第五章 细胞的原代与传代培养
第5章 细胞的原代与传代培养
第5章细胞的原代与传代培养关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
第五章细胞的原代与传代培养关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
一、原代培养概念：取自体内新鲜组织并�Z于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。
关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
原代培养技术的重要意义: 原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性。
利用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。
原代培养也是建立各种细胞系(株)必须经过的阶段。
关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
原代培养消化法贴块法冷消化温消化一次性消化分次消化消化法：这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织(或器官)从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。
关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
原代培养方法分类贴块法消化法关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
93分次消化消化法的分类关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
解离释放细胞的方法最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。
用酶学解离细胞法解离细胞是体外培养动物细胞时分散组织的基本方法，最常用的消化酶是胰蛋白酶和胶原酶两种。
关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
动物细胞原代培养过程图关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
器材和液体的准备细胞培养用的玻璃器材培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，160℃,2小时干烤灭菌后备用手术器材、瓶塞等15磅，121℃,20分钟蒸气灭菌 MEM培养液、消化液、PBS液等用滤器过滤后备用关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
原代培养和传代培养
原代培养:即第一次培养，是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。
有几方面含义：●培养物一经接种到培养器皿（瓶）中就不在分割，任其生长繁殖；●原代培养中的“代”并非细胞的“代”数，因为培养过程中细胞经多次分裂已经产生多代子细胞；●原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液，也不等于不更换培养器皿。
正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。
所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。
目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。
此细胞系一直延用至今。
原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。
但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能够传到40～50代，这种传代细胞叫做细胞株。
细胞株的遗传物质没有发生改变,在培养过程中其特征始终保持。
当细胞株传至50代以后又会出现“危机”，不能再传下去。
但是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，有可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系。
原代培养是建立各种细胞系（株）必经的阶段，其是否成功与组织污染与否、供体年龄、培养技术和方法、适宜培养基的选择等多种因素有关。
由于原代培养的细胞转化性极小，对病毒敏感性好，因此适应制备疫苗等生物制品；但也存在有潜在外源因子、不能事先检查标本、且受供体年龄健康状况的影响而导致批间差异大等缺陷。
目前常用的原代细胞培养有鸡胚成纤维细胞及猪肾、猴肾、地鼠肾等原代细胞。
原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养条件下培养等步骤，在所有的操作过程中，都必须保持培养物及生长环境的无菌。
多数情况下，分散的细胞若属于贴壁依赖型细胞，就能黏附、铺展于培养器皿和载体表面生长而形成细胞单层，这种培养方式称为单层细胞培养（monolayer culture），又叫贴壁培养（adherent culture）。
细胞的原代培养和传代培养
