免疫共沉淀
免疫沉淀、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀
免疫沉淀是指用抗体把抗原（包括单体、复合物）沉淀下来，是一种抗原纯化、浓集的方法；免疫共沉淀指用抗体把抗原复合物沉淀下来，常用来研究蛋白质的相互作用免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。
抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
基本实验步骤（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心 5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。
在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外，最为关键的是裂解液的成份。
《免疫共沉淀》课件
检查所需的仪器设备是否齐全和正常 工作，如离心机、摇床、离心管等。
实验操作流程
抗体与蛋白质样品的结合
将抗体与蛋白质样品混合，确保抗体与目标 蛋白质充分结合。
共沉淀物的分离
通过离心或过滤等方法将共沉淀物与溶液分 离。
清洗非特异性结合
通过洗涤去除未结合的蛋白质和其他杂质。
结果分析方法
统计学分析
采用t检验或方差分析等统计学方法，对实验数据进行处理和分析，以确定共沉淀物之间的相互作用 是否具有统计学显著性。
生物信息学分析
利用在线生物信息学工具对共沉淀物进行功能注释、基因本体论（GO）分类和蛋白质相互作用网络 分析，以深入了解共沉淀物的生物学功能和相互作用关系。
结果解读与讨论
值的实验数据和结论。
未来可以对这些蛋白质复合物的 功能进行深入研究，探讨其在生 物学和医学中的意义和作用机制
。
同时，随着技术的不断进步和应 用领域的拓展，免疫共沉淀技术 还有望在更多领域发挥重要作用
。
未来研究方向与建议
1
进一步优化免疫共沉淀实验条件和方法，提高实 验的特异性和灵敏度，以分离和鉴定更多蛋白质 复合物。
结果解读
根据实验结果，分析共沉淀物的生物学 意义和功能，探讨它们与目标蛋白的相 互作用机制。
VS
结果讨论
结合已有研究，对实验结果进行深入讨论 ，提出可能的生物学模型或假设，为后续 研究提供思路和方向。同时，对实验的局 限性进行说明，并提出改进方向。
05
结论与展望
结论总结
免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的经典方法之一，在生物学和医学 研究中具有广泛应用。
பைடு நூலகம்
免疫共沉淀技术
血吸虫抱雌沟蛋白与幼虫巨大致死基因作用
? 构建p3 和质粒 ? 两质粒共转染 293T 细胞 ? 分离免疫沉淀复合物 ? 用抗体共沉淀 蛋白，用抗体验证。
家蚕微孢子虫胞壁蛋白单克隆抗体 靶蛋白的分离与质谱鉴定分析
? 利用微孢子虫胞壁蛋白制备2株单抗，鉴定分别 G10 识别虫体蛋白的三种成分， B10识别55左右一 种成分。
1
免疫沉淀原理图解
2 免疫共沉淀定义
免疫共沉淀（，）是以抗体和抗原之间 的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互 作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整 细胞内生理性相互作用的有效方法。
2
免疫共沉淀原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整 细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互 作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免 疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能 沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋 白质是否在体内结合；也可用于确定一种特 定蛋白质的新的作用搭档。
3 与质谱分析
原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用 抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共 沉淀纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳 分离后，质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。
3 与质谱分析流程
4: 应 用
34重组质粒的构建及其在 7 细胞中的表达与定位
? 4为人P21活化激酶4，构建其34真核质 粒
? 转染7细胞。 ? 裂解细胞后用抗体免疫沉淀细胞裂解液
? 裂解虫体提取总蛋白利用制备的单抗进行免疫共 沉淀
? 切取结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱 （）分析，得到相应的肽序列标签
? 鉴定得出结论G10识别的70左右条带为热休克蛋白 70，B10识别的是一种未曾报到的蛋白，分析得到 其相关信息
THE END
蛋白质免疫共沉淀步骤
蛋白质免疫共沉淀步骤
蛋白质免疫共沉淀是一种用于检测蛋白质相互作用的实验方法，其步骤通常包括以下几个方面：
