实验14-细胞凋亡的诱导和检测
细胞凋亡、坏死、细胞活性检查常见方式及试剂
线粒体膜电位指示染料线粒体膜电位的下降是细胞凋亡初期的一个标志性事件. 它在凋亡进程中与caspase 活化同时发生并先于磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻。
基于以上研究，Biotium 研发了各类的新型的荧光探针用于测量线粒体膜电位。
MitoView ™ 633MitoView ™ 633 是一种新型的用于测量线粒体膜电位的深红染料(激发光/发射光622/648 nm)。
利用NucView ™ 488 和MitoView ™ 633 凋亡检测试剂盒能够在荧光显微镜(图.1)或流式细胞仪(图.2、3)下同时进行线粒体膜电位和caspase-3活性的检测。
图 1. 利用MitoView ™ 633进行活细胞染色:Hela 细胞图 2. 流式细胞仪分析：Jurkat 细胞一组用CCCP 使线粒体去极化，另一组利用staurosporine 作为凋亡诱导剂。
利用MitoView ™633 染色图3. 流式细胞仪分析：对照（A）与经staurosporine 处置(B)的Jurkat 细胞（JC-1 染色）. FL1 (x- 轴) 为绿色荧光; FL2 (y-轴) 为红色荧光。
(A 图) 较高的红绿荧光比例说明线粒体膜电位未下降. （B 图）较低的红绿荧光比例说明：由于staurosporine诱导了凋亡的发生，细胞的线粒体膜电位大幅下降。
JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒JC-1通常被用于检测细胞中线粒体膜电位的转变。
在健康细胞中,JC-1以聚合体(J-aggregates)，的形式存在在线粒体基质中，能够产生红色的荧光(激发光/发射光585/590nm)。
相反，在正在凋亡或坏死的细胞中，JC-1不能聚集在基质中，以单体的形式存在，从而发出绿色的荧光( 激发光/ 发射光510/527nm)，如此能够利用流式细胞仪和荧光显微镜、荧光计数仪通过测量荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的转变。
经常使用红绿荧光的相对照例来衡量线粒体去极化的比例。
细胞凋亡诱导技术的使用教程
细胞凋亡诱导技术的使用教程细胞凋亡是一种广泛应用于生物研究和药物开发领域的重要技术。
它是一种程序性细胞死亡的形式，通常由外界刺激或内源性信号引起。
本文将为您介绍使用细胞凋亡诱导技术的步骤、方法和注意事项。
第一步：选择适当的细胞凋亡诱导剂在进行细胞凋亡实验前，您需要根据实验目的和研究对象选择适当的细胞凋亡诱导剂。
常用的细胞凋亡诱导剂包括化学物质如顺铂和纤维芽细胞生长因子（FGF）等，以及光照、温度、药物等其他外界刺激。
确保所选的诱导剂具有稳定的活性和可重复性。
此外，在选择诱导剂时，还需考虑细胞类型和所需的凋亡研究重点。
第二步：确定适当的细胞系和培养条件选择适当的细胞系对于细胞凋亡实验至关重要。
不同类型的细胞对于细胞凋亡的响应可能不同，因此在开始实验之前，您应首先确认所选细胞系是否容易发生细胞凋亡。
一般来说，肿瘤细胞比正常细胞更容易发生凋亡反应。
此外，确定细胞的培养条件也是非常重要的。
不同的细胞系对培养基组分和培养条件的要求有所不同，在实验前应进行相关的优化。
第三步：优化诱导剂的浓度和处理时间在实验中，您需要确定诱导剂的最佳浓度和处理时间。
这些参数的选择应基于前期的实验数据和文献报道。
一般来说，使用较低剂量的诱导剂和较短的处理时间可以获得更为准确和可靠的实验结果，并减少不必要的细胞损失。
因此，在进行正式实验之前，先进行浓度梯度和时间梯度的预实验是非常重要的。
第四步：检测细胞凋亡的方法选择在细胞凋亡实验中，您需要选择适当的方法来检测细胞凋亡的程度。
常用的方法包括荧光染料染色、流式细胞术和电镜观察等。
荧光染料如荧光素酶染料（如Annexin V-FITC/PI染色）可用于进行早期和晚期凋亡细胞的区分，而流式细胞术则可提供关于凋亡细胞比例和细胞周期的详细信息。
根据实验需要和设备条件，选择适当的检测方法。
第五步：数据分析和实验结果解读在完成细胞凋亡实验后，您需要对结果进行合理的数据分析和解读。
根据实验所用的方法，计算并记录凋亡细胞比例、细胞周期等相关指标。
细胞凋亡
– 即c-myc给细胞两种选择：增殖或凋亡。当 生长因子存在，Bcl-2基因表达时，促进细 胞增殖，反之促进细胞凋亡。
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5.Bcl-2家族
– Bcl-2为凋亡抑制基因，存在于线粒体膜、
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2. 电子显微镜
– 电镜下观察，Ap细胞染色质固缩，常聚集 于核膜下呈境界分明的块状或新月形小体， 初期凋亡细胞可见完整的细胞器，细胞膜完 整，后期凋亡小体形成。目前一致认为，电 镜下获得凋亡细胞特征性的形态学改变是判 断细胞Ap的最可靠依据。
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1 Apo与AID
– 细胞生理性死亡对于机体清除自身反应性淋 巴细胞是十分重要的，Ap受阻在AID发病机 制中起重要作用。
– 研究结果表明，SLE病人血清中存在高水平 的可溶性Fas，它能与细胞膜上Fas蛋白 (APO-1)竞争性地与Fas配体结合，抑制Fas 介导的淋巴细胞的凋亡，导致大量自身抗体 的产生。
S)测定
– 正常细胞的细胞膜磷脂分布是不对称的，磷脂酰丝 氨酸（phosphatidylserine,PS）位于细胞膜内侧， 在细胞凋亡时转至细胞膜外表面，这一改变被认为 是特导性的，并且可作为凋亡细胞表面改变的标记。
– PS表面化发生于凋亡早期，其机制尚不清楚，可能 是一种导致机体吞噬凋亡细胞的信号。膜联蛋白V 是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和 力，荧光标记的膜联蛋白V与细胞表面PS结合，再 用荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，可以观察凋 亡过程中细胞膜PS的表面化。
中药诱导细胞凋亡的检测设计实验
中药诱导细胞凋亡的检测设计实验利用中药对细胞进行处理，通过检测细胞凋亡的相关指标，评估中药对细胞凋亡的诱导作用。
实验原理：细胞凋亡是一种正常的自我调节现象，在生命过程中起到重要作用。
细胞凋亡的损失和缺陷可以导致许多疾病的发生。
中药的一些成分可以诱导细胞凋亡，因此用中药处理细胞可观察到细胞凋亡的现象，从而评估中药对细胞凋亡的诱导作用。
实验步骤：1. 培养细胞：选择适合的细胞，以适合的条件培养至合适的数量。
2. 中药处理：将细胞分成两组，在其中一组加入适当浓度的中药，并在另一组中加入相同体积的培养基作为对照组。
3. 细胞采集：在处理后的48小时内，收集细胞。
4. 細胞凋亡检測：a. Annexin V-FITC/PI 双染：使用Annexin V-FITC和PI染色液，按照产品说明书称2x10^5个细胞，离心冲洗，去掉上清，加入100uL细胞及AnnexinV-FITC/PI染色液，20°C避光室静置15min。
再加入400uL等体积的PBS，离心冲洗一遍，去掉上清，重复此步骤一遍。
最后在冰箱4°C避光下保存，最好在24小时内进行测量。
b. TUNEL 染色：使用TUNEL染色问剂，依照说明书将细胞固定和染色，配合荧光显微镜观察细胞凋亡的现象。
实验结果：用flow cytometry 或荧光显微镜技术检测细胞的凋亡现象。
用流式细胞仪分析Annexin V-FITC和PI染色液染色的细胞，望文生义，各类细胞的凋亡状态如下：1.双阴性（固绿固红）：正常生长的、未神经死亡、未凋亡的细胞；2. Annexin V-FITC 表达阳性（固绿活红）：细胞凋亡前期，细胞外膜磷脂翻转，可以先看到细胞信号阳性，而PI胞质膜不破裂，不能进入细胞核，故前期的细胞活；3. PI 表达阳性（活绿固红）：细胞凋亡中后期，与初始阶段相比，磷脂翻转后，细胞膜破裂，PI从胞质溢出，可以进入细胞核，染色明显；4. Annexin V-FITC和PI 同时表达阳性（活绿活红）：细胞凋亡后期。
细胞凋亡检测技术的使用注意事项
细胞凋亡检测技术的使用注意事项细胞凋亡（Apoptosis）是一种正常的基因调控程序性细胞死亡过程。
它在生物体发育、组织修复以及免疫系统调节中发挥着重要作用。
因此，准确检测和分析细胞凋亡对于科学研究和临床诊断具有重要意义。
细胞凋亡检测技术的使用要求细致和准确，以下是一些使用注意事项。
1. 样本处理和细胞抗原表达的影响：在进行细胞凋亡检测时，样本的处理和细胞抗原表达水平会直接影响结果的准确性。
确保样本处理过程中的细胞收集和处理操作严谨，以避免细胞损伤或凋亡反应的异常。
此外，细胞表面的抗原表达水平在不同的细胞类型和状态下可能会有很大的差异，因此，在选择检测方法时应对不同的细胞类型和处理条件进行优化。
2. 正确选择适当的检测方法：细胞凋亡的检测方法多种多样，包括细胞色素c释放、DNA碎片化、磷脂外翻等。
在选择合适的检测方法时，应根据实验需求和被测细胞类型的特点进行合理的选择。
不同的方法有不同的优缺点，例如，某些方法可能适用于细胞培养液中的凋亡细胞检测，而另一些方法则适用于体外分离的凋亡细胞。
所以，根据实际情况和实验目的选择最适合的方法是非常重要的。
3. 标本处理的严谨性：细胞凋亡的检测过程要求标本处理过程非常严谨，尤其是对于实验中的组织或细胞培养样本。
任何可能影响结果的因素（如变性剂、酶处理、酸碱度等）应避免或最小化。
此外，应避免样本受到过高温度的影响，以免造成凋亡过程的不正常启动。
4. 控制实验条件的一致性：为了确保结果的稳定和可靠，实验的条件应保持一致。
包括培养基的成分和浓度、细胞的培养时间以及细胞密度等因素都应在不同的处理组中保持一致。
此外，应严格控制实验室温度和湿度等环境条件，以确保实验的可重复性和结果的准确性。
5. 合理设置负对照和阳性对照：细胞凋亡检测中，合理设置适当的对照组是确保结果准确性的关键。
