检测丁丙诺啡的胶体金标记单克隆抗体免疫试剂盒研制_曾立波

依次将滤样纸、吸水玻璃纤维（ 固相的胶体金－ 丁 丙诺啡单克隆抗体结合物） 、硝酸纤维薄膜和吸水滤 纸粘贴于白色的塑料片支持材料上。在硝酸纤维薄膜 用点膜机分别划检测线（Ｔ 线） 和质控线（Ｃ 线） ， 检测 线 （ Ｔ 线 ） 为 丁 丙 诺 啡 － ＢＳＡ（ ０．６ ｍｇ／ｍＬ） ， 质 控 线 （ Ｃ 线 ） 为 纯 化 后 的 羊 抗 鼠 ＩｇＧ 多 克 隆 抗 体（０．８ ｍｇ／ｍＬ）， 干燥后以封闭液（ １％ＢＳＡ／０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ） 封闭 ２ｈ； 用 ０．０１ ｍｏｌ／ＬＰＢＳ 洗涤 ３ 次， 真空干燥； 切成 ０．５ ｃｍ×１０ ｃｍ 的测试条，装入塑料盒中，加入干燥剂密封保存。 １．２．５ 试剂盒的组装
参照文献［１－ ３］， 采用柠檬酸钠还原法。用去离子 水配制 ０．２５×１０－３ ｍｏｌ／Ｌ （０．０１％）的氯 金酸溶 液 １００ ｍＬ 加 热至沸腾， 迅 速 加 入 ３４×１０－３ ｍｏｌ／Ｌ （ １％） 柠 檬 酸 钠 溶 液 ２ ｍＬ， 继 续 煮 沸 １０ ｍｉｎ， 冷 却 后 ， 即 成 胶 体 金 颗 粒。按照文献［４］， 用 Ｂｅｃｋｍａｎ Ｄｕ５３０ 分光光度计对胶 体金在可见光范围（ ４００～６００ ｎｍ） 进行扫描， 发现其主 峰宽度较小， 表明制备的胶体金颗粒较均匀； 其 λｍａｘ 为 ５２１ ｎｍ， 表明其粒度为 ２０ ｎｍ［５］。用 ２０ ｎｍ 胶体金颗 粒标记抗丁丙诺啡单克隆抗体。
丁 丙 诺 啡 （ ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ） 是 国 家 严 控 的 Ｉ 类 精 神药品。目前检测丁丙诺啡的主要方法是 ＧＣ／ＭＳ， 但 其检测速度慢， 操作周期长， 且价格昂贵， 不能在现场 检测， 难以推广。为此， 本研究建立一种简便、快速、灵 敏 、可 靠 、价 格 便 宜 ， 且 适 用 于 现 场 即 时 定 性 筛 选 检 测、易于基层单位掌握的丁丙诺啡快速检测的新方 法，即丁丙诺啡胶体金单克隆抗体免疫层析试剂盒。
１ 材料和方法
１．１ 材料 羊抗鼠 ＩｇＧ 多克 隆抗体和抗 丁丙诺啡单 克隆抗
体为本所自制 （ ＢＵＰ－ １） ； ＢＳＡ 和氯金酸 （ ＨＡｕＣｌ４·１２ Ｈ２Ｏ） 为 Ｓｉｇｍａ 产品； 硝酸纤维素膜为 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 公司产
［作者简介］ 曾立波（ １９５４－ ） ， 上海人， 高级工程师， 学士学位，主 要 从 事 分子 免 疫 学和 法 医 毒品 毒 物 鉴定 的 研 究 工 作，（电 话） ０２１－ ２５６５２９９３。
将检测条置于塑料件内， 加样孔对准检测条滤样 纸位置， 压紧后组装成试剂盒。
１．３ 检测原理和结果的判断
本试剂盒利用免疫竞争法的原理， 来检测尿液或 水样等样本中的丁丙诺啡及其代谢物。取待测样品 １２０ μＬ 加入加样孔中， ５ ｍｉｎ 内观察结果。当样本中 不含有丁丙诺啡及其代谢物时， 由于毛细管作用， 胶 体金－ 抗丁丙诺啡单克隆抗体结合物将沿硝酸纤维薄 膜向上移动， 与硝酸纤维薄膜上的丁丙诺啡－ ＢＳＡ 相 结合， 在检测线（Ｔ 线） 位置呈现一条紫红色的肉眼可 见的条带， 即为阴性结果； 当样本中含有丁丙诺啡及 其代谢物时， 丁丙诺啡及其代谢物将和硝酸纤维薄膜 上丁丙诺啡－ ＢＳＡ 相互竞争与胶体金标记的抗丁丙诺 啡单克隆抗体结合， 当丁丙诺啡及其代谢物达到阈值 浓度时（ ≥１００ ｎｇ／ｍＬ） ， 将会阻碍胶体金－ 抗丁丙诺啡 单 克 隆 抗 体 结 合 物 和 纤 维 薄 膜 上 丁 丙 诺 啡－ ＢＳＡ 结 合， 在检测线（Ｔ 线） 位置不会出现紫红色的肉眼可见
丁
丁
丙
丙
诺
诺
啡
啡
质控线—
Ｃ
Ｃ
检测线—
Ｔ
Ｔ
加样孔—
丁
丁
丙
丙
诺
诺
啡
啡ＣＣຫໍສະໝຸດ ＴＴ阴性阳性
无效
无效
图 １ 试剂盒结果判断示意图
２ 结果与讨论
２．１ 特异性鉴定 ２．１．１ 抗丁丙诺啡单克隆抗体特异性的鉴定
