性，减小固定相粒度（选择 薄壳形担体）
• 选用低粘度的流动相或适当提高柱温，降低流 动相粘度;
• 减小粒度是最有效的途径.
2021/2/10
可编辑版
8
§3-3 高效液相色谱法 主要类型及分离原理
1、液液分配色谱法 2、液固吸附色谱法 3、离子交换色谱法 4、离子对色谱 5、空间排阻色谱法
2021/2/10
可编辑版
9
1、液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 分离机制：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流 动相的极性小于固定液的极性（正相色谱），反之，流动相 的极性大于固定液的极性（反相色谱）。 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用; 目前应用最广的固定相:化学键合固定相
第三章 高效液相色谱分析
High Performance Liquid Chromatography, HPLC
2021/2/10
可编辑版
1
§3-1 高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法： 一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。 它在经典液相色谱的基础上，引入气相色
谱的理论，技术上采用了高压泵、高效分离柱、 高灵敏度检测器。
分离机制：分配 + 吸附
采用化学键和固定相的液相色谱称为化学键和相色谱。 （化学键和相色谱类型及应用见表3-2）
2021/2/10
可编辑版
2
2021/2/10
可编辑版
3
1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高压： HPLC采用高压输液设备, 150-350*105 Pa 高速： HPLC流速大增，分析速度极快，只需数分 钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小 时。 高效：化学键和固定相, >30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）