实验五细胞的原代培养和传代培养1. 实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程。
2. 实验指导细胞培养(cell culture)是从机体中将细胞取出后，在模拟生物体内生理条件下使其在体外生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命活动过程的方法。
进行细胞生物学、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成为一种重要的生物学技术。
细胞培养一般可分为原代培养和传代培养。
所谓原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。
原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。
一般动物和人的所有组织都可以用于培养，但幼体组织和细胞(如胚胎组织、幼仔的脏器等)更容易进行原代培养。
传代培养则是为了使体外培养的原代细胞或细胞株在体外持续生长、繁殖。
细胞持续生长繁殖就必须传代，并由此获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞。
培养的贴壁细胞形成单层汇合后，由于密度过大、生存空间不足而引起营养枯竭。
将培养的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比例转移到另外的容器中继续进行培养，即为传代培养。
要使细胞在离体情况下生长繁殖，培养条件必须尽可能接近体内，除营养物质外，温度、PH值、生长因子等也至关重要。
此外，还应避免细菌及其他微生物的污染，重金属离子及有毒化学物质及放射线的影响。
贴壁细胞通过质膜表面的粘着蛋白贴附于培养瓶表面。
加入消化液可使粘着蛋白部分水解，从而使培养的细胞游离。
但消化时间不可过长，否则可能导致细胞解体死亡。
常用的消化液为胰蛋白酶和EDTA。
二者可分别使用，也可共同使用。
钙离子是二者的抑制剂，故实验中消化结束时，加入含有钙离子的全培养液，即可终止消化。
细胞的一代是指细胞从接种到分离再培养的一段时间，与细胞世代或倍增不同，在一代中细胞倍增3～6次。
细胞传代后一般经过三个阶段：游离期、指数生长期和停止期。
传代培养法
传代培养法是一种细胞培养技术，用于将原代细胞转化为可反复传代的细胞系。
这种方法的步骤如下：
1. 原代细胞适应阶段：原代细胞从组织中分离出来后，需要经过适应阶段以适应该培养环境。
在此期间，细胞逐渐适应贴壁生长，并逐渐分裂增殖。
2. 传代阶段：当原代细胞生长到一定阶段后，需要进行传代。
传代是将原代细胞接种到新的培养液中，以继续增殖生长。
传代过程中需要注意细胞的生长状态和密度，以避免过度生长或污染。
3. 维持培养：传代后的细胞系需要继续培养，以维持其生长和增殖。
在此过程中，需要定期更换培养液，以避免代谢产物的积累和细菌污染。
4. 细胞冻存：为了保持细胞的活力和稳定性，需要进行细胞冻存。
细胞冻存是将细胞保存在低温下，以延长细胞的寿命并保持其遗传稳定性。
传代培养法是一种常用的细胞培养技术，可以用于原代细胞的扩大培养和细胞的遗传稳定性研究。
同时，传代培养法还可以用于制备疫苗、基因治疗和组织工程等领域。
细胞培养的过程及注意事项
3 6 细胞培养的过程及注意事项细胞的培养过程及注意事项；根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细；一、原代培养；（一）过程；原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种；1、组织块培养法；（1）基本操作过程；1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪；2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养；3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一；4）、将种植了组织块细胞的培养过程及注意事项根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。
一、原代培养（一）过程原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种及培养等步骤。
原代培养的方法很多，基本和最常用的是组织块培养法和分离细胞法。
1、组织块培养法（1）基本操作过程1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。
再用平衡液（PBS）或Hanks 液漂洗；用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks 液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。
2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上；3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞；4）、将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1h到3h 后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置；5）、每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。