1. 样品制备，首先需要准备含有目标蛋白质的样品，可以是细
胞提取物或者纯化的蛋白质溶液。
样品需要经过适当的处理，比如
离心、裂解等，以提取目标蛋白质。
2. 抗体结合，将目标蛋白质的抗体固定在载玻片、琼脂糖珠或
磁珠等固相载体上，形成免疫复合物。
3. 共沉淀，将制备好的抗体-蛋白质复合物与样品混合，允许
它们发生特异性结合，形成免疫共沉淀复合物。
4. 洗涤，对免疫共沉淀复合物进行洗涤，以去除非特异性结合
的蛋白质和其他杂质。
5. 蛋白质溶解，将免疫共沉淀复合物溶解于适当的缓冲液中，
以便后续的分析。
6. 分析，最后，可以使用Western blot、质谱分析、酶联免疫吸附实验（ELISA）等技术对共沉淀的蛋白质进行检测和分析。
这些步骤可以帮助研究人员确定目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用，从而揭示细胞信号传导、蛋白质复合物组装等重要生物学过程。
同时，在进行蛋白质免疫共沉淀实验时，需要严格控制实验条件，选择合适的抗体以及适当的质控措施，以确保实验结果的准确性和可重复性。
免疫共沉淀（CoIP）概述,原理,优势,局限性及操作流程
免疫共沉淀（CoIP）概述,原理,优势,局限性及操作流程免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋⽩-蛋⽩间相互作⽤的经典⽅法，属于免疫沉淀技术的⼀类，常被⽤于鉴定特定蛋⽩复合物的中未知蛋⽩组分。
免疫共沉淀的设计理念是，假设⼀种已知蛋⽩是某个⼤的蛋⽩复合物的组成成员，那么利⽤这种蛋⽩的特异性抗体，就可能将整个蛋⽩复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进⽽可以⽤于鉴定这个蛋⽩复合物中的其他未知成员。
免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第⼀是天然状态，第⼆是蛋⽩复合物。
免疫共沉淀的优势：与其他研究蛋⽩质相互作⽤技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相⽐，免疫共沉淀鉴定的相互作⽤蛋⽩是在细胞内与⽬的蛋⽩发⽣的天然结合，避免了⼈为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋⽩可信度更⾼。
免疫共沉淀的局限性和注意事项：1. 免疫共沉淀是建⽴在蛋⽩复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋⽩组分很可能检测不到；2. 由于蛋⽩质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使⽤某⼀种pull-down抗体，⽆论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到⼀半的⽬标蛋⽩复合物沉淀出来，如有必要最好使⽤多种不同抗体分别进⾏CoIP；3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋⽩复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋⽩复合物成员也会越来越庞⼤；4. 如果使⽤Western Blot的⽅法检测的蛋⽩复合物中的⽬标蛋⽩，则需要在试验前进⾏预测，具有⼀定的冒险性；当然如果将蛋⽩复合物直接进⾏质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较⾼纯度和浓度的蛋⽩复合物样品也⾮易事，并且成本较⾼；5. CoIP鉴定得到的蛋⽩间相互作⽤可能是直接作⽤也可能是间接作⽤，进⼀步区分还需要进⾏GST-Pull down等实验检测；6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使⽤复合物的不同成员分别独⽴进⾏CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使⽤复合物的任⼀成员进⾏CoIP都会得到其他所有成员[1]免疫共沉淀的⼀般操作流程（中英⽂对照）：成⼲扰。
免疫共沉淀结果解读
免疫共沉淀结果解读
免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）是一种重要的分子生物学技术，用于检测蛋白质-蛋白质或蛋白质-核酸相互作用。
其基本步骤包括抗体与靶分子的结合、沉淀复合物以及检测目标分子。
在免疫共沉淀实验中，检测结果需要经过多种方法进行解读，常用的方法包括：
1. Western blot分析：将分离的蛋白质进行电泳，然后用抗体检测目标蛋白质，以验证免疫沉淀所得到的目标蛋白质是否为所需的蛋白质。
2. 质谱分析：通过质谱技术分析免疫沉淀所得到的复合物，识别其中的蛋白质成分，评估目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用情况。
3. 透射电镜分析：通过透射电镜技术观察免疫沉淀所得复合物的形态结构，评估目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用情况。
4. 免疫共沉淀重复试验：通过多次重复免疫共沉淀实验，验证结果的可重复性和稳定性，评估实验的可靠性和准确性。
