植物组织培养实验报告

植物组织培养实验

李永吉 12101705 12青年农场主班

第一部分：培养基母液的配制

通过配制母液过程了解植物外植体立体培养所需各种营养成分及激素种类，掌握培养基母液配制的方法。之所以要配制培养基母液，是因为考虑到在配制培养基时使用更方便、操作更简化、用量更准确，减少每次配药称量各种化学成分所花费的时间和误差，所以我们在配制培养基之前将配制培养基所需无机大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素成分分别配制成比需要量大若干倍的浓缩母液，置于冰箱保存。当配制培养基时，按预先计算好的量分别量取各种母液即可。

实验所需用具器材有：电子天平（检测灵敏度0.0001g）、pH计、托盘电子秤（检测灵敏度0.01g）、冰箱、烧杯（1000mL、500mL、250mL、50mL）、量筒（2000mL、1000mL、100mL、50mL）、试剂瓶（1000mL、250mL、150mL）、药匙、玻璃棒

实验所需药品试剂有：蒸馏水、1N HCl、1N NaOH、95%酒精、各种所需化学药品（分析纯）

实验内容：

1、无机大量元素母液的配制（20倍）

按培养基配方所需量，将各种化合物称量扩大20倍，用托盘电子秤称取，并用200mL蒸馏水溶解于250mL烧杯中，如溶解缓慢，可稍加热。CaCl2单独用100mL纯水溶解。溶解后将以上溶液倒入容量瓶中定容至1000mL。倒入试剂瓶中并贴好标签，保存于冰箱冷藏。

MS无机大量元素母液配制

2、无机微量元素母液配制

按培养基配方所需量，将各种化合物称量扩大200倍，用托盘电子秤称取，并用200mL蒸馏水溶解于250mL烧杯中，。溶解后将以上溶液倒入容量瓶中定容至500mL。倒入试剂瓶贴好标签，保存于冰箱。

3、铁盐母液配制

按培养基配方所需量，将各种化合物称量扩大200倍，用托盘电子秤称取，并分别用20mL蒸馏水溶解于50mL烧杯中，溶解后将以上溶液倒入容量瓶中定容至100mL。倒入棕色试剂瓶贴上标签，保存于冰箱。

4、有机母液配制

按培养基配方所需量，将各种化合物称量扩大200倍，用托盘电子秤称取，用300mL蒸馏水溶解于500mL烧杯中，溶解后将以上溶液倒入容量瓶中定容至500mL，倒入试剂瓶贴上标签，保存于冰箱中。

5、激素母液配制

各类激素用量最小，为了方便和准确，也配制成母液。母液浓度依据需要和习惯灵活确定。各类激素均不能直接用蒸馏水溶解，而要用各种不同溶剂先洗涤后再用蒸馏水定容。一般的，NAA、IAA、IBA等生长素是醇溶性的，均可用少量95%酒精先溶解后再用蒸馏水定容，而KT、6BA、ZT等细胞分裂素可先用少量1N NaOH溶解后再用蒸馏水定容。冰箱保存。

第二部分：培养基的配制和灭菌

培养基是影响植物组织培养成功与否的最重要因素之一，除了培养材料本身的因素外，培养基的种类、成分等直接影响培养材料的脱分化、继代增值和再分化。我们通过配制MS培养基以及灭菌操作掌握其配制方法，灭菌方法和操作过程以及高压灭菌锅的使用方法。

培养基是根据植物生长发育的需要进行设计和配制的，配制号的培养基由于含有丰富的营养物质，有利于微生物的生长繁殖，因此配制好的培养基要立即进行灭菌。采用高压灭菌锅对培养基进行灭菌主要原理是在高温下使微生物的蛋白质变性，从而达到杀灭微生物的目的。

此部分实验的用具有：电磁炉、不锈钢汤锅（3L）、烧杯、钥匙、托盘电子称、培养瓶、记号笔、量桶、移液管、吸球、玻璃棒、PH计。

所需实验药品有：大量元素、微量元素等母液，蔗糖、琼脂粉、0.1mol/L HCl、0.1mol/L NaOH。

实验内容：

（一）培养基的配制

1、培养配方（烟草诱芽培养基）

MS+2.0/mg 6-BA+8g/L 琼脂+30g/L 蔗糖

2、配制方法

洗涤好各种玻璃器皿后，将所需的各种贮存母液按顺序放好，根据所需配制的培养基的量，按照公式及所需的各种母液的扩大倍数，分别计算吸取各农业的体积。

吸取量=需要配制培养基的体积x需要配制浓度/母液浓度

取500mL烧杯一只，用各母液专用移液管分别吸取各母液，置于烧杯中备用，用纯水定容至1000mL。

取1000mL烧杯一只，将上一步获得溶液倒入，在液面处。将溶液倒入汤锅中，加入蔗糖30g和琼脂8g煮沸，煮沸过程中用玻璃棒不断搅拌，以免结底。

用1mol/L NaOH将培养基的PH值调至5.8-6.0。用碱调节PH时，应用玻璃棒不断搅拌后，再用pH计测试培养基的pH值。

调节好pH后将培养基分装至培养瓶中。分装完成后，随即用专用耐高温高压的塑料薄膜盖上，用两根橡皮筋封口。待灭菌。

（二）培养基的灭菌

把分装好的培养基放入消毒灭菌锅的消毒桶内，将外层锅内加入适量的水。然后盖上锅盖，拧紧后，接通电源加热。当灭菌锅压力表指针移至0.05MPa时，打开放气阀门排出锅内冷空气，待压力表指针回复到零位后，关闭阀门继续加热。连续放气两次后，当灭菌锅的压力表指针移至0.1MPa时，通过调节放气阀，控制热源，使压力表保持在该压力15-20min。灭菌所需时间到后，待灭菌锅压力表压力降低至“0”时，打开排气阀，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。

第三部分：愈伤组织的诱导

通过此部分实验了解无菌培养对实验材料消毒、接种的要求，初步掌握植物外植体材料灭菌方法及接种操作技术，了解外植体愈伤组织诱导过程。

愈伤组织的诱导原理是以幼嫩的器官组织为外植体，在人工培养基和一定的激素诱导下，产生愈伤组织。

所需用具器材有：超净工作台、枪式镊子、解剖刀、酒精灯、酒精缸、玻璃记号笔、脱脂棉、火柴、加盖小烧杯、废液杯、刀片。

所需药品试剂有：70%酒精、0.1%升汞溶液、已灭菌培养基及无菌水

本实验以烟草叶为实验材料。

实验内容：

1、接种前准备

（1）事先备好烟草愈伤组织诱导培养基：MS+NAA(0.2mg/L)+6-BA（2mg/L）接种室准备接种前，打开超净工作台和组织培养室紫外灯照射15-20min，杀死空气中的微生物。台内用70%酒精棉球擦拭干净，台面上放置以下用具：酒精灯、70%酒精缸、酒精棉球瓶、加盖小烧杯、废液杯、枪式镊子、解剖刀、无菌水、