蛋白相互作用&酵母双杂交

Protein-protein Interaction
• 蛋白质之间相互作用以及通 过相互作用而形成的蛋白复 合物是细胞各种基本功能的 主要完成者。 • 几乎所有的重要生命活动， 包括DNA的复制与转录、蛋 白质的合成与分泌、信号转 导和代谢等等，都离不开蛋 白质之间的相互作用。
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蛋白质相互作用研究技术 Genetic
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GST-pull down原理
RIGI
Experimental
(GST-Fusion) GST
MAVS
Control
(GST) GST
GST
MAVS
RIGI
RIGI
GST
Wash SDS-PAGE
GST沉降示意图
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Cross-linking
蛋白相互作用与酵母双杂交
Protein-protein Interaction & Yeast Two-hybrid
黄宝玉 2012.8.17
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报告内容： 1.蛋白相互作用与研究方法 2.酵母双杂交原理和方法 3.酵母双杂交的发展 4.已有实验的进展 5.存在问题与下一步计划
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Yeast Two-hybrid Phage Display Mutational analysis
Chemical
Crosslinking Label-transfer FeBABE mapping
Biochemical
Immunoprecipitation (IP) Co-Immunoprecipitation (CoIP) Pull-Down Assays Far Western
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酵母双杂交所用的两个质粒载体
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Restriction Map and Multiple Cloning Site (MCS) of pGBKT7
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Restriction Map and Multiple Cloning Site (MCS) of pGADT7.
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Elute bound phage
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Amplify eluted phage Repeat selection Analyze a) ELISA b) Specificity c) Sequencing d) Affinity e) Activity
感染 和扩增
E.coli
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测序正确的质粒转化酵母
Transformation of Competent Yeast Cells:
1. 加入质粒DNA 鲑鱼精DNA(变性的，10mg/ml) 加入感受态细胞, 轻弹混匀 加入PEG/LiAc, 轻弹混匀
2. 30℃水浴，每10轻弹混匀 3. 加入DMSO, 轻弹混匀 4. 42℃水浴，每5min轻弹混匀 5. 离心，弃上清，10000rpm 6. 用0.9% NaCl重悬
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原理：
GAL4BD Transcription factors
X
X
rr e e g p n o e t e r
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酵母双杂交的毒性验证：
You should demonstrate that your bait protein is not toxic when expressed in yeast. If your bait is toxic to the yeast cells, both solid and liquid cultures will grow more slowly. If expression of your bait protein does have toxic effects, you may wish to switch to a vector (such as pGBT9) that has a lower level of expression. 1. Materials: • Y2HGold competent cell • SD/–Trp agar plates • SD/–Trp broth 2. Transform 100 ng of the following vectors: • pGBKT7 (empty) • pGBKT7 + cloned bait gene 3. Spread 100 μl of 1/10 and 1/100 dilutions of your transformation mixtures onto SD/–Trp. 4. Grow at 30°C for 3–5 days: Note : If your bait is toxic, you may notice that colonies containing your bait vector are significantly smaller than colonies containing the empty pGBKT7 vector.
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酵母质粒双酶切线性化
10×NEB buffer 100×BSA EcoR I BamH I pGBKT7
1ul 0.1ul 0.2ul 0.2ul 8.5ul
37℃，3h
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融合酶融合
5×In-Fusion HD Enzyme Premix Linearized Vector(50-200ng) Purified PCR Fragment(10-200ng) dH2O
Fluorescent
Immunofluorescence co-localization FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
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噬菌体展示技术的原理
基因型 表达型 融合蛋白 PIII
噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的 DNA 序列插入到噬菌体衣壳 蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随衣壳蛋白的表达而表达， 同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。通过体 外亲和（绑定）靶分子筛选到的噬菌体克隆经过下一轮扩增而富集。
5’-C ATG GAG GCC GAATTC 111 222 333 444 555 666 777 888
Reverse Primer (LLL = reverse complement of last codon of your bait) 5’-GC AGGTCGACGGATCC LLL NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NOTE: These primers actually contain 16 bp of homology in order to keep the BamH I and EcoR I sites intact
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三个启动子，四个报告基因
HIS3. When bait and prey proteins interact, Gal4-responsive His3 expression permits the cell to biosynthesize histidine and grow on –His minimal medium. ADE2.When two proteins interact, Ade2 expression is activated, allowing these cells to grow on –Ade minimal medium. AUR1-C. A dominant mutant version of the AUR1 gene that encodes the enzyme inositol phosphoryl ceramide synthase.its expression confers strong resistance (AbAr) to the otherwise highly toxic drug Aureobasidin A. MEL1. MEL-1 encodes α-galactosidase. As a result of two-hybrid interactions, α-galactosidase (MEL1) is expressed and secreted by the yeast cells. Yeast colonies that express Mel1 turn blue in the presence of the chromagenic substrate X-a-Gal.