综上所述，免疫共沉淀实验的结果需要通过多种方法进行解读，确定目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用情况，从而深入研究其功能和调控机制。
免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）原理：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）步骤：
✧配制100 ml 的modified RIPA buffe：
✧称取790 mg 的Tris-Base，加到75 ml 去离子水中，加入900
mg 的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl 调节PH 值到7.4；
✧加10 ml 10% 的NP-40；
✧加2.5 ml 10% 的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清；
✧加1 ml 100 mM 的EDTA，用量筒定容到100 ml，2～8 ℃保
存；
✧理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑
蛋白酶肽，亮抑酶肽, 胃蛋白酶抑制剂各100 μl；PMSF，Na3VO4，NaF 各500 μl），但是PMSF 在水溶液中很不稳定，
30 分钟就会降解一半，所以PMSF 应该在使用前现加，其他抑
制剂成分可以在水溶液中稳定 5 天。
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)
一原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A 珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min 变性。
免疫共沉淀
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Part 2: CO-IP
免疫共沉淀原理及步骤
Part 2: CO-IP
免疫共沉淀步骤
proteinB proteinB
proteinA
protein
A/G Beads
proteinA
+
proteinB
proteinA
Part 2: CO-IP
免疫共沉淀优点
1.相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处 于天然状态； 2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可 以避免人为的影响；
Part 2: CO-IP
免疫共沉淀注意事项
1. 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的 所有蛋白质－蛋白质相互作用。 2. 题。 最需要注意点是抗体的性质，特别是多抗特异性的问
3. 低温下进行实验。为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗 原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂。
4. 考虑抗体/缓冲液的比例。（抗体过少就不能检出抗 原，过多则就不能沉降在Beads上，残存在上清。缓冲剂太 少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释） 5. 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的。
ProteinA/G-Beads复合物
Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质， 能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的 Fc区结合。
ProteinA/G-Beads 共价结合
protein
protein A/G Beads
Part 1: IP
免疫沉淀原理
Part 1: IP
免疫沉淀步骤
+
protein
A/G Beads
protein
+
上清
免疫共沉淀实验方法
免疫共沉淀实验方法一、介绍免疫共沉淀（immunoprecipitation，简称IP）是一种常用的实验方法，用于研究蛋白质相互作用、蛋白质与其他生物分子的结合以及蛋白质的定位等。
该方法基于抗体的高特异性与目标蛋白质结合的原理，通过将目标蛋白质与其结合的分子一同沉淀下来，从而实现对目标蛋白质及其相关分子的富集。
二、常用的免疫共沉淀方法2.1 直接免疫共沉淀直接免疫共沉淀是最常用的方法之一。
该方法需要选择适当的抗体，将其与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。
随后，通过添加沉淀剂如蛋白A/G琼脂糖或磁珠，使抗原-抗体复合物与沉淀剂结合，然后经过洗涤步骤去除非特异性结合物，最后获得目标蛋白质及其结合分子。
2.2 间接免疫共沉淀间接免疫共沉淀是另一种常用的方法，其优势在于可以使用不同物种的抗体。
首先，选择一种抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，通过添加第二种抗体与第一种抗体结合，形成复合物。
随后，将沉淀剂与第二种抗体结合，将目标蛋白质及其结合分子一同沉淀下来。