2、注意事项1）、组织块接种后的前3 天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。
要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。
2）、加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。
3）、用组织块培养时，要及时观察，当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，因为已漂浮的组织块和那些细胞碎片已经死亡，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长，要及时清除。
细胞的原代培养
细胞原代培养【实验目的】1.理解细胞原代培养原理2.熟悉细胞原代培养方法与过程3.了解细胞原代培养的应用4.独立进行细胞原代培养操作【实验原理】1、原代培养实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，即组织直接从机体获取后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。
由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长，代谢，繁殖提供有力的手段。
同时也为以后传代培养创造条件。
原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞,加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。
原代培养的方法有：a.组织块法:在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。
用Hanks液洗涤2—3次，自然沉淀。
用吸管吸去上清液。
将组织块贴于培养瓶进行培养。
b.酶消化法:将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的0.125%的胰蛋白酶。
370C磁棒搅拌消化20－30分钟。
然后终止消化。
用几层无菌纱布过滤。
取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。
弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。
【实验仪器、材料、试剂及用品】1.仪器：荧光显微镜，CO2培养箱2.材料：孕鼠3.试剂：(1) 培养液：为DMEM，添加10％新生牛血清(NBS)、青霉素100 u／ ml 、链霉素100ug／ml。
(2)消化液：为0.125％胰蛋白酶—0.02％EDTA 混合消化液。
4.用品：镊子，剪刀，培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯、小指管。
【实验步骤】(一)小鼠胚胎的准备:1.取怀孕16～18d的母鼠，断颈处死，置于75%的酒精中。
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法1. 引言嘿，大家好！今天咱们聊聊动物细胞的培养，听起来可能有点高大上，但其实就像种花一样，只是“花”是细胞，养护的方法也有讲究。
说白了，细胞也有自己的“家”，咱们得给它们创造个舒适的环境，让它们在里面嗨起来！接下来，我就带你走进这个充满神奇和乐趣的细胞世界。
2. 原代培养2.1 什么是原代培养？原代培养，简单来说，就是从活体动物身上直接提取细胞，然后把它们放在培养皿里，就像把新鲜的花插进水里一样。
你知道吗，这些细胞就像刚从大自然里来的小家伙，特别活泼，适应能力强。
不过，这可不是随便就能搞定的，得有点技术活。
2.2 原代培养的方法首先，咱得准备好一切工具，这可是基础中的基础，不能马虎。
咱们要用到无菌技术，确保培养环境干净得像新洗的碗，不然细胞们就会遭殃。
提取细胞时，通常会用胰酶把它们从组织中“松开”，就像剥开一个大榴莲，里边的果肉才好吃嘛。
然后，把这些细胞放到培养基里。
培养基就像细胞的“快餐”，里面有细胞需要的各种营养物质和生长因子。
要记得，细胞也要“吃好”，才能长得壮壮的，不然就不成气候了。
培养的环境也不能小看，温度、pH值、二氧化碳浓度都得保持稳定。
咱们得把细胞放在适合的温度下，就像给它们开个温暖的“家庭聚会”。
如果环境不合适，细胞就会抗议，甚至罢工！3. 传代培养3.1 什么是传代培养？说到传代培养，那就是把原代培养中的细胞继续繁殖，让它们“生儿育女”。
这就像一个大家庭，越来越壮大，热闹得不得了。
传代培养可以让我们获得更多细胞，方便后续的实验和研究。
3.2 传代培养的方法传代培养的关键在于及时分离细胞，咱不能让细胞们挤在一起，这样容易“打架”。
通常，当细胞长满培养皿后，就需要把它们分离开。
这个过程又得用到胰酶，跟原代培养一样，轻轻松松把它们从皿里“请”出来。
接下来，咱们需要把细胞分到新的培养皿里，再给它们加上新鲜的培养基，确保它们能继续健康成长。
注意，细胞们需要一点时间适应新环境，就像搬家后要习惯新居的味道一样。
原代和传代细胞的培养和维持