负对照组是指未经处理或未经暴露于凋亡诱导剂的样本组，用于检测基线的细胞死亡情况。
阳性对照组是指使用已知凋亡诱导剂处理的样本组，用于验证技术的敏感性和有效性。
细胞凋亡实验报告
细胞凋亡实验报告细胞凋亡实验报告引言：细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在维持生物体内部平衡和发育过程中起着关键作用。
本次实验旨在通过细胞凋亡实验，探究不同因素对细胞凋亡的影响，从而进一步了解细胞凋亡的机制和调控。
材料与方法：1. 细胞系：使用人类肺癌细胞系A549作为实验对象。
2. 药物：选择化学药物紫杉醇（Paclitaxel）作为细胞凋亡诱导剂。
3. 细胞培养条件：将A549细胞系在含有DMEM培养基和10%胎牛血清的培养皿中培养，保持在37℃、5% CO2的恒温培养箱中。
实验步骤：1. 细胞培养：将A549细胞系接种于培养皿中，培养至细胞密度达到80%左右。
2. 细胞处理：将培养皿中的培养基抽取，加入不同浓度的紫杉醇处理液，分为高、中、低三个浓度组，每组设置相应的对照组。
3. 细胞观察：将处理后的细胞培养皿放回恒温培养箱中，培养24小时后观察细胞形态和数量的变化。
4. 细胞计数：使用显微镜观察细胞数目，并通过计数室内的细胞数目，计算细胞存活率。
5. 细胞凋亡检测：使用流式细胞仪检测细胞凋亡率，采用荧光染料标记细胞并进行分析。
结果与讨论：在本次实验中，我们观察到不同浓度的紫杉醇处理后，A549细胞的形态和数量发生了明显变化。
在高浓度组，细胞数量明显减少，细胞形态发生变化，出现细胞收缩和凋亡体的形成。
而在低浓度组，细胞数量减少较少，细胞形态变化不明显。
对照组中，细胞数量和形态均与处理组相似。
通过细胞计数的结果，我们计算出了细胞存活率，并发现随着紫杉醇浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。
这说明紫杉醇可以诱导A549细胞发生凋亡，并且凋亡率与药物浓度呈正相关。
进一步使用流式细胞仪检测细胞凋亡率，我们发现在高浓度组中，细胞凋亡率明显增加，而在低浓度组和对照组中，细胞凋亡率相对较低。
这与细胞存活率的结果相一致，进一步验证了紫杉醇可以诱导A549细胞发生凋亡的能力。
细胞凋亡是一种高度调控的细胞死亡过程，它在生物体内部平衡和发育过程中发挥着重要作用。
细胞凋亡检测细胞凋亡实验步骤检测方法
细胞凋亡检测,细胞凋亡实验步骤,检测方法一、定性和定量研究只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳;二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳,形态学观察透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法,Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测,AnnexinV/PI 双染色法流式细胞仪检测等;不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等;三、样品来源不同选择组织：主要用形态学方法HE染色,透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记,ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳;四、细胞凋亡检测1、早期检测:1 PS磷脂酰丝氨酸在细胞外膜上的检测2细胞内氧化还原状态改变的检测3细胞色素C的定位检测4 线粒体膜电位变化的检测2、晚期检测：细胞凋亡晚期中,核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA,产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段;对于晚期检测通常有以下方法：1 TUNEL末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记2 LM-PCR Ladder 连接介导的PCR检测3 Telemerase Detection 端粒酶检测3、生化检测：1典型的生化特征：DNA 片段化2检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记TUNEL等3TUNEL末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记4通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP 多为dUTP间接或直接接到DNA片段的3’-OH端,再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果;可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测;4、LM-PCR Ladder 连接介导的PCR检测当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少如活体组织切片时,直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化;通过LM-PCR,连上特异性接头,专一性地扩增梯度片段,从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段;此外,LM-PCR 检测是半定量的,因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较;如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA后,用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶TdT使DNA标记,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中DNA ladder的形成;上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征,但细胞受到其它损伤如机械损伤,紫外线等也会产生这一现象,因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰;需结合其它的方法来检测细胞凋亡;其它方法：1Telemerase Detection 端粒酶检测端粒酶是由RNA和蛋白组成,它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列,使细胞获得“永生化”;正常体细胞是没有端粒酶活性的,每分裂一次,染色体的端粒会缩短,这可能作为有丝分裂的一种时钟,表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号;研究发现,90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性;2mRNA水平的检测研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因,检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法;据报道,Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞cytotoxic T cells 等靶细胞;Bcl-2 和bcl-X 长的作为抗凋亡bcl-2 和bcl-X的调节物,它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活;用荧光定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确;通过检测fas, bax-alpha 和bcl-X 长的基因的mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测; 5、细胞内氧化还原状态改变的检测：正常状态下,谷光苷肽GSH作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂;细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原;这一反应在线粒体中尤为重要,许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除;当细胞内GSH的排除非常活跃时,细胞液就由还原环境转为氧化环境,这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低,从而使细胞色素C三羧酸循环中的重要组分从线粒体内转移到细胞液中,启动凋亡效应器caspase的级联反应;6、细胞色素C的定位检测细胞色素C作为一种信号物质,在细胞凋亡中发挥着重要的作用;正常情况下,它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中,凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆,结合Apaf-1 apoptotic protease activating factor-1后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9,后者再激活caspase-3和其它下游caspase; 