2.3 交叉免疫共沉淀交叉免疫共沉淀是一种结合了直接和间接免疫共沉淀的方法。
该方法可以同时检测多个蛋白质相互作用或结合的情况。
首先，选择多种抗体与目标蛋白质结合，形成多个抗原-抗体复合物。
然后，将这些复合物与沉淀剂结合，将目标蛋白质及其结合分子一同沉淀下来。
三、免疫共沉淀实验步骤3.1 样品制备1.收集细胞或组织样品，可以通过细胞培养、动物模型或临床样本等方式获取。
2.将样品进行裂解，可以使用裂解缓冲液如RIPA缓冲液，含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂等。
3.离心样品，去除细胞碎片和细胞核等。
3.2 抗体选择1.根据实验目的选择合适的抗体，可以使用商业提供的特异性抗体或自制抗体。
2.对于直接免疫共沉淀，选择与目标蛋白质结合的一抗体。
3.对于间接免疫共沉淀，选择与目标蛋白质结合的一抗体和第二抗体。
3.3 抗原-抗体结合1.将抗体与样品中的目标蛋白质结合，可以通过加入抗体到样品中并进行孵育来实现。
免疫共沉淀原理图解
免疫共沉淀原理图解免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）是一种用于分离和富集特定蛋白质的技术。
基于特异性抗体与目标蛋白质的结合，IP可以用于检测蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用、蛋白质修饰和定位等方面的研究。
下面将介绍免疫共沉淀的原理和流程。
原理：免疫共沉淀是通过特异性抗体与目标蛋白质的结合，来沉淀出目标蛋白质及其相关蛋白质、DNA或RNA等分子的方法。
具体来说，IP通过以下步骤实现：1. 将细胞裂解，使蛋白质溶于缓冲液中。
2. 加入特异性抗体，并使其与目标蛋白质结合。
3. 加入亲和素（一种与抗体结合的蛋白质），再将亲和素固定在磁珠上。
4. 加入磁珠后，亲和素与抗体结合，并沉淀下含有目标蛋白质及其相关分子的复合物。
5. 用洗涤缓冲液洗涤磁珠，并用洗涤液去除非特异性结合的蛋白质。
6. 用洗涤缓冲液或热水溶液将目标蛋白质及其相关分子从磁珠上去除。
7. 最后，用Western blot或其他方法检测目标蛋白质及其相关分子。
流程：IP的具体实验流程如下：1. 细胞溶解：将含有目标蛋白质的细胞或组织裂解并使蛋白质溶于缓冲液中。
2. 抗体结合：加入经过验证的特异性抗体，使其与目标蛋白质结合。
3. 亲和素结合：加入亲和素，使其与抗体结合，并将其固定到具有磁性的磁珠上。
4. 免疫共沉淀：将磁珠加入到蛋白质混合物中，使亲和素与抗体结合并沉淀出目标蛋白质及其相关分子。
5. 洗涤：用洗涤缓冲液将非特异性结合的蛋白质去除，保留目标蛋白质及其相关分子。
6. 去除磁性珠：用洗涤缓冲液或热水溶液将目标蛋白质及其相关分子从磁珠上去除。
7. 分析：用Western blot、质谱等多种技术检测目标蛋白质及其相关分子。
总结：免疫共沉淀是一种非常有用的技术，可以帮助研究者了解蛋白质相互作用、蛋白质修饰及其定位等方面的信息。
虽然技术流程复杂，但只要按照正确的方法进行操作，就能够产生非常有意义的结果。
免疫共沉淀联合质谱
免疫共沉淀联合质谱
免疫共沉淀联合质谱（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry, IP-MS）是一种新型的蛋白质互作分析方法，它将免疫共沉淀（IP）和质谱技术（MS）相结合，可以有效地确定蛋白质间的互作关系，为研究蛋白质组学提供重要帮助。
IP-MS技术包括三个主要步骤：1）特异性免疫共沉淀；2）共沉淀物的鉴定；3）蛋白质互作网络的建立。
1、特异性免疫共沉淀
免疫共沉淀是一种用于研究蛋白质之间相互作用的常用技术，它能够特异性地捕获细胞内的蛋白质或多肽结合到表位抗原的抗体上。
这一步需要选择有特异性的抗体，并将抗体与细胞内的抗原结合，使其能够特异性地结合到细胞内的蛋白质或多肽上。
2、共沉淀物的鉴定
一般情况下，IP技术能够捕获蛋白质，但无法鉴定出捕获的蛋白质是什么，因此需要进一步将共沉淀物分离，并用质谱技术对共沉淀物进行分析，以确定其组成成分。
质谱技术可以高精度地测定蛋白质的分子量，并利用蛋白质数据库来鉴定出所捕获的蛋白质是什么。
3、蛋白质互作网络的建立
根据共沉淀物的鉴定结果，可以建立蛋白质互作网络，从而可以更好地理解蛋白质之间的互作关系，以及蛋白质组学中的生物学调控网络。
IP-MS技术具有高灵敏度、高特异性和快速分析的优势，在研究蛋白质组学方面有着重要的应用价值。
它不仅可以用于鉴定蛋白质相互作用，还可以用于研究蛋白质的结构和功能，从而为生物学研究提供重要的参考。
免疫共沉淀
起桥梁作用；
如用western blot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，
以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果，
实验本身具有冒险性。
1.
实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力
也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明 书。特别是多抗的特异性是问题。
INMAP 是一个在 有丝分裂中起重 要作用的蛋白， 保证了纺锤体和 端粒的完整性。 本 文 研 究 了 INMAP 通 过 P53/P21 途 径 起 作用。
结论？
一. 二. 三.