原代和传代细胞的培养和维持一、原代细胞的培养与维持1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%～80%．在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。
贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。
其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。
2、悬浮细胞的培养凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞．若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失），待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。
悬浮细胞在未达到饱和密度时，但培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求时，只能采用半量换液的方式．二、原代细胞培养的首次传代 (Subculture)这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。
每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代细胞系）。
传代细胞系的建立，关键是初代培养的首次传代。
应注意如下几点：(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代。
(2)原代培养的贴壁细胞多为混杂细胞，形态各异，往往是上皮样细胞和成纤维样细胞并存，采用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间，因成纤维细胞易于脱壁，上皮细胞不易脱壁，因此，可根据需要选用适当的消化时间及时中止消化。
骨髓间充质干细胞-MSC-原代培养与传代培养
骨髓间充质干细胞(MSC)原代培养与传代培养准备工作（1）试管、试管架、滴管、吸管、小鼠固定架、玻璃瓶、玻璃皿、烧杯、橡皮头、剪刀、镊子、纱布、棉球、酒精灯、滴管、移液器、细胞计数器、生理盐水、PBS、双抗（青链霉素）、75%酒精、95%酒精、培养瓶（50ml，260ml）。
（2）BALB/C小鼠（4~5周龄，18~22g，雌雄不限）、胎牛血清（灭活）、DMEM-LG 培养液（美国GIBCO）（3）针头与注射器：4.5号、7号针头（冲小鼠股骨、胫骨和肱骨骨髓，制单细胞悬液）。
实验前准备（1）实验室消毒，隔离衣消毒，小鼠固定架消毒。
配10%FBS培养液，加双抗（内含青霉素、链霉素各100μg/ml）。
（2）用75% 酒精擦拭无菌操作台面，取各种已消毒的培养用品置于超净台面，无菌室及超净台用紫外灯照射30~60 分钟灭菌。
（3）开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
穿隔离衣，戴手套。
用70% 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10 分钟后，才可开始实验操作。
点燃酒精灯，安装吸管帽。
实验步骤（1）BALB/C纯系小鼠脱臼处死后，75%乙醇浸泡5min后，在无菌操作台上无菌条件下分离双侧股骨及胫骨，在含生理盐水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织，剪去包括骺板在内的两侧骺端，用10ml注射器（配4.5号针头）抽取适量含10%FBS的完全培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶。
依次用7号针头和4.5号针头（或依次过21、23、25号）反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液。
细胞悬液在1000rpm离心5min后收集细胞或进行密度梯度离心。
（2）将单细胞悬液于1:2比例加到含1.082比重Percoll细胞分离液的离心管中，4℃条件下，经500g密度梯度离心25min，小心收集离心液界面上乳白色云雾状的单核细胞层，加入等量无血清培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）充分洗涤（500g离心5min或180g离心10min）2次，去上清，用10%FBS的培养基悬浮细胞（用0.83%氯化胺破碎红细胞，培养液重悬细胞）。
细胞培养的方法及注意事项
细胞培养的方法与注意事项细胞培养是将动物某一器官、组织如肝脏、肺、肾脏等取出，将其分散成单个细胞，在人工条件下，使之存活、生长和增殖的技术。
细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养：第一次培养，将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物，不更换培养物的生长器皿的培养过程。
传代培养：在培养过程中培养物分裂生长，长满培养空间，细胞之间相互接触而发生接触抑制，生长速度减慢甚至停止。
在这种情况下，需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿中，再进行培养一、原代培养的方法：1、取材对于水产动物，取材的方法为：无脊椎动物取材用消毒海水或淡水暂养24小时；用酒精棉消毒体表；解剖需培养的组织和器官，放到消毒液中处理一段时间；取出，用灭菌BSS清洗3次鱼的取材用酒精棉消毒体表；打开腹腔（注意不能碰破肠道）；体表组织，处理方法同无脊椎动物。
