GSH-Px活力的测定SOP

主要目的：

——测定物质谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px ）活力。

主要原理：

——谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px ）可以促使过氧化氢（H 2O 2）与还原性谷胱甘肽（GSH ）反应生成H 2O 及氧化性谷胱甘肽（GSSG ）,谷胱甘肽过氧化物酶的活力可用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力。

H 2O 22O+GSSG

GSH-Px 的活力以催化GSH 的反应速度来表示，由于这两个底物在没有酶的条件下，也能进行氧化还原反应（称为非酶促反应），所以最后计算此酶活力时必须扣除非酶促反应引起的GSH 减少的部分。而GSH 含量的测定可以跟据GSH 和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离子呈现较稳定的黄色，在412nm 处测其吸光度即可计算出

实验室签章

一、试剂

——谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒（南京建成生物研究所）

二、仪器设备

——96孔酶标板

——UV-Vis可见多功能酶标仪

——旋涡混匀器

——离心机

——水浴锅

——移液枪及其相应量程枪头

三、实验方法

根据试剂盒说明书具体操作步骤如下:

1. 非酶管和酶管各加入1 mmol/LGSH 0.2 mL ，酶管加入稀释后的待测血清和组织匀浆液0.2 mL ，37 ºC 水浴预温5分钟，酶管和非酶管分别加入试剂一应用液0.1 mL ，37 ºC 水浴准确反应5分钟，酶管和非酶管分别加入试剂二应用液2 mL ，同时非酶管加入待测细胞上清液0.2 mL 。混匀，3500-4000转/分，离心10分钟，取上清1 mL 作显色反应。

2. 空白管加入1 mL GSH 标准品溶剂应用液，标准管加入1 mL 20 μmol/LGSH 标准液，非酶管和酶管各加入上一步骤1 mL 上清液，然后空白管、标准管、非酶管和酶管各加入1 mL 试剂三应用液，0.25 mL 试剂四应用液和0.05 mL 试剂五应用液。

3. 混匀，室温静置15分钟后，在412 nm 处将酶标板空板进行扫描，准确吸取 0.2 mL 各管反应液加入到新的96孔板中，酶标仪测定各孔吸光度（OD 值）。

4. 血清中GSH-Px 活力计算公式

GSH-Px 活力（U/mgprot ）--OD =

非酶管值酶管OD 值标准管OD 值空白管OD 值

×标准品浓度（20 μmol/L ）×稀释倍数

组织中GSH-Px 活力计算公式

GSH-Px 活力（U/mgprot ） --OD =非酶管值酶管OD 值标准管OD 值空白管OD 值×标准品浓度×min 稀释倍数（5）反应时间（5)

÷[取样量（0.2 mL ）×待测组织蛋白浓度（mgprot/ mL ）]

参考文献

Oliveira Lazarin M, Ishii-Iwamoto E L, Yamamoto N S, et al. Liver mitochondrial

function and redox status in an experimental model of non-alcoholic fatty liver disease induced by monosodium L-glutamate in rats [J]. Experimental and molecular pathology, 2011, 91(3): 687-694.