免疫沉淀（IP） 免疫共沉淀（CO-IP） 免疫共沉淀结果分析
免疫沉淀（immunoprecipitation IP）是利用抗 体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。利用抗 体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白） 从混合体系沉淀下来。
免疫沉淀（immunoprecipitation IP）是利用抗原蛋 白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein
Western blotting 或质谱分析，即样品处理（温度，裂解液成 分）；抗体-agarose beads孵育（选择合适的阴性对照）；抗体 -agarose beads复合物洗涤；鉴定
非变性条件下进行实验；
需要高质量的抗体；
免疫沉淀体系需要有严格的控制指标
基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相 关实验手段：
定蛋白质的新的作用搭档。
（1） 蛋白样品准备：如果为细胞样品，需先裂解细胞；
（2） 抗原抗体结合反应； （3） Protein A/G 与抗原抗体复合物结合； （4） 免疫复合物与 protein A/G 解离： 一般采用 2% SDS 煮沸 5 分钟处理样品；
免疫共沉淀洗脱
免疫共沉淀洗脱免疫共沉淀（ Co-immunoprecipitation，Co-IP）是一种用于研究蛋白质相互作用的实验技术。
这项技术通常用于确定特定蛋白质与其他蛋白质之间的相互作用关系。
在免疫共沉淀实验中，所涉及的洗脱步骤是清洗和分离免疫沉淀复合物以及目标蛋白质的步骤。
洗脱过程可以通过以下步骤进行：1.沉淀复合物的收集：在免疫共沉淀后，沉淀复合物（ 包括目标蛋白质以及其结合的互作蛋白质）会与抗体或亲和基质一起沉淀下来。
这时需要收集这些沉淀物以进行后续的洗脱步骤。
2.洗涤步骤：收集沉淀物后，需要进行洗涤步骤来去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
通常使用缓冲液进行多次洗涤，以保持目标蛋白质和其互作蛋白的结合。
3.洗脱：洗脱是分离沉淀复合物的重要步骤。
通过改变pH值、添加特定的洗脱剂或其他方法，使得沉淀复合物中的蛋白质释放出来，从而分离出目标蛋白质以及与其相互作用的蛋白质。
4.收集洗脱物：通过洗脱步骤分离出的蛋白质被收集，并可以进行进一步的实验操作，如免疫印迹、质谱分析等。
洗脱步骤对于免疫共沉淀实验非常重要，因为它能够有效地去除非特异性结合物，从而使得目标蛋白质及其相互作用蛋白的分析更加准确可靠。
选择合适的洗涤缓冲液和洗脱条件对于保持蛋白质的天然构象和功能至关重要。
免疫共沉淀的洗脱步骤如下：1.取20μL的Protein（A/G（Magnetic（Beads加入到1.5mL离心管中，离心管置于磁分离架上，静置10s，吸弃上清。
2.加入1mL1×Wash（Buffer，重悬Protein（A/G（Magnetic（Beads，离心管置于磁分离架上，静置10s，吸弃上清，重复3次。
3.加入0.2-2μg抗体溶液，重悬Protein（A/G（Magnetic（Beads，室温下置于垂直旋转混合仪孵育30min，离心管置于磁分离架上，静置10s，收集上清液，沉淀用于后续Step(4)。
以上步骤仅供参考，请根据实际情况调整。
免疫共沉淀 Co IP protocol
免疫共沉淀(Co-IP)Protocol一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X 的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到 1.5EP 管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min 变性。
免疫共沉淀(Co-IP)
分离胶 将不同大小的蛋白分离开来
SDS-PAGE
胶板选择
根据样品数 和上样量数选择 适合尺寸的胶板 和相应的样品梳。
小型垂直电泳系统 14
胶浓度选择
根据待检测样品的分子量，选择合适浓度分离胶， 具体配置查阅分子克隆。
分离胶 H2O 30%丙烯酰胺 1.5MTris (pH8.8)
14聚 子阴0m%l合筛离（1后效子0 m形应去L）成。污交剂浓H叉，2缩O 网胶作状为结变构性，剂42m.使7和lml其助产溶生试分剂， 3断.3 m裂l 分子内和3分0%丙子烯间酰胺氢键，0.6去7 m折l 叠，消 2除.5 m电l 荷和分子1结M T构ris (的pH6影.8) 响。0.5 ml
淀实验，环状沉淀实验和凝胶内沉淀实验。
3
免疫共沉淀CoIP：
是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础 的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是 确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作 用的有效方法。
CoIP原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内 存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了 下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在 体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
•电泳条件： 70V恒压30 min； 120V恒压1-1.5 h（具体时间根据分子量大
小，及预染Marker指示位置）。
转膜准备工作（湿转法）
•转膜缓冲液配置（预冷） 1 L体系：12.1 g Tris base 14.4 g Glycine 5%-20%甲醇
• 醋酸纤维膜： 略比胶大，根据蛋白质分子量可以选择不同 规格的，0.22μm；0.45 μm
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免疫共沉淀Co-IP
百泰派克生物科技
免疫共沉淀Co-IP
免疫共沉淀，简称Co-IP，是一种广泛应用于发现和检测蛋白质与蛋白质相互作用的技术，优点是可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合物。
百泰派克生物科技提供Co-IP分析蛋白互作的服务。
Co-IP技术通过利用某一特定蛋白（诱饵蛋白）的特异性抗体间接捕获与该诱饵蛋白结合的蛋白，来鉴定天然状态下的蛋白与蛋白相互作用。
作为免疫沉淀（IP）实验技术的一种，Co-IP实验不仅可以捕获和纯化主要目标-诱饵蛋白，而且还可以捕获和纯化通过天然相互作用与诱饵蛋白结合的其他大分子。
