仪器分析第三章高效液相色谱分析
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固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 分离机制：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流 动相的极性小于固定液的极性（正相色谱），反之，流动相 的极性大于固定液的极性（反相色谱）。 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用; 目前应用最广的固定相:化学键合固定相
制备方法： a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅碳键型： ≡Si—C c. 硅氮键型： ≡Si—N d. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；
2021/2/10
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化学键合固定相的特点
（1）表面无液坑，比一般液体固定相传质快； （2）无固定液流失，增加了色谱柱稳定性和寿命 （3）可键合不同官能团，选择性好 （4）有利于梯度洗脱；
• 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
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§3-2 高效液相色谱法理论基础
1. 速率理论 P69
由• 于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：
H = A + B + Cu u
=
2l
dp
+
Cd Dm u
+
Cm dP2 Dm
+
CSmdP2 Dm
+
Cs df2 Ds
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1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高压： HPLC采用高压输液设备, 150-350*105 Pa 高速： HPLC流速大增，分析速度极快，只需数分 钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小 时。 高效：化学键和固定相, >30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）
子与其电荷相反的对离子形成中性离子对，以改善分离
分析酸（阴离子分离）：常采用烷基铵类，如：氢氧化
四丁基铵
分析碱（阳离子分离）：常采用烷基磺酸类，如：己烷
磺酸钠；
反相离子对色谱：
固定相：非极性的疏水键和相 (C-18柱)
流动相：含有对离子的甲醇-水或乙腈-水
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4、 离子交换色谱
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2、液-固Hale Waihona Puke Baidu附色谱
基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样 缺点：非线性等温吸附常引起峰的拖尾；
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3、 离子对色谱（分离有机酸、有机碱）
原理：流动相中加入离子对试剂，使被测组分的溶质离
全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100105范围内的化合物按质量分离
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§3-4 液相色谱固定相
1. 液-液分配及离子对分离固定相
（1）全多孔型担体
由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用 100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳。
现采用10μm以下的小颗粒
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正相色谱与反相色谱比较
正相色谱——固定液极性 > 流动相极性 ➢ 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 ✓ 适于分离极性组分 反相色谱——固定液极性 < 流动相极性 ➢ 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 ✓ 适于分离非极性组分
反相色谱：固定相： C-18柱 流动相：甲醇-水或乙腈-水
（2）表面多孔型担体
（薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，表面 附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅 胶。表面积小，柱容量低；需要高 灵敏度的检测器。
现在5~10 μm全多孔型担体使用广泛
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化学键合固定相
定义：用化学反应的方法通过化学键把有机物分子结合到 担体表面。（目前应用最广、性能最佳的固定相）
分离机制：分配 + 吸附
采用化学键和固定相的液相色谱称为化学键和相色谱。 （化学键和相色谱类型及应用见表3-2）
• 选用低粘度的流动相或适当提高柱温，降低流 动相粘度;
• 减小粒度是最有效的途径.
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§3-3 高效液相色谱法 主要类型及分离原理
1、液液分配色谱法 2、液固吸附色谱法 3、离子交换色谱法 4、离子对色谱 5、空间排阻色谱法
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1、液-液分配色谱
固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 基本原理：组分在固定相上发生的离子交换反应；不同 组分与离子交换剂之间亲和力的大小不同。 应用：在溶液中可电离的物质，氨基酸、核酸、蛋白质 等生物大分子。
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5、空间排阻色谱
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；
原理：按分子大小分离。 小分子可以进入到凝胶空隙， 由其中通过，出峰最慢；中等 分子只能通过部分凝胶空隙， 中速通过；而大分子被排斥在 外，出峰最快；溶剂分子小， 故在最后出峰。
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• 速率方程： H=A+B/u+Cu
• （1）液体的扩散系数仅为气体的万分之一，HPLC中 速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，
• （2）影响柱效的主要因素是传质项。
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2、提高柱效的途径：
• 提高柱内填料均匀性，减小固定相粒度（选择 薄壳形担体）
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2、HPLC与GC的区别
• 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而 这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子 量、热稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。
• 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体， 只起运载作用，和组分之间没有相互的作用力；HPLC采用的流 动相为各种极性不同的液体或液体的混合，可供选择的机会多。 它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作 用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和 改进分离。
第三章 高效液相色谱分析
High Performance Liquid Chromatography, HPLC
2021/2/10
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§3-1 高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法： 一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。 它在经典液相色谱的基础上，引入气相色
