免疫共沉淀

1.免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：

A.蛋白样品的准备：

A1.对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。可以使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)或各种RIPA裂解液(P0013B、P0013C、P0013D或P0013E)等进行细胞的裂解。

A2.对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。

A3.对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。

注：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。

B.去除非特异性结合(可选做)：

B1.取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。

B2.2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。

注：所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和nor mal IgG和Protein G Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。

C.免疫沉淀：

C1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。

C2.再加入20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein G Agarose的量调整为40微升。)

C3.2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G Agar ose。

C4.用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。

C5.完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。

C6.100℃或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20℃保存。

2.免疫共沉淀：

参考免疫沉淀的方法进行，但免疫共沉淀(co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品，但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。

免疫共沉淀

一原理：

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体

的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP 成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。

每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。欲速则不达，确定好比例很必要。

二准备：

器械

#微量高速冷冻离心机

#移液枪

#旋转盘

#电泳设备

#vortex震荡器

#液氮及组织粉碎器

#eppentube

试剂

#细胞或组织

#蛋白定量kit

#SDS电泳试剂

#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)

#PBS

#NaN3

#proteinA sapharose

试剂配制

抗原蛋白溶解缓冲液

1.RIP A缓冲液(最终浓度)

1MTr is-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)

5MNacl 15ml (150mM)

0.5M ED TA(PH7.4) 5ml (5mM)

20%Tr itonX-100 25ml (1%)

10% DOC 50ml (1%)

10%SDS 5ml ( o.1%)

TLCK 18.5mg (0.1mM)

TPCK 35mg (0.2mM)

DDW 395ml

toal 500ml

另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，浓度100mM，-20度遮光保存。注意不易溶于水)

2.NP40 lysis 缓冲液

1MTr is-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)

5MNacl 15ml (150mM)

0.5M ED TA(PH7.4) 5ml (5mM)

20%NP40 25ml (1%)

TLCK 18.5mg (0.1mM)

TPCK 35mg (0.2mM)

DDW 450ml

toal 500ml

使用前加1mM的PMSF

注意点：

*Tr is缓冲剂PH随温度变化，高浓度盐酸滴定时发热，冷却后PH增高。

*反复使用PMSF要注意保管方法。

*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温和，，DOC

*两方都有EDTA，对抗原而言，二价离子Mg,C a等是必要的。根据自己需要调节。ED TA用NaOH滴定。

Protocol

1 调制protein A sapharose

protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS

离心2000转2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，离心后去上清，重复2次，最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存

用单抗做一抗时，把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,混匀后，再离心1-2s

去上清后，加PBS，vortex混合，离心去上清，重复二次

加含0.02%NaN3的PBS到原来体积，冷存。避免长期保存。

2．抗原的检出

以下操作全在冰面或4度进行

去除细胞培养液，用冷PBS洗一次。加RIPA，溶解后，转移到eppentube中用vortex混匀。RIP A的量：6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎，在缓冲剂中捣匀，蛋白定量。

30m，15000rpm离心，上清转移到新tube 。不用移液枪，直接从tube倒进另一个tube

往上清加抗体，1ml加2-5ul抗体，冷室内旋转混匀1h

加protein A sapharose50ul，再混匀1h