相对于其他鉴定蛋白质互作的方法，Co-IP的优点主要是可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合物。
免疫共沉淀（Co-IP）实验步骤
免疫共沉淀实验主要包括了4个步骤：1.制备蛋白质混合物（细胞裂解液或组织提取物）；2.用结合有特异性抗体的亲和珠孵育蛋白质混合物；3.通过多个洗涤步骤清除未结合的蛋白质；4.通过SDS-PAGE，蛋白质印迹或质谱（MS）分析检测相互作用蛋白。
免疫共沉淀(Co-IP)
1免疫共沉淀一、实验原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP），是利用抗原A 与蛋白B 结合，通过A 的抗体（钥匙）沉淀A （锁），再利用精制的prorein A/G （钥匙链）预先结合到磁珠上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，磁珠上的prorein A/G 就能吸附抗原，从而获得抗原A 与蛋白B 的复合体，之后就可以对B 进行检测，从而获得蛋白质与蛋白质相互作用的信息。
二、Co-IP 标准化操作流程样品裂解（裂解液）→样品的预纯化（normal IgG/微珠）→与目标蛋白抗体共孵育（IP 抗体、Normal IgG ）→免疫共沉淀（微珠）→微珠清洗（裂解液）→洗脱→WB 分析或其他分析（WB/一抗、二抗）（一）样品裂解 1.温和裂解（1）温和的裂解液进行裂解，常用的去垢剂成分：NP-40、TritonX-100、IGEPAL CA-630、CHAPS ；（2）成品buffer ；（3）添加蛋白酶抑制剂（防止蛋白被降解）。
2.样本制备流程（1）去掉培养基，用冰PBS 清洗一次。
2（2）去掉PBS，每个板（10cm ）中加0.5mL 冰预冷的1×细胞裂解液，在冰上孵育5min 。
（3）将所有细胞刮下，收集到离心管，置于冰上。
（4）冰浴中对样品用超声处理3次，每次5s 。
（此步骤对膜蛋白提取有较好作用） （5）4 ℃，14000g 离心10min ，将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物。
（6）BCA 测定浓度。
3.注意事项（1）整个过程冰上操作。
（2）IP 样本一般建议新鲜制备并立即使用，如有需要，可保存在-80 ℃。
（二）预纯化 1.阴性对照的选择与IP 抗体同源同型（亚型）的抗体：如 Rabbit IgG ；Mouse IgG1等。
取与IP 实验等量的裂解液，使用Isotype Control 孵育；与IP 抗体孵育同时进行。
2.Isotype Control 选择3.预纯化的目的（1）减少裂解混合物中的非特异性蛋白的含量。
免疫沉淀、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀
免疫沉淀是指用抗体把抗原（包括单体、复合物）沉淀下来，是一种抗原纯化、浓集的方法；免疫共沉淀指用抗体把抗原复合物沉淀下来，常用来研究蛋白质的相互作用免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。
抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
基本实验步骤（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心 5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。
在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外，最为关键的是裂解液的成份。
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1.免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：A.蛋白样品的准备：A1.对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。
可以使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)或各种RIPA裂解液(P0013B、P0013C、P0013D或P0013E)等进行细胞的裂解。
A2.对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。
A3.对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。
注：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。
对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。
如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
B.去除非特异性结合(可选做)：B1.取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。
B2.2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。
注：所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。
通过和nor mal IgG和Protein G Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
C.免疫沉淀：C1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。
C2.再加入20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。
(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein G Agarose的量调整为40微升。
)C3.2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G Agar ose。
C4.用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。
洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。
C5.完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。
C6.100℃或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20℃保存。
2.免疫共沉淀：参考免疫沉淀的方法进行，但免疫共沉淀(co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。
