镉胁迫对拟南芥的毒害作用及自噬现象的观测_高玲

自噬现象的观测

高玲1,2*，张卫娜2,4*，陈文利2,3

1.青岛农业大学生命科学学院，山东青岛266109；

2.华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室，广州510631；

3.华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广州510631；

4.广东省农业科学院，广州510640

收稿日期：2011-03-23；接受日期：2011-04-29

基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0829)，广东省科技攻关项目(2007A020300008-6)，华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室开放课题基金项目

通讯作者：陈文利，电话：(020)85211436-8512，E-mail ：chenwl@

*并列第一作者

摘要：镉离子(Cd 2+)具有强植物毒性，可抑制植物生长，甚至导致植物死亡。为了研究重金属镉对拟南芥的毒害作用，采用叶绿素荧光技术、流式细胞技术、激光共聚焦技术及半定量RT-PCR 技术，检测光合参数的变化、活性氧(reactive oxygen species ，ROS)的累积、自噬的发生，以及病原相关蛋白（pathogenesis-related protein ，PR ）基因表达的变化。实验结果显示，随着

50μmol/L CdCl 2处理时间的延长，ROS 和Cd 2+在细胞中大量积累。而在镉胁迫的初期，会观察到自噬的发生及PR 基因表达的变化。说明植物受到外界Cd 2+作用的初期，会通过自噬及增强PR 基因表达来抵抗外界胁迫。但随着处理时间的延长，植物细胞内累积了大量的ROS 和Cd 2+，当植物不足以通过自噬途径抵抗胁迫时，就会导致生长受阻，最终对光合系统造成损伤。

关键词：镉；活性氧；自噬；叶绿素荧光；流式细胞技术

中图分类号：Q945，Q947

DOI ：10.3724/SP.J.1260.2011.00676

引言

近年来，工业、矿业生产中产生的大量重金属被释放到环境中，镉(Cd )即是其中之

一。大量研究表明，镉是环境中的主要重金属污染源，是对植物毒性最强的元素之一。镉毒害同其它逆境一样，主要伤害机制之一是影响植物体内活性氧(reactive oxygen species ，ROS )和自由基的代谢平衡，引起ROS 和自由基的积累，产生膜脂过氧化作用，导致植物的中毒甚至死亡[1]。植物体内的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD )和过氧化氧酶(catalase ，CAT )等保护酶对ROS 及自由基的清除能力，是决定其逆境抗性的重要因素之一[2]。镉胁迫成为各种生物面临的一种新挑战。植物和藻类细胞虽然可以耐受一定量的镉胁迫[3]，但过量的镉会直接或间接地抑制植物体的生理过程，如呼吸作用、光合作用和氮代

生物物理学报2011年8月第27卷第8期:ACTA BIOPHYSICA SINICA Vol.27No.8Aug.2011:676-686

676-686

676

ROS的产生及基因表达的变化。在分子水平，镉能够影响巯基(-SH)和金属鳌合键的形成

与分离、蛋白质的二级结构和细胞内氧化还原状态的改变，还会影响植物对其生长所必须

的金属元素的吸收、转移和代谢[8]。另外，在生物体内，镉能使在氧化还原或电子转移过程

中发挥重要作用的金属蛋白质发生毒化，致使自由基增多，导致蛋白质、脂类及其它生物

分子发生非特异性破坏[9]。但目前对于镉胁迫引起植物细胞死亡的机制依然不明。本实验以作为影响因子，采用叶绿素荧光技术、流式细胞技术、激光共聚焦技术及半定

外施CdCl

2

溶液处理的不同时间点，检测拟南芥生长及其光合参数的变化、

量RT-PCR技术，在CdCl

2

ROS的积累、自噬的发生，以及相关基因的表达情况，为监测重金属胁迫对植物的损伤作用

提供简单便捷的方法，同时为揭示植物对Cd2+的响应机理提供实验依据。

材料和方法

拟南芥的培养和原生质体的分离

拟南芥种子哥伦比亚野生型和突变体atg2(购买于The Nottingham Arabidopsis Stock

Centre，由于ATG2基因的缺失，突变体不能发生自噬现象，且正常生长条件下也会表现出

早衰现象)，经1%次氯酸钠溶液表面消毒后，用无菌水浸泡，置于4℃冰箱低温春化

处理3d。播种后在人工培养室培养，培养条件为16h光照、8h黑暗，光照强度

120μmol/L·m2·s，温度22℃，相对湿度82%。待幼苗长至28～35d左右时，取大小均一、

生长一致的植株进行相关实验[10]。

提取原生质体时，用锋利的刀片将拟南芥叶片切割成0.5～1mm的长条。将大约10～

20个叶片溶解于5～10ml的酶解液〔1%～1.5%纤维素酶R10(Yakult Honsha，Tokyo，

Japan)，0.2%～0.4%离析酶R10(Yakult Honsha，Tokyo，Japan)，0.4mol/L甘露醇，

20mmol/L KCl，20mmol/L MES(pH5.7)，10mmol/L CaCl2〕中，抽真空20～30min后，

置于黑暗中继续酶解3h。用孔径为35～75μm的尼龙网过滤，加W5溶液〔2mmol/L

MES(pH5.7)，154mmol/L NaCl，125mmol/L CaCl2，5mmol/L KCl〕，使细胞悬浮，100g

离心力下离心3min，重复离心三次，将下层原生质体小心地悬浮于W5溶液中，悬浮浓度

1～2×105/mL[11,12]。每组实验重复三次。

实验方法

叶绿素荧光参数的测量

应用Imaging-PAM便携式叶绿素荧光仪(Walz，Germany)，测定不同实验组叶片的叶

绿素荧光参数。测定前，将叶片放置到Imaging-PAM型荧光仪匹配的暗适应夹中适应25～

30min。测定时，将拟南芥的叶片放置到样品室，打开检测光(0.1μmol/m2·s)，测定初始荧

光(F o)；然后照射饱和脉冲光(3000μmol/m2·s)，每2.5s1个脉冲，测定最大光化学效率

677

｜ACTA BIOPHYSICA SINICA