原代培养过程技术路线图：①准备工作：实验台面用紫外灯照、70%酒精棉球擦；所用各种器械、培养液无菌；操作者用新洁尔灭和酒精擦手，穿衣、戴帽、口罩；实验动物体表用酒精消毒或放入无菌海水中。
②取材：在无菌条件下取出需要培养的器官或组织；如果是有菌的器官或组织需进行灭菌处理；取材要准确③培养材料的制备：欲培养的器官或组织洗去血污，剔掉多余成分。
剪成1mm3大小，用于外置块培养。
用胰蛋白酶消化，终止消化后，机械法吹打组织块，筛网过滤，过滤液离心1000rpm,10min，用培养液悬浮细胞，计数细胞密度，用于细胞培养。
④接种：外植块：用吸管将小的组织块均等地在培养瓶底排列好；反过培养瓶加入培养基，或5-6h后再加培养基；放入CO2培养箱培养；2-3d更换培养液或颜色变黄时更换；记录、每2-3d观察。
结果：1-3d，细胞从外植块中迁移出来分离细胞：将已分散的细胞悬液加到培养瓶或培养板中，并加少量培养液,细胞浓度为105-106个/ml。
不能少于5000个。
24h后加足培养液（防漂浮）。
原代细胞培养和传代培养的方法
原代细胞培养和传代培养的方法原代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏1实验原理细胞培养可分为原代培养和传代培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
2实验方法一：材料小鼠，生理盐水，100ml灭菌烧杯，15ml离心管，培养皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网，泡沫板，大头针，酒精灯，培养瓶，培养液，PBS，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜，显微镜，计数板，离心机，恒温水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮罐，冻存管，冻存液，废液缸等。
二：方法（1）原代培养：1.取出小鼠后沥干酒精，放入超净台内，固定在泡沫板上。
2.用镊子提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤一个横切口，将皮肤向上撕开，然后剪开肌肉等，暴露出腹腔，在左侧找到脾脏，用弯头眼科镊取出脾脏，置于无菌培养皿中。
3.用生理盐水将取出的脾脏清洗多次，并剔除多余无用的组织。
4.将筛网置于平皿中，脾脏置于筛网上，用弯头镊镊住，轻轻在筛网上进行碾磨，同时不停滴加不含血清的培养液冲洗。
5.将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中，离心(1000rpm,5min)，吸去上清（去除血液等）。
6.加入10ml培养液，吹打混匀，取样计数。
7.将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，轻轻摇晃混匀，在培养瓶上。
面做好标志，注明细胞、组别及日期。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
初代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
初代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项1.组织获得:收集组织样本，并用无菌技术分离细胞。
组织样本可以通过活体组织采样、细胞培养物或冻存细胞获得。
2.细胞分离:使用酶或机械方法，将组织分解为单个细胞。
酶消化可以使用胰蛋白酶、胶原酶等，机械方法可以使用刮刀或组织切割器。
3.细胞培养:将细胞转移到含有适当营养物质和细胞因子的培养基中。
常用的培养基包括DMEM、RPMI-1640、MEM等。
4.培养条件:细胞应保持在适当的培养条件下，包括温度、湿度、CO2和O2浓度以及pH值等。
传代培养的方法：1.剥离细胞:轻轻地将细胞从培养底物上剥离。
可以使用胰蛋白酶或EDTA来辅助细胞剥离。
2.细胞计数:使用显微镜和细胞计数板，计算细胞的数量。
3.细胞传代:将细胞转移到新的培养底物中。
选择适当的培养底物和培养条件，以确保细胞的正常生长和增殖。
4.细胞恢复:细胞传代后，需要一段时间来恢复和适应新的培养条件。
在这段时间内，细胞可能会出现一定程度的生长停滞或损伤。
注意事项：1.无菌操作:在进行细胞培养时，必须保持严格的无菌操作，以防止细胞污染和细菌、真菌、病毒等微生物的污染。
2.培养基配方:不同类型的细胞对培养基中的成分和细胞因子的需求有所不同，因此必须使用适当的培养基。
3.培养条件控制:细胞对培养条件非常敏感，包括温度、CO2浓度、湿度等。
必须确保这些条件处于合适的范围内。
4.细胞密度控制:细胞密度对细胞生长和增殖有重要影响。
过高的细胞密度可能导致细胞死亡，而过低的细胞密度可能导致细胞转分化。
5.传代次数限制:细胞在传代培养中会出现累积的突变和基因改变，因此应限制传代的次数，以确保细胞的稳定性和一致性。
6.细胞检测和验证:在进行细胞传代培养之前和之后，应对细胞进行检测和验证，以确保细胞的纯度和正常生长。
细胞培养是一项复杂的技术，需要细致的操作和严格的条件控制，以确保细胞的正常生长和稳定性。
遵循适当的方法和注意事项，将有助于提高细胞培养的成功率和可靠性。