7、线粒体膜电位变化的检测：1线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系2近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活,也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面;而一旦线粒体跨膜电位耗散,细胞就会进入不可逆的凋亡过程;3在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变,这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道PT孔道能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡;线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据：1若将纯化的正常的线粒体与纯化的细胞核在一起保温,并不导致细胞核的变化;但若将诱导生成PT 孔道的线粒体与纯化的细胞核一同保温,细胞核即开始凋亡变化;2形态学观察,看到细胞数目有限,统计学上的准确性受影响；3凝胶电泳检测DNA破坏了细胞的完整性也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例；4流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平的特征性变化;用于流式细胞仪检测的染料：PI、Hoechst、EB、DAPI、丫啶橙等,其中PI、Hoechst 最常用;PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA或RNA结合;但是PI不能通过正常的细胞膜,Hoechst则为膜通透性的荧光染料,故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏,这时可为PI着红色;正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色,但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形,淡兰色,内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色,或核呈分叶,碎片状,边集; 故PI着色为坏死细胞；亮兰色,或核呈分叶状,边集的Hoechst着色的为调亡细胞;PI和Annexin-V双标：磷脂酰丝氨酸PS正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期或细胞损伤时PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中; Annexin-Vgreen可以和磷脂酰丝氨酸PS特异性结合;因此细胞处于调亡或坏死时,Annexin-V可为阳性早期的坏死细胞可能为阴性;但是只有坏死的细胞PI是阳性五、形态学观察1、普通光学显微镜观察2、透射电子显微镜观察3、荧光显微镜观察1、普通光镜下观察：1用苏木素-伊红HE染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色凋亡细胞,正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色,坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失2Giemsa染色法、瑞氏染色法等,正常细胞核的色泽均一,凋亡细胞染色变深,坏死细胞染色浅或没染上颜色直接用倒置显微镜观察：1细胞体积变小,全面皱缩；2凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围;2、透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩;细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样,部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体;3、荧光显微镜常用的荧光染料：丫啶橙、PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI三种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区;紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光;1PI双染色法基本原理Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用;Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高;DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色;碘化丙啶PI是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而将细胞核染红;因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来;注意事项：细胞凋亡时,其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一,但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低,或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致;在分析结果时应该注意;六、细胞凋亡的分子生物学检测方法:细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段;然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下,在核小体单位之间被随机切断,形成180～200bp核小体DNA多聚体;DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶TdT的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法TUNEL;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染色;低分子量的DNA分离后,也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译nick translation,使低分子量的DNA标记或染色,然后分析凋亡细胞;TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用;过氧化物酶标记测定法原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛digoxigenin-11-dUTP在TdT酶的作用下,可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端,与dATP形成异多聚体,并可与连接了报告酶过氧化物酶或碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合;在适合底物存在下,过氧化物酶可产生很强的颜色反应,特异准确的定位出正在凋亡的细胞,因而可在普通光学显微镜下进行观察;毛地黄植物是地高辛的唯一来源;在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体,因而非特异性反应很低;抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1％,若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后,则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用;本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定;一试剂配制1、磷酸缓冲液PBS：磷酸钠盐50mM,NaCl 200mM;2、蛋白酶K200μg/ml,：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml;3、含2%H2O2的PBS缓冲液：H2O2 ；PBS缓冲液;4、TdT酶缓冲液新鲜配：Trlzma碱3.63g用HCl调节pH至,加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠29．96g和氯化钴0.238g;5、TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液76μl,混匀,置于冰上备用;6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠17. 