由于在制备试剂盒过程中，Ｔ 线位置使用丁丙诺 啡－ ＢＳＡ 作为抗原， 如果制备的丁丙诺啡单克隆抗体 与 ＢＳＡ 有交叉反应，将会导致假阴性的结果。本研究 采用直接 ＥＬＩＳＡ 方法， 将丁丙诺啡－ ＢＳＡ 和 ＢＳＡ 分别 包被酶标板， 封闭后加辣根过氧化物酶标记的抗丁丙 诺啡单克隆抗体， 洗涤后以 ＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２ 显色。结果显 示： 抗丁丙诺啡单克隆抗体可以识别丁丙诺啡－ ＢＳＡ， 最低限度可达 ５０ ｎｇ， 并且与 ＢＳＡ 没有任何交叉反应 （ 图 ２） 。
法 医 学 杂 志 ２００６ 年 ４ 月 第 ２２ 卷 第２ 期
１．２．２ 最适标记蛋白量的确定 上 述 方 法 制 备 的 胶 体 金 溶 液 用 ０．１ ｍｏｌ／Ｌ Ｋ２ＣＯ３
调至 ｐＨ ９．０ 后，在 １．０ ｍＬ 的胶体金溶液中加入不同量 的抗丁丙诺啡单抗，２ ｍｉｎ 后，加入 １．０ ｍＬ 的 １０％ＮａＣｌ， 摇匀，放置 ５ ｍｉｎ 后，测 ＯＤ５８０ ｎｍ 值。 １．２．３ 胶体金－ 抗丁丙诺啡单克隆抗体结合物的制备
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ Ｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉ － Ｂｕｐｒ ｅｎｏｒ ｐｈｉｎｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｂｕｐｒ ｅｎｏｒ ｐｈｉｎｅ
ＺＥＮＧ Ｌｉ－ ｂｏ， ＣＨＥＮ Ｌｉａｎ－ ｋａｎｇ， ＨＵ Ｘｉａｏ－ ｌｏｎｇ， ＣＨＥＮ Ｌｉａｎｇ， Ｗａｎｇ Ｘｕｅ－ ｓｈｅｎｇ， Ｚｈａｎｇ Ｙｕ－ ｒｏｎｇ （ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００８３， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐｅ ａｎ ｅａｓｙ ｔｏ ｕｓｅ， ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ ｗａｓ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ａｎｄ ｄｉｓｐｅｎｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇｌａｓｓ ｆｉｂｅｒ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ Ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ－ ＢＳＡ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ ｓｐｒａｙｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｓ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｌｉｎｅ （Ｔ ｌｉｎｅ） ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｌｉｎｅ（Ｃ ｌｉｎｅ）． Ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｔｅｓｔ ｋｉｔ ｗａｓ ｔｈｅ ｆｉｎａｌ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｅｓｔ ｓｔｒｉｐ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｌａｓｔｉｃ ｃｏｖｅｒ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ １００ ｕｒｉｎｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｆｏｒ ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎｄ ＧＣ／ ＭＳ ｍｅｔｈｏｄｓ． ｔｈｅ ａｃｃｕｒａｃｙ ｗａｓ ９９．