原代培养和传代培养的理解
一、原代培养和传代培养1、原代培养定义：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、化学试剂或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
注意：人体是复杂的，一般从器官取出的组织都是很多类型细胞混合组成的（规范的说是多克隆，定义见下一条），也就是有很多种类型的细胞，基本上是不可能提取出来一种类型的细胞（单克隆）的，那个概率太小了。
TIPS：克隆在细胞培养中的定义：是原代培养开始时，揪出来的那一坨组织中的细胞类型数，有一种类型就是单克隆，两种类型就是两个克隆，很多类型就是多克隆（比如你肌肉组织，里面不但有肌肉细胞还有神经细胞，于是就是双克隆）2、传代培养定义：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
记住：神经细胞等终末分化细胞是没有传代培养的，因为它们无法复制注意：十代之前为原代，十代之后为传代的说法是完全可以的，但这是一个经验规律（一般细胞培养十代长满培养基），不具有普适性，但做题的时候用的基本上都是这个，不要杠精，特殊说明除外。
TIPS:癌细胞是一种特殊的细胞，它不具有贴壁生长特性，还不具有接触抑制作用，所以临床上常说癌细胞具有扩散性细胞系：直译就是细胞的集合，实际意义是进行传代培养后（这是前提！！！），对原代培养所使用的那一坨组织的称呼。
二、分离：酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶1、胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水解作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开。
为什么不用胃蛋白酶？因为胃蛋白酶最适PH值2.0左右，而且胃蛋白酶很生猛，消化完不但细胞之间连接没了，细胞也没了。
乳鼠肾细胞的原代培养、传代培养
乳鼠肾细胞的原代培养、传代培养目的要求一、了解细胞原代培养、传代（继代）培养的基本方法和操作过程。
二、初步掌握培养过程中的无菌技术。
三、掌握在例置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。
用品超净工作台恒温培养箱普通显微镜例置相差显微镜水浴箱、离心机解剖剪、眼科剪镊子（尖头、平头和有钩镊）烧杯培养瓶离心管吸管血球记数板酒精灯单个仪器逐个弹出在屏幕上，小器械逐个弹出在超净台上培养用品RPM1 1640培养液（含小牛血清及青、链霉素）试剂库弹出具体内容酒精冻存培养液胰蛋白霉---⎪⎪⎭⎪⎪⎬⎫75%PBS 0.25%RPM1 1640、0.25%胰蛋白霉、PBS ，冻存培养液微热字显示动物细胞及细胞系 新生乳鼠（小鼠） 中国仓鼠卵巢细胞（CHO ） 人宫颈癌细胞（HELA ）以上三个也为热字显示乳鼠肾细胞原代培养方法1—单层细胞培养法 所有组织中都有一定量的细胞间质（纤维和基质等），对细胞生长有妨碍作用，用胰酶消化能出去间质，使组织松散成单个细胞或小的细胞团，细胞易于生长。
步骤1．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
2．点燃酒精灯，用品按布局放置，安装吸管等3．取材取新生乳鼠一只，采用颈椎脱臼法处死，然后把这个小鼠进入盛有75%酒精的烧杯中2-3秒，随即携入超净工作台内。
在超净工作台内取出小鼠，置于消毒培养皿中打开消毒器械包用镊子掀起乳鼠腹部皮肤，用解剖剪剪开腹腔，充分暴露腹腔，用另一镊子轻轻夹起肠管，翻置一侧，充分暴露位于腹腔背壁脊柱两侧的肾脏取下双侧肾脏，放入消毒培养皿中用吸管吸取PBS加入培养皿中，清洗肾脏3次，尽量去掉血污再将肾组织用解剖剪剪成几块再用PBS漂洗，去净血液为止4．消化将洗净的组织块移入消毒小瓶中（如毒霉素瓶）用眼科剪深入瓶内反复剪切组织直至0.5mm大小的组织块加入5-8倍量（体积）的0.25%胰蛋白酶，盖好放入37︒C水浴中消化20-30分钟，注意应每隔5分钟振摇一次。
原代培养和传代培养名词解释
原代培养和传代培养名词解释咱今儿个就来讲讲原代培养和传代培养这俩词儿。
你说这原代培养啊，就好像是盖房子打地基。
咱从生物体里把那些个细胞啊，组织啊，小心翼翼地取出来，就跟宝贝似的，给它们找个合适的地儿安置下来，让它们能好好地生长发育。
这就好比是给小树苗找了块肥沃的土地，让它能扎根发芽。
这原代培养可不简单呐，得精心呵护着，给它们提供适宜的环境，温度啦、营养啦，一个都不能少，就盼着它们能茁壮成长呢！你想想，要是没弄好，那不就白费功夫啦！再来说说这传代培养，它就像是小树苗长大了，要分枝散叶啦！原代培养出来的细胞长到一定程度，咱就得给它们来个分家，把它们分到新的培养器皿里去，让它们继续繁衍后代。
这就好像家里孩子多了，得给他们分房间住一样，不然挤在一起可不行。
这传代培养也有讲究呢，得把握好时机，不能太早也不能太晚。
太早了，它们还没准备好；太晚了，又怕它们长得太挤了不舒服。
你说这细胞培养是不是挺有意思的？就跟养孩子似的，得时刻操心着。
有时候还真得有点耐心和细心，不然一不小心就前功尽弃啦！咱做实验的不就盼着能培养出好的细胞来，得出好的数据嘛。
原代培养和传代培养，它们可是细胞培养里的重要环节啊！少了谁都不行。
没有原代培养，哪来的细胞可以传代呢？没有传代培养，细胞怎么能大量繁殖呢？这就好比是做饭，原代培养是准备食材，传代培养就是烹饪的过程，只有两者都做好了，才能做出美味的佳肴来。