4g；柠檬酸钠8.82g；ddH2O 1000ml7、％二氨基联苯DAB溶液：DAB 5mg；PBS 10ml,, 临用前过滤后,加过氧化氢至%;8、％甲基绿：甲基绿0.5g；0.1M乙酸钠100ml;9、100％丁醇,100％、95％、90％、80％和70％乙醇,二甲苯,10％中性甲醛溶液,乙酸,松香水等;10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体ONCOR二实验步骤1、标本预处理：1石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中,用二甲苯洗两次,每次5min;用无水乙醇洗两次,每次3min;用95％和75％乙醇各洗一次,每次3min;用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液20ug／ml,于室温水解15min,去除组织蛋白;用蒸馏水洗4次,每次2min,然后按下述步骤2进行操作;2冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中,于室温固定10min后,去除多余液体;用PBS洗两次,每次5min;置乙醇：乙酸2：1的溶液中,于-20℃处理5min,去除多余液体;用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作;3培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约5 × 107个/ml细胞于4％中性甲醛室温中固定10min;在载玻片上滴加50～100μl细胞悬液并使之干燥;用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作;2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS,于室温反应5min;用PBS洗两次,每次5min;3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体,立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液,置室温1～5min;4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体,立即在切片上滴加54μl TdT酶反应液,置湿盒中于37C反应1hr注意：阴性染色对照,加不含TdT酶的反应液;5、将切片置于染色缸中,加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液,于37℃保温30min,每10min将载玻片轻轻提起和放下一次,使液体轻微搅动;6、组织切片用PBS洗3次,每次5min后,直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,于湿盒中室温反应30min;7、用PBS洗4次,每次5min;8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的％DAB溶液,室温显色3～6min;9、用蒸馏水洗4次,前3次每次1min,最后1次5min;10、于室温用甲基绿进行复染10min;用蒸馏水洗3次,前两次将载玻片提起放下10次,最后1次静置30s;依同样方法再用100％正丁醇洗三次;11、用二甲苯脱水3次,每次2min,封片、干燥后,在光学显微镜下观察并记录实验结果;三注意事项一定要设立阳性和阴性细胞对照;阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本,阳性细胞对照可使用地塞米松1μM处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞;阴性对照不加TdT酶,其余步骤与实验组相同;一、吖啶橙简称AO荧光染色法原理：吖啶橙Acridine Orange是吖啶的衍生物之一;它是一种荧光染料,激发峰492nm,荧光发射峰530nmDNA,640nmRNA,它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间,而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上;在蓝光给502nm激发下,细胞核发亮绿色荧光约530nm,核仁和胞质RNA发桔红色荧光＞580nm;吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光,但细胞固定阻抑了这种结合,从而主要显示DNA、RNA两种核酸;1试剂AO贮备液：AO 50mg分析纯蒸馏水 50ml4℃冰箱保存4个月;Tris缓冲液：Tris 50mmol/LMgCl2 LKCl 25mmol/LAO工作液：将AO贮备液10:1用蒸馏水稀释,再用Tris缓冲液将AO稀释到μg/ml的终浓度;2操作步骤①取乙醇固定的细胞悬液,浓度为107/ml,1500r/min,5分钟,弃乙醇;②加入2ml AO工作液,室温染10分钟;③滴在载玻片上,加缓冲甘油封片;④在荧光显微镜下用吸收波长405nm,发射波长530-640nm观察;结果：活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光;凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体;二、Hoechst33258染色Hoechst33258为特异性DNA染料,,与A-T键结合,但在环境下则优先与RNA 结合,染色DNA时应调整染液的pH至,这种染料不溶于磷酸缓冲液；所以配制时必须先以蒸馏水溶解配成储存液在4℃中避光保存;本方法是用于培养细胞、细胞涂片或细胞甩片;试剂及配制1Hoechst33258贮存液：称取Hoechst33258试剂1mg,用20ml蒸馏水溶解后,滤过,4℃避光保存;用时蒸馏水10倍稀释成染色液;2 ,;3封片液：20mmol/L柠檬酸,50mmol/L 磷酸氢二钠,50%甘油;4细胞固定液：甲醇/冰乙酸3:1,现配;操作方法1原代细胞培养、细胞学涂片或细胞甩片机制制备的单细胞片;2细胞固定液4℃固定5min;3蒸馏水稍洗后,点加Hoechst33258染色液,10min;4蒸馏水洗片后,用滤纸沾去多余液体;5封片剂封片后荧光显微镜观察;结果：在荧光显微镜下,活细胞核呈弥散、均匀荧光,坏死细胞不被Hoechst 染色;出现细胞凋亡时,细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状蓝色荧光及明显核形态变化,如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞;三、甲基绿-派诺宁染色法一原理细胞凋亡和细胞坏死均可表现为细胞核固缩等细胞死亡形态,但两者发生机制不同;细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程,需要有细胞内蛋白酶的激活,细胞质内常有mRNA表达的增强;而细胞坏死是一种被动的细胞死亡过程,细胞质内常有RNA的损失;根据这一特点,可应用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性,使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染,如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞,呈阴性染色者为坏死细胞;二试剂及配制1. 组织固定液无水乙醇 600ml氯仿 300ml冰醋酸 100ml2.甲基绿纯化新购买的甲基绿需用氯仿进行纯化处理以去除甲基紫;方法是将2％甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗,加入氯仿20ml充分,使其内的甲基溶于氯仿中而呈紫红色;旋动分液漏斗下部的砂塞,慢慢把下沉带比红色的氯仿移去,再加入新的氯仿10ml,如此反复更换氯仿,直到无紫红色为止;该液作为贮存液,4℃保存;3.染色液甲基绿贮存液 5ml5%派诺宁水溶液 1ml蒸馏水 12mlL乙酸钠 18ml临用前配制,滤纸过滤;三操作方法1.新鲜取材组织置固定液中4℃固定3-6h或培养细胞、细胞学甩片固定10min;2.直接转入95%乙醇脱水和无水乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋;3.切片经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化至蒸馏水;细胞学涂片不用梯度酒精4.置染色液中室温下染色约1h;5.取出切片,不经水洗,用滤纸吸干多余染液;6.插入丙酮中迅速分化;7.转入丙酮二甲苯1:1稍洗;8.二甲苯透明2-3次;9.中性树胶封固;四结果光学显微镜下凋亡细胞固缩,细胞核呈绿色或绿蓝色着染,胞质呈红紫色着染,坏死细胞只有固缩细胞核呈绿色着染;观察时可用凋亡指数进行计数,即随机选择约10-20个视野每张切片约1000-2500个细胞,计数凋亡细胞百分率;四、TdT介导的dUTP缺口末端标记技术TUNEL原理：在机体内部随时都在发生着细胞的死亡;传统上用显微镜来观察细胞的死亡,其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成;但是这种现象出现的很晚,时间也很短暂;凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活,细胞自身的染色质或DNA被切割,出现单链或双链缺口,并产生与DNA断点数目相同的3ˉ-OH 末端;末端脱氧核糖核酸转移酶Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT可以将地高辛标记的dUTPDIG-dUTP标记至3’-OH末端,DIG-dUTP核苷酸结合在DNA断点部位,可以通过生物标记的抗地高辛抗体Anti-DIG-Biotin反应后,再结合链酶亲和素-过氧化物酶SABC,然后加入显色底物DAB予以显示;凋亡的细胞核呈棕黄色,从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞;试剂1.标记缓冲液Labeling Buffer5×浓度的TdT反应缓冲液,含有以下成分：500mmol/L二甲胂酸钾;10mmol/L CoCl2 氯化钴1mmol/L DTT二硫苏糖醇2.末端脱氧核糖核酸转移酶TdT,×20×204.封闭液Blocking Reagent5.生物素化抗地高辛抗体×100×100×2008.抗体稀释液9. 多聚赖氨酸或APES;10. 0.01M TBS,配法：1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克Tris和纯乙酸;11. DAB显色试剂;操作步骤1.样品处理1玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理;2细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定;用4%多聚甲醛/0.01M PBS室温下固定30-60分钟;0.01M PBS洗2分钟×2次;蒸馏水洗涤2分钟×2次; 3组织：有条件时应及时固定;常规4%多聚甲醛/0.01M PBS或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上,石蜡包埋;切片常规脱蜡入水脱蜡务必干净;2.