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Solution phase selection with biotinylated antigen
antigen biotin
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Bind to Streptavidin
coated microtitre wells
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Wash to remove unbound phage particles.
2 ul x ul x ul x ul
50℃，15min。 Then place on ice.
10ul
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转化大肠杆菌感受态并测序
重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞
挑阳性克隆进行菌落pcr
送测序
测序正确提取质粒
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测序正确的质粒转化酵母
酵母菌株感受态细胞制备：
1.从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA平板上划单克隆，30℃培养3天左 右。 2.从平板上分别挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3ml YPDA的玻璃试管中（平行 做3管）30℃，250rpm，培养8-12h 3.取200ul 菌液，测OD600 。 4.选取OD600值最大的一个试管（即活力最高的一个），吸取5ul转移至50ml新鲜 的YPDA培养基中30℃ ，230rpm，培养16-20h，直至OD600=0.15-0.3。 5.将培养好的菌液转入2个50ml离心管，室温离心3000g，3min，弃上清，用 100ml新鲜的YPDA悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。 6.30℃ ，230rpm培养直到OD600=0.4-0.5（3-5小时）。 7.将菌液倒入2个50ml离心管，室温离心，3000g，3min，弃上清，每个离心管用 30ml ddH2O重悬。 8.再次离心，3000g，3min，弃上清，每管用1.5ml 1.1×TE/LiAc重悬。 9.将重悬的菌液转移到2个ep管中，12000rpm，15s。 10.弃上清，每管用600ul 1.1×TE/LiAc重悬，将两管重悬菌液并入一管，准备进 行转化。
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涂布单缺培养基
pGADT7 Amp+ -Leu pGBKT7 Kan+ -Trp
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挑选发育良好菌落mating并随后二缺四缺 培养基筛选
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酵母双杂交系统的自激活验证
一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上 游活化序列（GAL UAS）结合，但不能引 起转录。然而，将一段具有转录激活活性 的转录因子基因构建到BD载体上，若其表 达产生的 BD 单独与 UAS 结合也可以引起 下游报告基因的转录，那么就称之为酵母 双杂中的自激活现象。
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报告内容： 1.蛋白相互作用与研究方法 2.酵母双杂交原理和方法 3.酵母双杂交的发展 4.已有实验的进展 5.存在问题与下一步计划
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酵母双杂交系统的功能
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酵母双杂交的简单介绍
酵母双杂交原理图
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酵母双杂交系统的原理
X
DNA-BD
GAL4 UAS
100-500ng 5ul 50ul 500ul
30min 20ul 15min 15s 1ml
7 取适量菌液涂布在相应的筛选培养基上。
我们采用的是PEG/ LiAc法转化酵母。 PEG是一种高分子聚合物, 在酵母 转化中起到在高浓度醋酸锂环境中 保护细胞膜,减少醋酸锂对细胞膜结 构的过度损伤,同时促进质粒与细胞 膜接触更紧密。 LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的 感受性状态,此时它们能够摄取外源 性DNA 。DMSO增加细胞通透性以增 加转化效率。 鲑鱼精carrier DNA 为短的线形单 链DNA ,在转化实验中主要是保护质 粒免于被DNA 酶降解;另外还可能在 酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA 中发挥协助作用。在每次使用前务 必进行热变性,使可能结合的双链 DNA 打开,保证鲑鱼精carrier DNA 在 转化实验体系中以单链形式存在。
Promoter
reporter gene
AD
Y
GAL4 UAS Promoter reporter gene
AD
wk.baidu.com
X
DNA-BD
Y
Promoter
transcription
reporter gene
GAL4 UAS
(Fields&Song,1989)
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酵母双杂交系统:三个启动子，四个报告基因
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利用酵母双杂验证两蛋白相互作用实验流程
基因序列克隆
酵母质粒双酶切线性化
融合酶融合
转化大肠杆菌感受态并测序
测序正确的质粒转化酵母
涂板单缺培养基
挑选发育良好菌落mating
涂布二缺培养基
涂布四缺培养基
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基因序列克隆
Amplify your bait insert by PCR using oligos that contain a 24bp homology to your bait, and a 15bp homology to the linear ends of pGBKT7, which are designed as follows: Forward Primer (111 = first codon of your bait)