普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品，但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。
免疫共沉淀一原理：IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
实验最需要注意点就是抗体的性质。
抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。
建议仔细检查抗体的说明书。
特别是多抗的特异性是问题。
其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。
多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。
为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。
另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。
即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP 成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。
每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。
抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。
缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。
欲速则不达，确定好比例很必要。
二准备：器械#微量高速冷冻离心机#移液枪#旋转盘#电泳设备#vortex震荡器#液氮及组织粉碎器#eppentube试剂#细胞或组织#蛋白定量kit#SDS电泳试剂#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)#PBS#NaN3#proteinA sapharose试剂配制抗原蛋白溶解缓冲液1.RIP A缓冲液(最终浓度)1MTr is-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)5MNacl 15ml (150mM)0.5M ED TA(PH7.4) 5ml (5mM)20%Tr itonX-100 25ml (1%)10% DOC 50ml (1%)10%SDS 5ml ( o.1%)TLCK 18.5mg (0.1mM)TPCK 35mg (0.2mM)DDW 395mltoal 500ml另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，浓度100mM，-20度遮光保存。
注意不易溶于水)2.NP40 lysis 缓冲液1MTr is-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)5MNacl 15ml (150mM)0.5M ED TA(PH7.4) 5ml (5mM)20%NP40 25ml (1%)TLCK 18.5mg (0.1mM)TPCK 35mg (0.2mM)DDW 450mltoal 500ml使用前加1mM的PMSF注意点：*Tr is缓冲剂PH随温度变化，高浓度盐酸滴定时发热，冷却后PH增高。
*反复使用PMSF要注意保管方法。
*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。
TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温和，，DOC<SD S是离子性的强活性剂。
注意忘记加TritonX-100，只加DOC，SDS，可能使抗体完全失去活性。
1的蛋白变性效果强，可能损害抗原/抗体结合，2的作用温和，却可能造成抗原溶解不全。
*两方都有EDTA，对抗原而言，二价离子Mg,C a等是必要的。
根据自己需要调节。
ED TA用NaOH滴定。
Protocol1 调制protein A sapharoseprotein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS离心2000转2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，离心后去上清，重复2次，最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存用单抗做一抗时，把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。
旋转1-2h,混匀后，再离心1-2s去上清后，加PBS，vortex混合，离心去上清，重复二次加含0.02%NaN3的PBS到原来体积，冷存。
避免长期保存。
2．抗原的检出以下操作全在冰面或4度进行去除细胞培养液，用冷PBS洗一次。
加RIPA，溶解后，转移到eppentube中用vortex混匀。
RIP A的量：6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎，在缓冲剂中捣匀，蛋白定量。
30m，15000rpm离心，上清转移到新tube 。
不用移液枪，直接从tube倒进另一个tube往上清加抗体，1ml加2-5ul抗体，冷室内旋转混匀1h加protein A sapharose50ul，再混匀1h5000rpm离心1s,使sapharose沉淀，去上清。
往sapharose加RIP A，vortex 混匀，离心，去上清。
重复4次洗净。
加电泳用sample 缓冲液40ul,2m煮沸，泳动后，固定/干燥胶，现像。
3.注意点A：不熟练使用移液枪，会混入沉淀的不溶性蛋白，使实验失败。
对无论怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速离心机。
B：对电泳的非特异条带，最后可依次用含300mM，1omMNaC l的RIP A洗净各一次。
(完)阅读全文(5393) / 评论(10) / 给紫晓留言/ 扔小纸条/ 文件夹: 医学知识收藏: QQ书签 / 订阅: Google 抓虾免疫共沉淀技术路线准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Pr otein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl“过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer 有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。