新鲜配制3%H2O2,室温处理10分钟;蒸馏水洗涤2分钟×3次;3.标本片加0.01M TBS1:200新鲜稀释Proteinase K37℃消化5-15分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次;细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10-60秒钟;新鲜石蜡切片消化5-10分钟;陈旧石蜡切片消化10-30分钟;4.标本片加标记缓冲液Labeling Buffer20μl/片,以保持切片湿润;按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各1μl,加入18μl标记缓冲液中,混匀;甩去切片上多余液体后加标记液,20μl/片;置样品于湿盒中,37℃标记2小时;5.0.01M TBS洗2分钟×3次;6.加封闭液50μl/片,室温30分钟,甩掉封闭液,不洗;7.用抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体：取1ml抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μl,混匀后50μl/片加至标本片上;置样品于湿盒中,37℃反应30分钟;0.01M TBS洗2分钟×3次;8.用抗体稀释液1:100稀释SABC：取1ml抗体稀释液加SABC10μl,混匀后50μl/片加至切片;37℃反应30分钟;0.01M TBS洗5分钟×4次;显色;10.苏木素轻度复染;脱水,透明,封片;显微镜观察;结果判定细胞核固缩有的呈碎片状,不规则,大小不一致,呈棕黄色颗粒者为阳性细胞; 即凋亡的细胞TUNEL改良方法在细胞凋亡检测中的应用.0M枸橼酸盐缓冲液、通透液%Triton-100、枸橼酸钠、标记缓冲液：二甲胂酸钠100mmol/L标记、二巯基苏糖醇L,氯化钴coci;TdT反应液；标记缓冲液中加TdT酶100U/ml,biotin-dUTP；链霉菌素标记的辣根过氧化物酶,蛋白酶K20μg/ml;显色剂氨乙基咔唑amino ethyl carbazole,AEC的配制AEC 20mg二甲酰胺DMF0.05M醋酸缓冲液 50ml%H2O2实验步骤1切片用冷风吹干后为防止冰冻切片脱片用1%火棉胶封片1分钟,PBS漂洗3×5分钟；23%H2O2阻断10分钟后PBS洗3×5分钟；3组织切片浸泡于盛有L枸橼酸盐缓冲液的烧杯中,置于微波炉内,在650W,辐射时间15min的条件下进行组织处理;冷却至室温;4放在通透液%Triton -100溶于%枸橼酸钠溶液中室温20分钟,PBS漂洗3×5分钟；5滴加50μl TdT反应液37℃1h,PBS漂洗3×5分钟；6滴加50μl biotin-dUTP,反应液37℃1h,PBS漂洗3×5分钟；7滴加50μl链霉菌标记辣根过氧化物酶液37℃孵育30分钟,8PBS漂洗3×5分钟, AEC-H2O2显色10-15分钟,苏木素复染用1%的酸性水分化,水洗、水溶性封片;阳性对照dTd 反应前用20μg/ml蛋白酶K处理切片;阴性对照用PBS代替dTd反应液; 结果判断及标准改良的方法：凋亡细胞核呈红色固缩,有白边集或碎列,细胞膜皱褶,有的卷曲和出泡,在计数时避开坏死区域,以避免假阳性;计数500个细胞中的凋亡细胞数目,得出凋亡百分率;凋亡染色分度如下：每个高倍视野平均1-3个为Ⅰ级；3-6个为Ⅱ级；6-10个为Ⅲ级；>10个者为IV级;阳性对照：经在dTd反应认前用20μg/ml蛋白酶,处理切片30分钟的切片同改良方法基本相同,但红色较浅;阴性对照：切片无棕色反应;评价正常的或正在增殖的细胞没有DNA的断裂,没有3’-OH末端被标记,因此镜下无显色的物质;这种分子生物学与形态学相结合的方法,可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行标记,准确反应细胞凋亡最典型的生物化学与形态学特征,灵敏度远远高于一般的组织化学和生物化学方法;在检测过程中,可设阴性对照不加TdT阳性对照已知的阳性标本;注意:AEC孵育切片,反应产物为红色;可用苏木精对衬染色,反应产物是纯酒精溶性的,因此;可用酸性水溶液分化,然后用水溶性封固剂封片;五、凋亡细胞：凝胶电泳检测前已提及凋亡细胞的突出特征是由于内源性核酸内切酶的激活而导致细胞核DNA的断裂;典型的细胞凋亡,在核内形成大量200bp大小及其倍体的核苷酸片段,而非典型的凋亡细胞,由于核内的DNA降解不完全,仅形成300~50kb的DNA大片;利用这一特性,可通过DNA凝胶电泳来判定凋亡的发生和发展情况;试剂1. PBS缓冲液2. 消化液的配制：100mmol/L NaCl10mmol/L Tris-HCL25mmol/L EDTA%SDSml蛋白酶K3. 酚：氯仿：异戊醇混合液按25:24:1比例配制;4. 氯仿：异戊醇混合液按24:1比例配制;5. 醋酸铵,L;6. 100%和70%的乙醇;7. TE 缓冲液：100mmol/L Tris-HCL,5mmol/L EDTA;8. TBE缓冲液;9. 电泳仪;。
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14-细胞凋亡的诱导和检测实验14 细胞凋亡的诱导和检测20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。
细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞内容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。
细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。
凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。
凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。
凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。
细胞凋亡时的生化变化特征是核酸内切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。
细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。
1．细胞凋亡的检测方法凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。
细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。
表凋亡的检测方法（引自DL 斯佩克特等，2001）方法细胞类型特点说明形态学/细胞旋转不限简单、快速、低廉、贮存无限制略带主观性，但可靠Hoechst染色不限极快，不能贮存略带主观性，但可靠吖啶橙/溴化乙锭不限极快，不能贮存凋亡初期可用，略带主观性，但可靠FACS/FSC X SSC 非贴壁细胞简单，须及时进行客观，仅能提示凋亡FACS/PI吸收非贴壁细胞简单，需及时进行客观，不能辨别凋亡于坏死；早期凋亡的细胞呈阴性膜联蛋白V(锚定蛋白) 最好非贴壁细胞快速简单；细胞可以被固定并非所有细胞在膜整合损失前受PS影响；测定已知的显著性的反应DNA片段（琼脂糖电泳）不限很快、低廉定性，不能确定凋亡；某些细胞不适用DNA片段(PI染色) 不限很快，低廉定量；用于估计凋亡程度DNA片段(JAM 分析) 循环细胞低廉，可分析多种类混合定量，不能确定凋亡含量；不能用于所有细胞TUNEL 不限昂贵，耗时定量，常被认为可靠（尽管应该结合形态学评价）线粒体膜电位损不限低廉，不能确定凋失快速亡，并非次生坏死前的所有细胞都适用caspase活化(蛋白酶活性) 不限中等花费，很快目前不能确定凋亡，但适用于监测器；不能鉴别特定激活的caspasescaspase活化(caspase免疫印迹) 不限中等花费可以鉴别特定激活的caspases；依赖于抗体的有效性caspase活化(基质免疫印迹) 不限中等花费通过特异切割反应测定caspase活化；如这些反应功能可确定形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征：（1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。
细胞凋亡的检测(来自北京大学人类疾病基因研究中心
摘自北京大学人类疾病基因研究中心/news/apoptosis.htm细胞凋亡的检测北京大学人类疾病基因研究中心陈英玉细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。
细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。
一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。
1 光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。
凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。
三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DN A的A-T碱基区。
紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。
储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。
结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。
3 透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。
凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
细胞凋亡实验报告
一、实验背景细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，是一种由基因调控的细胞自主性死亡过程。
细胞凋亡在生物体的发育、免疫、代谢等生理过程中具有重要作用。
近年来，细胞凋亡与多种疾病的发生、发展及治疗密切相关，因此，研究细胞凋亡的机制具有重要意义。
本实验旨在通过检测细胞凋亡相关指标，探讨细胞凋亡在特定细胞类型中的作用。
二、实验材料与试剂1. 细胞：实验用细胞为正常细胞系A和肿瘤细胞系B。
2. 试剂：Annexin V-FITC/PI双染试剂盒、RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、Trizol试剂、DEPC水、无血清培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等。
三、实验方法1. 细胞培养：将正常细胞系A和肿瘤细胞系B分别接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。
2. 细胞凋亡检测：将正常细胞系A和肿瘤细胞系B分别分为实验组和对照组。
实验组加入凋亡诱导剂，对照组加入等量无血清培养基。
培养一定时间后，按照Annexin V-FITC/PI双染试剂盒说明书进行细胞凋亡检测。
3. RNA提取：将实验组和对照组细胞收集于离心管中，按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA。
4. PCR检测：将提取的RNA进行逆转录，得到cDNA。
以cDNA为模板，进行凋亡相关基因的PCR扩增。
5. DNA提取：将实验组和对照组细胞收集于离心管中，按照DNA提取试剂盒说明书提取细胞DNA。
6.琼脂糖凝胶电泳：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带。
四、实验结果1. 细胞凋亡检测：实验组细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05），说明凋亡诱导剂成功诱导细胞凋亡。
2. RNA提取：成功提取实验组和对照组细胞总RNA。
3. PCR检测：实验组凋亡相关基因表达水平显著高于对照组（P<0.05），说明凋亡诱导剂上调凋亡相关基因表达。
4. 琼脂糖凝胶电泳：实验组凋亡相关基因PCR产物条带较对照组明显，说明凋亡相关基因在实验组中表达上调。
细胞生物学技术-细胞凋亡
例：强烈应激反应 糖皮质激素
淋巴细胞凋亡
病原体：细菌、病毒等。例：HIV
（2）抑制因素（抑制细胞凋亡）
CD4+T细胞凋亡
细胞生长因子：如IL-2 、神经生长因子
激素 例：ACTH
肾上腺皮质细胞凋亡
其他：如Zn2+、药物、某些病毒等
11
细胞凋亡信号的转导
凋亡诱导因素 作用于 细胞 转化为 凋亡信号 胞内信号转导途径 激活细胞死亡程序
➢ （3）凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小 不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细 胞膜所包围；
➢ （4）凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。
7
细胞凋亡DNA的片段化
8
细胞凋亡的过程及机理
➢ 接受凋亡信号
➢ 凋亡调控分子间的相互作用
➢ 蛋白水解酶（caspases）的活化
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细胞内氧化还原状态改变的检测
• 当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧 化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从 而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移 到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。
• 由于 GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关，此项检测除 了对研究细胞凋亡的起始非常有用外，还可用于心脏病、中风 等疾病治疗的研究。但有些细胞如：HeLa 和3T3细胞凋亡时没 有明显的GSH水平的变化，不能用此法检测。
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线粒体膜势能（DYmt）的检测
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Caspase家族的结构与分类
ICE亚类Caspase蛋白酶：ICE（白介素1转换酶） 是单核细胞来源的参与成熟的一种蛋白酶，参与 凋亡，但不起主要作用： Caspase-1，Caspase-4， Caspase-5， Caspase-11，Caspase-12，Caspase13， Caspase-14。
细胞凋亡实验步骤及注意事项 细胞爬片制备详细过程 肿瘤细胞侵袭实验
细胞凋亡实验步骤及注意事项一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法二、实验原理细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。
凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。
它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。
细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。
在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。
在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。
在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。
核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。
如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。
相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。
细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。
一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。
三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。
研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。
本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。
流式细胞仪检测细胞凋亡实验步骤
流式细胞仪检测细胞凋亡实验步骤流式细胞仪是一种用于检测和分析细胞的仪器，可以通过测量细胞的荧光和散射特性来了解细胞的生理状态和功能。
在细胞生物学研究中，流式细胞仪广泛应用于细胞凋亡实验。
细胞凋亡是一种重要的细胞程序性死亡方式，正常情况下是一种维持生态平衡的重要机制，而在疾病发生时，细胞凋亡的失控会导致一系列疾病的发生。
因此，对细胞凋亡的检测和研究具有重要意义。
本文将介绍流式细胞仪检测细胞凋亡的实验步骤。
实验材料和仪器流式细胞仪细胞培养物凋亡诱导剂PBS缓冲液1×绑定缓冲液1×洗涤缓冲液荧光标记的抗体PI（胰岛素脱羧酶）Annexin V-FITC套装实验步骤1.细胞处理首先，将培养好的细胞分到不同的培养皿中，添加凋亡诱导剂，以诱导细胞凋亡。
凋亡诱导剂的种类和浓度应根据实验的需要来确定。
通常可选择小分子化合物、放射线等方式来诱导细胞凋亡。
2.收集细胞处理好的细胞经过一定时间的培养后，使用离心机将细胞沉淀下来，并用PBS缓冲液洗涤细胞，以去除培养基和凋亡诱导剂等杂质。
然后使用1×绑定缓冲液将细胞重悬。
3.细胞计数将细胞悬液加入细胞计数板中，用显微镜或自动细胞计数器计算细胞密度，并将细胞密度调整到合适的浓度。
4.细胞染色将调整好浓度的细胞悬液分到不同的离心管中，添加荧光标记的抗体和PI荧光染料。
荧光标记的抗体通常选择Annexin V-FITC，它可以与凋亡细胞膜表面磷脂酰丝氨酸结合，从而可以用于检测凋亡细胞；PI荧光染料用于检测坏死细胞。
5.混匀和孵育将离心管中的细胞悬液混匀均匀，然后在室温下孵育一定时间，通常为15-30分钟。
期间可以轻轻摇晃管子以保证充分的染色反应。
6.流式细胞仪检测染色反应结束后，将细胞悬液加入流式细胞仪的样品管中，通过流式细胞仪的激光和光电探测器，可以分辨出细胞的荧光和散射信号，从而获得细胞凋亡的信息。
使用流式细胞仪之前需要对仪器进行标定和调试，以确保获得准确和可靠的数据。
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis)
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of CellApoptosis)2010-05-25 20:06:41 来源：易生物实验浏览次数：197 网友评论0 条细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
关键词：细胞检测单染法细胞凋亡检测Annexin-V-FITCAssayCellApoptosis一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。