咱再想想，如果没有这两项技术，那好多医学研究、药物研发可怎么办呢？那岂不是像没了翅膀的鸟儿，想飞也飞不起来啦！所以说啊，原代培养和传代培养可真是太重要啦！它们为科学研究提供了坚实的基础，让我们能更深入地了解细胞的奥秘，为人类的健康事业做出贡献呢！总之，原代培养和传代培养是细胞培养中不可或缺的两个部分，它们相互配合，共同推动着科学的进步。
咱可得好好重视它们，让它们发挥出最大的作用呀！。
原代细胞和传代细胞名词解释
原代细胞和传代细胞名词解释嘿，你知道吗，在细胞的世界里，有原代细胞和传代细胞这两个重要的角色呢！咱就说，原代细胞啊，那可是直接从生物体组织里分离出来的“小宝贝”呀！就好比是刚从果园里新鲜采摘下来的水果，带着最原始的味道和活力。
比如说，从一只可爱的小老鼠身上取下来的细胞，这就是原代细胞啦！它有着独特的性质和特点呢，就像每个孩子都有自己独一无二的个性一样。
而传代细胞呢，则是原代细胞经过培养后传代培养出来的。
这就好像一棵小树苗，经过不断地培育和繁衍，变成了一片小树林。
想象一下，原代细胞是最初的那颗种子，而传代细胞就是从这颗种子生长出来的众多小树。
它们之间有着密切的联系，但又有着不同之处。
原代细胞很珍贵呀，为啥这么说呢？因为它更接近生物体本身的状态呀，能给我们提供最真实的信息。
就像你要了解一个地方的风土人情，肯定是找当地原汁原味的居民去了解更靠谱呀，对吧？传代细胞呢，虽然可能在培养过程中会有一些变化，但它们也有着自己的用处呀，比如可以进行更大量的实验研究。
你看，这原代细胞和传代细胞是不是很有趣？它们就像细胞世界里的两颗明星，各自闪耀着自己的光芒。
我们研究它们，了解它们，不就是为了能更好地探索生命的奥秘吗？所以呀，可别小瞧了它们哟！我觉得呀，它们真的是太重要啦，对于我们了解生命、攻克疾病等都有着不可替代的作用呢！。
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（二）悬液细胞的传代培养
（1）取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管
把培养瓶中的细胞吹打均匀。 （2）转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离 心（1 000r/min）5min。 （3）在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养 液，用吸管吹打细胞，制成悬液。 （4）以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标 记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 ℃ CO2培
细胞培养用的玻璃器材
培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒 和铁筒中，干热或湿热灭菌后备用
手术器材、瓶塞等
15磅，121℃，20分钟蒸气灭菌 DMEM培养液、消化液、PBS液等 用滤器过滤后备用
方法与步骤（举例:心肌细胞消化培养法）
（1）动物处死：将出生2～3d乳鼠，用拉颈椎方法 处死。腹部向上钉在蜡盘中，用碘酒和酒精棉球 擦拭腹部消毒。 （2）剪取心脏：在无菌条件下将心脏（心尖）取 出，置于无菌培养皿中，用Hanks液洗涤1-2次去 除血污；放入另一培养皿中，纵向剪开心脏，仔 细去除心腔内血污后剪成1mm3大小的组织块，再 并用Hanks液洗涤2～3次，直到液体澄清。
(2)与临床联系好手术时间后，立即做好如下准备 工作：准备好1-2个贮有培养液和抗生素的标本收 集瓶，将盖盖紧，保持无菌，瓶外贴上标签，写 上工作人员名字、地点和电话号码；将收集瓶送
往医院，并与医生和护士讲清截取手术标本的部
位及注意事项。
(3)标本放入收集瓶后，送出手术间，立即送往 组织培养实验室。工作人员最好是等在手术间外。 但有时手术时间难以掌握。则请护士将收集材料 的瓶子盖好后，放入4℃冰箱，尽快打电话通知 工作人员。 (4)取临床标本时，虽然尽可能做到无菌操作， 但仍有污染可能性的存在。可选用抗生素类控制 污染。如手术标本比较大（约200mg以上），可 将其浸于70%酒精中约30-60秒，这样会减少表面 污染而不损坏内部组织的结构和存活。不要用纱 布包裹标本，纱布纤维易粘附在组织上。
传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或1:3比
率转移，接种到另一培养瓶的培养。
贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化，
把细胞分散成单细胞再传代。
悬浮型生长细胞则用直接传代法或离心法传代。
方法与步骤
（一）贴壁细胞传代培养
（1）选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精
灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的DHanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在 细胞表面的碎片(思考：还有什么作用？） （2）加入适量0.１％－ 0.25％胰蛋白酶消化液， 室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收 缩突起出现空隙时，倒去酶液。
第五章 细胞的原代与传代培养