谱的理论，技术上采用了高压泵、高效分离柱、 高灵敏度检测器。
制备方法： a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅碳键型： ≡Si—C c. 硅氮键型： ≡Si—N d. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；
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化学键合固定相的特点
（1）表面无液坑，比一般液体固定相传质快； （2）无固定液流失，增加了色谱柱稳定性和寿命 （3）可键合不同官能团，选择性好 （4）有利于梯度洗脱；
• 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
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§3-2 高效液相色谱法理论基础
1. 速率理论 P69
由• 于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：
H = A + B + Cu u
=
2l
dp
+
Cd Dm u
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Cm dP2 Dm
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CSmdP2 Dm
+
Cs df2 Ds
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1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高压： HPLC采用高压输液设备, 150-350*105 Pa 高速： HPLC流速大增，分析速度极快，只需数分 钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小 时。 高效：化学键和固定相, >30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）
子与其电荷相反的对离子形成中性离子对，以改善分离
分析酸（阴离子分离）：常采用烷基铵类，如：氢氧化
四丁基铵
分析碱（阳离子分离）：常采用烷基磺酸类，如：己烷
磺酸钠；
反相离子对色谱：
固定相：非极性的疏水键和相 (C-18柱)
流动相：含有对离子的甲醇-水或乙腈-水
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4、 离子交换色谱
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2、液-固Hale Waihona Puke Baidu附色谱
基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样 缺点：非线性等温吸附常引起峰的拖尾；
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3、 离子对色谱（分离有机酸、有机碱）
原理：流动相中加入离子对试剂，使被测组分的溶质离
全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100105范围内的化合物按质量分离
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§3-4 液相色谱固定相
1. 液-液分配及离子对分离固定相
（1）全多孔型担体
由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用 100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳。
现采用10μm以下的小颗粒
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正相色谱与反相色谱比较
正相色谱——固定液极性 > 流动相极性 ➢ 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 ✓ 适于分离极性组分 反相色谱——固定液极性 < 流动相极性 ➢ 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 ✓ 适于分离非极性组分
反相色谱：固定相： C-18柱 流动相：甲醇-水或乙腈-水
（2）表面多孔型担体
（薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，表面 附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅 胶。表面积小，柱容量低；需要高 灵敏度的检测器。
现在5~10 μm全多孔型担体使用广泛
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化学键合固定相
定义：用化学反应的方法通过化学键把有机物分子结合到 担体表面。（目前应用最广、性能最佳的固定相）
分离机制：分配 + 吸附
采用化学键和固定相的液相色谱称为化学键和相色谱。 （化学键和相色谱类型及应用见表3-2）
• 选用低粘度的流动相或适当提高柱温，降低流 动相粘度;
• 减小粒度是最有效的途径.
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§3-3 高效液相色谱法 主要类型及分离原理
1、液液分配色谱法 2、液固吸附色谱法 3、离子交换色谱法 4、离子对色谱 5、空间排阻色谱法
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1、液-液分配色谱
固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 基本原理：组分在固定相上发生的离子交换反应；不同 组分与离子交换剂之间亲和力的大小不同。 应用：在溶液中可电离的物质，氨基酸、核酸、蛋白质 等生物大分子。
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5、空间排阻色谱
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；
原理：按分子大小分离。 小分子可以进入到凝胶空隙， 由其中通过，出峰最慢；中等 分子只能通过部分凝胶空隙， 中速通过；而大分子被排斥在 外，出峰最快；溶剂分子小， 故在最后出峰。
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• 速率方程： H=A+B/u+Cu
• （1）液体的扩散系数仅为气体的万分之一，HPLC中 速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，
• （2）影响柱效的主要因素是传质项。
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2、提高柱效的途径：
• 提高柱内填料均匀性，减小固定相粒度（选择 薄壳形担体）
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2、HPLC与GC的区别
• 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而 这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子 量、热稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。
• 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体， 只起运载作用，和组分之间没有相互的作用力；HPLC采用的流 动相为各种极性不同的液体或液体的混合，可供选择的机会多。 它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作 用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和 改进分离。
第三章 高效液相色谱分析
High Performance Liquid Chromatography, HPLC
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§3-1 高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法： 一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。 它在经典液相色谱的基础上，引入气相色
谱的理论，技术上采用了高压泵、高效分离柱、 高灵敏度检测器。