因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
二、实验仪器和材料Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC）500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 mlPBS（1×）60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片（用于荧光显微镜观察）盖玻片（用于荧光显微镜观察）去离子水冰块流式细胞仪或荧光显微镜三、实验方法1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。
细胞增殖凋亡检验方法汇总
细胞增殖、凋亡-检测方法汇总1.直接计数法面单粗暴、傻瓜式的检查方法！利用计数板或计数仪得出细该数目•然后对数目逬行比较。
方法需要对不同时间原的细胞分别固定•而后在光疑下计数,可绘制出细胞生长曲线。
而具不足之处在于无法区分壇蓿细胞与非增殖抵胞，下适合样品奴星參和评估特定亚群的情况。
2「H・TdR渗入法OH腺龜碇核百(TdR )是DNA持有的滅基「也是DNA合成的必需物氐用同位素中标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体渗入DNA合成代谢过程,通过液体闪烁计数器可迴走细胞的放射性强虐，间接放映出细胞增殖情况。
该方法优点在于敏感性高”客观性强,盍每性好.但是爲要一走设备集件，也存在放时性核素污染问题。
3、Brdu/EdU检测法Brdu&EdU均是胸腺嚅睫的衍生物r均可代替胸腺嚅噪在DNA合成期掺入细胞中。
不同的是J Brdu检测法可利用B「du专性抗体和具他細胞标记物对细'进行双重染色,可判断増殖细胞的种类及増殖速度，不仅适用于体外实验也能用于活体实验。
这个方法最大的缺点需要变性DNA才能与抗体结合,破坏了DNA双链结构r导致染色弥散、准确性降低等问题。
EdU检测法则基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性r适用于细胞増殖、细胞标记示踪筈方IEI的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。
EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500,®田胞内很容易就扩散,无需DNA变性。
rdU与EdU检测优缺点综合比较BrdU EdU 检测分子大很小检测方式免疫反应化学反应影响其他标记是否DNA变性需要不需要实验时间过夜 2.5小时检测灵敏度一般灵敏4、WITT检测法&CCK8检测法MTT检测法反映细胞的能臺代谢「是检测细胞増殖活力的一种简便准确方法°其原理是在活纟田胞生长和增殖过程中,线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解为蓝紫色的水不溶性的甲瓒(Formazan ),并沉积在细胞中(死细胞无此功能。
细胞凋亡和增殖实验的实验模拟
按照实验步骤和标准操作程序进行实验，避免操作失误导致实验失 败或产生危险。
废弃物处理
实验结束后，妥善处理废弃物，避免对环境造成污染。
结果可靠性保障措施
选用优质试剂和耗材
选择品质可靠的试剂和耗材，确保实验结果准确性和可重 复性。
严格控制实验条件
对实验温度、湿度、光照等条件进行严格控制，以减小实 验误差。
本实验旨在通过模拟细胞凋亡和增殖的过程，探究细胞凋亡和增殖的分子机制 及其调控因素。
实验假设
我们假设细胞凋亡和增殖受到多种因素的调控，包括基因表达、信号传导、细 胞周期等。通过模拟实验，我们可以探究这些因素对细胞凋亡和增殖的影响及 其相互作用。
实验设计思路及流程
设计思路
本实验采用细胞培养、药物处理、基因表达分析等技术 手段，模拟细胞凋亡和增殖的过程，并探究其分子机制 和调控因素。
流式细胞术
通过细胞大小、光散射等参数的变 化来区分凋亡细胞和正常细胞。
凋亡相关蛋白表达检测
Caspase家族蛋白检测
01
Caspase是凋亡过程中的关键蛋白酶，其活化程度可反映凋亡
的进程。
Bcl-2家族蛋白检测
02
Bcl-2家族蛋白参与凋亡通路的调控，其表达水平可影响细胞的
凋亡敏感性。
PARP剪切检测
05
数据处理与分析方法
数据收集与整理流程
数据收集
从实验中获得原始数据，包括细胞数量、凋亡和增殖的标记物表 达等。
数据整理
对原始数据进行清洗、去噪和标准化处理，以便于后续分析。
数据分组
根据实验设计和研究目的，将数据分组，如不同时间点、不同处 理组等。
数据可视化呈现技巧
图表类型选择
TUNEL检测细胞凋亡实验报告
TUNEL法检测细胞凋亡实验实验原理：细胞凋亡是生物体内细胞在特定的内源和外源信号诱导下,其死亡途径被激活,并在有关基因的调控下发生的程序性死亡过程。
细胞凋亡涉及caspase活化、线粒体跨膜电位下降，位于细胞膜脂内层的磷脂酰丝氨酸转位到蛋白表面，DNA呈规律性断裂等。
基于这些特征，多种检测凋亡的方法也迅速发展起来，常用的方法包括形态学检查，分子生物学方法，免疫电泳和细胞学检查。
TUNEL，为原位末端转移酶标记技术。
其原理是：先增加细胞膜通透性，让rTDT和荧光素生物素标记的dUTP进入细胞内，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的辅助下将脱氧核糖核苷酸和荧光素等形成的衍生物标记到DNA的3’末端，从而可进行凋亡细胞的检测。
最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。
实验前准备在开始实验前，确保所用到的试剂都准备到位。
如：0.2% TritonX 100，TUNEL检测试剂盒（包含10× TdT酶浓缩液、荧光素标记的1× dUTP、转化剂POD），DAB试剂盒，3%过氧化氢甲醇，磷酸缓冲液PBS等。
本实验所使用到的仪器和耗材有：芬兰百得公司提供的移液器，赛默飞公司的QSP盒装吸头，湿盒，恒温箱等。
本次TUNEL实验按照以下常规步骤来展开，首先样品处理，封闭内源性过氧化物酶干扰后进行细胞通透化。
滴加TUNEL反应液反应后POD转换，DAB显色后在显微镜下观察并进行结果分析。
样品处理在标有实验组，阳性对照组和阴性对照组的切片上滴加4%不含甲醇的甲醛室温固定10min。
弃去甲醛，用PBS洗两次，每次5min。
封闭用滤纸擦去周围多余的PBS，滴加3%过氧化氢甲醇，室温孵育10min，消除内源性过氧化物酶干扰后，弃去将载玻片用PBS洗2次，每次5min。
细胞通透化去尽PBS后，滴加100μl由PBS配制的0.2% TritonX 100。
于湿盒中室温孵育5min。
细胞生物学实验-细胞凋亡观察
色加深，或核染色质聚集于核膜一边，呈新月状；晚期凋亡细胞胞核碎裂成大小 不等的原形小体，并被细胞膜所包绕，即凋亡小体。 ⑤ AO（吖啶橙）和EB（溴化乙锭）双染色：AO可以透过细胞膜完整的细胞而嵌入 核DNA呈绿色，EB只能透过细胞膜破损的细胞而嵌入核DNA呈红色。显微镜下 观察，活细胞为荧光深浅不一的结构样特征，核染色质为绿色；凋亡细胞染色强， 亮度高，核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体 或均匀一致的圆状或固缩团状结构。 ⑥ 透射电镜观察：凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形， 核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”，同时可以观察到凋亡 小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬。
细胞凋亡检测
保留的细胞
不健康的细胞
细胞开 始收缩
细胞崩 溃分解 成碎片
不健康的细胞已被除去， 组织内附近的细胞进行 有丝分裂，合上缺口
细胞凋亡检测
细胞凋亡的诱导试剂：
名称 Actinomycin D
Aphidocolin A23187 Caffeine
Camptothecin Cycloheximide Dexamethasone
溶剂 甲醇 二甲亚砜 二甲亚砜 沸水 二甲亚砜
水 乙醇
水
二甲亚砜， 热水 水
二甲亚砜 二甲亚砜 磷酸盐缓冲液
甲醇
细胞凋亡检测
细胞凋亡的检测方法：
样本细胞凋亡实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景细胞凋亡是细胞程序性死亡的过程，是生物体内重要的细胞生物学现象之一。
细胞凋亡在维持生物体内细胞数量的动态平衡、清除异常细胞以及抵御病原体入侵等方面发挥着至关重要的作用。
本研究旨在通过实验方法检测细胞凋亡的发生，探讨细胞凋亡在特定条件下的生物学意义。
二、实验目的1. 探讨细胞凋亡在特定条件下的发生机制。
2. 检测细胞凋亡的发生，并分析其与细胞增殖的关系。
3. 研究细胞凋亡在生物体内的生理和病理作用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：细胞培养液、细胞裂解液、Annexin V-FITC/PI染色试剂盒、流式细胞仪等。
2. 实验仪器：细胞培养箱、显微镜、离心机、流式细胞仪等。
四、实验方法1. 细胞培养：将细胞接种于细胞培养瓶中，置于细胞培养箱中培养至对数生长期。
2. 处理细胞：将细胞分为实验组和对照组，实验组给予特定处理，对照组不做处理。
3. 细胞裂解：将细胞用细胞裂解液裂解，收集细胞裂解液。
4. Annexin V-FITC/PI染色：将细胞裂解液与Annexin V-FITC/PI染色试剂盒混合，室温避光孵育。
5. 流式细胞术检测：将染色后的细胞用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
五、实验结果1. 实验组细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05），表明特定处理可以诱导细胞凋亡。