一、原代培养 概念：取自体内新鲜组织并置于体外条 件下生长的细胞在传代之前称为
原代培养。
原代培养技术的重要意义:
原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性
状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，
而且大多数细胞表现出原来组织的特性。
利用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞
（4）计数与稀释：从过滤的细胞悬液中取出1ml滴于 血细胞计数板上，按白细胞法进行计数；计数后用 培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含30 ～ 50万个细胞为宜。
（5）分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于细胞 培养瓶中，盖好瓶盖，在培养瓶上做好标记，置于 37℃的CO2培养箱中培养。 （6）观察：逐日检查培养物是否污染，观察细胞生 长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行 传代培养。
养箱培养。
（5）观察：细胞培养24h后，即可进行观察。
传代细胞培养结果
一般情况，传代后的细胞在2小时左右
就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可
在瓶内形成单层，需要再次进行传代
三、人体活检(或手术)材料
(1) 在准备以临床材料为实验材料时,要预先与
临床外科医生和护士商量,并做好一切必要的准备
工作。争取拿到新鲜、无菌、少坏死的标本。
（3）用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹
打细胞，使其成细胞悬液。
（4）以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标
记，注明代号、日期，轻轻摇匀， 37 ℃CO2
培养箱培养。
（5）观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜
色及细胞的生长情况。
VSMCs传代培养第1天和第3天（×100）
需要注意的事项：
整个取材过程中，都要注意保持组织的湿润，随 时给组织块滴加一些培养液或平衡盐溶液。一般 情况下，最好是使用冰冷的液体。
在剪碎或切割组织块时，尽量使用锋利的刀剪， 防止以钝器对组织揉、捻、撕、拉等而造成细胞 损伤。 整个取材过程耗时越短越好。在万不得已的情况 下，取材后也可将组织贮存在冷的(4℃)含平衡盐 溶液(或其它缓冲盐溶液)的营养液中，最好不超 过24～48h(视不同组织类型而定)。
分化及病毒学方面的试验效果很好。 原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过 的阶段。
原代培养
消化法
贴块法
冷消化 温消化
一次性消化 分次消化
消化法：这种培养过程主要是采用无菌操作 的方法，把组织（或器官）从动物体内取出， 经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人 工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。
原代细胞培养结果:
细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并
开始生长 如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可 形成单层
细胞原代贴块培养法
贴块培养步骤图解
VSMCs原代培养第4天和第9天（×100）
二、传代细胞培养
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一 段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中， 细胞倍增3～6次 离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细 胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不 及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。
原 代 培 养 方 法 分 类
贴块法
消化法
93
分次消化
消化法的分类
解离释放细胞的方法
最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞 法以及螯合剂解离细胞法。
用酶学解离细胞法解离细胞是体外培养动物 细胞时分散组织的基本方法，最常用的消化 酶是胰蛋白酶和胶原酶两种。
动物细胞原代培 养流程的示意图
器材和液体的准备
（3）消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入无 菌三角烧瓶内，加入5～6倍量的0.1％胰蛋白酶液 （pH7.4 ～ 7.6），置37℃恒温磁力搅拌器上分次 消化：每次消化8-10分钟。在超净台块基本消化完全。 各管配平后离心，收集细胞，无血清培养液洗 2-3次后，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一 烧杯中。