０％． Ｉｔ ｉｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｋｉｔ ｃａｎ ｏｎｌｙ ｄｅｔｅｃｔ ｂｙ ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ４５ ｋｉｎｄ ｄｒｕｇｓ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｒａｐｉｄ ｔｅｓｔ ｋｉｔ ｃａｎ ｄｅｔｅｃｔ ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｎ ５ ｍｉｎｕｔｅｓ． Ｔｈｅ ｃｕｔ－ ｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｉｓ １００ ｎｇ／ｍＬ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ａｓｓａｙ； ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ ｔｅｓｔ ｋｉｔ； ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ； ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ
美沙酮、苯巴比妥、去甲基麻黄素、麻黄素、Ｌ－ 脱氧麻 黄碱、３， ４－ 亚甲基二羟脱氧麻黄碱、对乙酰氨基酚、阿 米替林、氨苄青霉素、利多卡因、阿司匹林、ｄ－ 脱氧麻 黄 碱 、阿 托 品 、苯 佐 卡 因 、甲 氧 萘 丙 酸 、咖 啡 因 、氯 奎 、
品， 孔径为 ８ μｍ； 玻璃纤维纸为英国 Ｗｈａｔｍａｎ 公司产 品 ； Ｓｏｒｖａｌｌ 低 温 高 速 离 心 机 为 美 国 科 峻 仪 器 公 司 产 品； Ｂｅｃｋｍａｎ Ｄｕ５３０ 分光光度计为美国 Ｂｅｃｋｍａｎ 公司 产品； 点膜机 和切板机均 为 Ｂｉｏ－ Ｄｏｔ 公 司 产 品 ； 丁 丙 诺啡标准品为国家麻醉品实验室提供， 试剂盒的塑料 件由上海升惠塑料制品有限公司提供。 １．２ 方法 １．２．１ 胶体金的制备
·１３１·
的条带， 即为阳性结果。无论阴性或阳性结果， 胶体 金－ 抗丁丙诺啡单克隆抗体结合物总是可以与质控线 （ Ｃ 线） 位置上的羊抗鼠 ＩｇＧ 多抗结合， 在 Ｃ 线位置形 成一条肉眼可见的紫红色条带。据此判定， 阴性结果 为 Ｔ 线和 Ｃ 线位置各一条色带， 阳性结果为 Ｃ 线位 置一条色带。若 Ｃ 线位置没有出现条带， 无论 Ｔ 线位 置是否出现条带， 检测结果均为无效（ 图 １） 。
用 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ 亲和层析纯化抗丁丙诺啡单克隆抗 体， 以纯水透析过夜， １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心去沉淀后， 将 其浓度调节到 １．０ ｍｇ／ｍＬ； 取 １００ ｍＬ 胶体金， 用 ０．１ ｍｏｌ／Ｌ Ｋ２ＣＯ３ 将胶体金溶液调至 ｐＨ ９．０， 在磁力快速搅 拌下加入抗丁丙诺啡单克隆抗体 １．５ ｍｇ（ １．５ ｍｇ／ｍＬ） ， 搅拌 １５ ｍｉｎ； 加入 ２００ ｍｇ 的 ＢＳＡ， 搅 拌 １０ ｍｉｎ 后 ， 以 １５００ｒ／ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ， 弃沉淀， 上清液再以 １２０００ｒ／ｍｉｎ 离心 ３０ ｍｉｎ， 小心吸去上清， 沉淀即为胶体金－ 抗丁丙 诺啡单克隆抗体结合物。用缓冲液 （ ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ， １％ＢＳＡ， ｐＨ ８．２） 稀释至一定浓度后， 均匀的浸在吸水 玻璃纤维纸上， 真空干燥。 １．２．４ 胶体金单克隆抗体免疫层析测试条的制备