2. Annexin V-FITC染色结果显示，实验组细胞膜上磷脂酰丝氨酸（PS）外翻，表明细胞凋亡早期发生。
3. PI染色结果显示，实验组细胞核DNA降解，形成DNA ladder，表明细胞凋亡晚期发生。
六、实验讨论1. 本实验结果表明，特定处理可以诱导细胞凋亡，提示细胞凋亡在特定条件下受到严格调控。
2. Annexin V-FITC染色和PI染色结果显示，细胞凋亡过程分为早期和晚期两个阶段。
早期阶段，细胞膜上PS外翻，细胞膜完整；晚期阶段，细胞核DNA降解，细胞膜通透性增加。
3. 细胞凋亡在生物体内具有重要作用。
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实验14 细胞凋亡的诱导和检测
20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。
细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。
细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。
凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。
凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。
凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。
细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。
细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。
1．细胞凋亡的检测方法
凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。
细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。
形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征：
（1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。
借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。
（2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。
（3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。
凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
（4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。
（5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。
如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
（6）木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。
发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。
DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞小分子
质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质出现DNA片段。
但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定：细胞凋亡时，Ca2+、Mg2+依赖的
源性核酸切酶将双链DNA从各核小体间连接区裂断，产生单或寡核小体，各核小体的DNA 与核心组蛋白H2A，H2B，H3，H4形成紧密的复合物而对源性核酸酶有抵抗使之不被源性核酸酶裂解。
可通过ELISA进行检测，主要使用单克隆抗DNA抗体和抗组蛋白抗体直接检测DNA和组蛋白。
该法敏感性高，不需要特殊仪器，可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。
TUNEL法：细胞凋亡中，染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的黏性
3’-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-OH末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal—deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。
TUNEL 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反映细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
流式细胞仪定量分析：流式细胞术（flow cytometry）是20世纪70年代发展
起来的一种利用流式细胞仪对细胞特征及细胞或细胞器的组成进行快速定量分析与分选的一门技术。
流式细胞仪由液流系统（鞘液室、废液箱、鞘液管、样本管、压力系统、流动室或喷嘴）、光学系统（激光光源、透镜、滤片）、电子系统（光电倍增管、信号放大器）、计算机系统以及分选系统等组成。
当经过荧光染色样品悬液注入样品室、不含样品的鞘液注入鞘室后，两种液体被高压推动从喷嘴一起喷出，由于动力学原理，单个样品被鞘液包裹，排列成束并高速运动。
随后样品束与激光器产生的激光束呈90°垂直相遇，激光使样品产生荧光和各个方向的散射光，信号检测器的阻断滤片和双色反射镜可以除去激发光，仅让需要的荧光通过，光电倍增管对荧光进行检测并将荧光转化为电信号。
各种散射光中，前向角散射光（forward light scatter，FSC）（与激光夹角0.5°～2°）和垂直角散射光（side scatter，SSC）（与激光束夹角90°）与样品含有的颗粒数量有关，散射光检测器可以对这两种光进行检测。
每个样品颗粒所产生的荧光和散射光通过检测器时均能被测定，如果对荧光或散射光设定一定分选值，控制系统可以将每一个颗粒所产生的荧光和散射光强度与该值进行比较，并决定对该液滴充以正电荷、负电荷或者不充电。
在高压偏转电场中，带有不同电荷或不带电荷的样品颗粒具有不同的运动轨迹，从而被收集到不同的容器中。
流式细胞仪可在短时间对成千上万的样品进行分析，分离准确率达到99%以上。
细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。
利用这一特点，用荧光素染被检测细胞悬液，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧
光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。
如：检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI 双染色法就是利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoechs染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶(PI)而呈强的红色荧光。
2．细胞凋亡的诱导因素
诱导凋亡的因素包括物理因素、化学因素以及生物因素：
物理性因子：包括射线(紫外线，γ射线等)，较温和的温度刺激(如热激，冷激)等。
化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子a(TNFa)，抗Fas／Apo-1／CD95抗体等。
而过氧化氢(H2O2)、醋酸、高渗透压和高盐浓度等均可以诱导酿酒酵母的凋亡，葡萄糖是酿酒酵母生长所必须的重要营养物质之一，但在其他营养元素缺乏的条件下，只用葡萄糖培养也可迅速的诱导酿酒酵母的细胞凋亡。
【实验目的】
通过不同诱导物或同一诱导物不同诱导时间对细胞凋亡诱导的影响研究，使学生进一步了解细胞凋亡的机制及生物学意义；了解细胞凋亡的诱导和检测方法；初步掌握实验方案设计、数据整理及结果分析和论文撰写等基本技能。
【实验器材、材料和药品】
1．器材
超净工作台、离心机、天平、荧光显微镜、振荡培养箱、CO2培养箱、电泳仪、电泳槽、流式细胞仪、注射器、试管等。
2．试剂及其配制
MS培养基
2,4-D
1％DAPI
血清
DMEM培养基
YPD培养基、
吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)的PBS溶液
Giemsa染液
磷酸盐缓冲液(PBS)
琼脂糖
TAE
【实验方法和步骤】
1．查阅资料，选题
由教师提供课题，学生选定研究课题；或由学生查阅资料、根据细胞生物学理论课所学知识，就以上实验目的以小组为单位，自行命题，报教师审批。
选择诱导凋亡的因素和受体材料。
2．查阅资料，灵活运用所学知识和技能设计实验
根据选择的课题，利用图书馆、网络等资源广泛查阅资料，经充分讨论后设计出实验方案，设计实验方案包括确定诱导条件（如诱导剂的浓度、诱导时间等）、确定合适的凋亡检测方法和步骤。
将实验方案交教师审阅、修改、完善，经教师审批后方可实施。
3．实施并完成自行设计的实验
根据实验设计技术路线，进行实验前的准备工作，实验用复杂溶液配置可在老师指导下配置，实验过程中要严格遵守操作规程，独立完成。
并做好实验记录，向教师报告实验情况和结果，经教师批准后方可结束实验。
4．分析实验结果，写出实验报告
分析讨论实验结果，得出实验结论，并以小论文格式书写实验报告，容包括摘要、前言、材料与方法、实验结果、讨论、参考文献等几部分。
【作业与思考题】
1．如何区分细胞凋亡和细胞坏死？
2．以小论文形式撰写实验报告。