金属铜离子与蛋白

铜与血清白蛋白


血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质,它可以与许 多内源性或外源性化合物结合,在生命体内起着重 要的储存和输运作用。 血清白蛋白是由肝脏合成的一种简单蛋白质，仅 由氨基酸组成，没有修饰基团和其他附属物。常 以BSA( bovine serum albumin, 牛血清白蛋白) 和 HSA( human serum albumin, 人血清白蛋白)为研 究对象。
O CuII O CuII
酪氨酸酶

酪氨酸酶存在于哺乳动物中，具有两种不同的 催化活性，它既可以催化氧化邻苯二酚（儿茶 酚），又可以催化对甲苯酚的羟基化反应，即 酪氨酸酶具有儿茶酚酶和甲苯酚酶的活性。L酪氨酸在酪氨酸酶的作用下被氧化为L-多巴， 进一步被氧化生成皮肤黑色素。
酪氨酸酶的活性中心与血蓝蛋白双核铜中心类似，但在 酪氨酸酶的活性中心周围更有利于外界分子、底物分子 的接近，从而在双核铜部位发生催化反应。
铜蛋白和铜酶


金属酶的成键方式、配位环境和空间结构与配位化合 物极为类似。配位化学的理论观点和方法可以用来模 拟金属酶生物活性配合物的结构以及结构-性质-功能 的关系, 推定作用机理。 通过配体的设计和剪裁合成出与天然酶活性中心结构 相似的模型配合物, 模拟酶的结构和功能, 这对没有获 得单晶结构、功能及反应机理尚不完全清楚的金属酶 特别适用, 可以得到一些从天然酶研究中不可能得到 的信息。对铜蛋白以及含铜金属模拟酶的研究是近年 来仿生化学工作者研究的热点之一。
• 氧化型质体蓝素的结构基本上不随pH变化而变化，而 还原型质体蓝素的结构随pH变化而变化，当pH较低时， His87发生质子化，而且其咪唑环发生旋转不再与铜离子 配位。
Ⅰ型铜蛋白—阿祖林(天青蛋白)


它是从荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌等细菌中分 离得到的，相对分子质量为14600～17000，含有 一个铜离子，氧化还原电位为280～340 mV。在 电子传递体系中，阿祖林将电子传递给细胞色素， 但供电子体尚不清楚。 在阿祖林的活性中心中，两个His的咪唑氮原子和 一个Cys的硫原子形成一个三角形，Met上的硫原 子和一个蛋白链中的酰胺氧原子分别从三角形的 两边与中心铜离子有弱配位作用。

荧光淬灭可以分为静态淬灭和动态淬灭。能降 低荧光体发光强度的分子称为猝灭剂。基态荧 光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物, 且该复合物使荧光完全猝灭的现象称为静态猝 灭。而激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光 猝灭则称为动态猝灭。
图:Cu2+对BSA溶液荧光发射光谱的影响

研究发现Cu2+能够明显猝灭BSA自身的特征荧 光光谱,并且这种猝灭作用随着Cu2+的浓度的 增大而增强。由于BSA自身的特征荧光主要是 其色氨酸残基(Trp)产生的,表明随着Cu2+浓度 的增加,BSA的骨架结构发生了较大变化,使Trp 暴露出来,造成BSA的荧光猝灭,猝灭机理主要 为静态猝灭。
Ⅱ型铜蛋白--铜锌超氧化物歧化酶
与Ⅰ型铜蛋白相比，Ⅱ型铜蛋白活性中心在谱 学上有几点变化： (1) 铜的氧化还原电位向正的方向移动； (2) 与铜配位的原子由硫变为氮或氧，铜采取典 型的四方锥配位构型； (3) 电子光谱中吸收强度减弱； (4) 电子自旋光谱中超精细偶合常数变大。




Ⅱ型铜蛋白中的铜一般处于配位不饱和状态，即留有 空位，从而可以结合底物分子，并进行催化反应。 代表蛋白：铜锌超氧化物歧化酶（铜锌SOD），它能 有效地催化分解超氧负离子，是一种很好的抗氧化剂， 起到保护生物体的作用。 Cu2Zn2－SOD中含有两个相同的亚基，其中每个亚 基中含有一个Cu2+和一个Zn2+，他们通过一个组氨酸 侧链上的咪唑基团桥联。两个亚基之间主要是通过非 共价键的疏水作用缔合在一起。
铜锌SOD


铜锌SOD中每个铜离子与四个组氨酸侧链上的咪 唑氮原子配位，形成一个变形的四边形，还有一 个水分子在轴向上与铜离子配位，使铜离子为五 配位的变形四方锥构型。每个锌离子为四配位的 变形四面体构型，由三个组氨酸侧链的咪唑氮原 子和一个天冬氨酸的羧基氧原子与锌离子配位而 成。 在这个酶中,Cu2+可能决定了酶的催化特异性，而 Zn2+ 则可能起到稳定蛋白质结构的作用。但全酶 的活性需要两只协同作用。


N-端三肽链 (HSA为Asp1-Ala2-His3 ,BSA为A sp1Thr2-His3)公认是Cu2+(Ⅱ)的强结合位点。通常金 属离子与Asp1的α-NH:和His3的咪唑基N及2个去 质子肽氮(加上轴向的Asp1的羧基)配位,形成平面 四边形(四方锥)构型。 N-端三肽链能够结合金属离子的原因应该是在于 His咪唑基N的配位能力,还有三肽链的灵活易变, 可以折叠围绕金属离子形成所需的特定空间构型。
铜离子与血红蛋白
1. 血红蛋白简介


血红蛋白（Hemoglobin,简称Hb）在体内担任的 功能是输送氧气，它能把从肺携带的氧经由动脉 血运送给组织，又能携带组织代谢所产生的二氧 化碳经静脉血送到肺再排出体外。 血红蛋白化学式为 C3032H4816O812N780S8Fe4 其分 子量约为64500，是含有4个肽链的四聚体。它是 由四个亚基构成，分别为两个α亚基和两个β亚基， 血红蛋白的每个亚基由一条肽链和一个血红素分 子构成。


铜蛋白质参与生物体内的电子传递、氧化还原、 氧的输送以及活化过程。铜蛋白质按其光谱性 质可分为三类: Ⅰ型铜, 600nm 附近有非常强的吸收, 具有小 的超精细偶合常数; Ⅱ型铜, 具有一般铜(Ⅱ) 配合物相近的分子吸 光系数和超精细偶合常数; Ⅲ型铜, 两个铜原子彼此呈反强磁性相互作用, 在 330nm 附近存在强吸收。
荧光光谱法



由于血清白蛋白含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸 残基,从而能发出荧光。在这些基团中Trp起主要 作用,Tyr次之,Phe很弱可忽略，所以，一般认为 蛋白质的荧光主要来自色氨酸的贡献。 当金属离子与血清白蛋白结合后,可引起蛋白质或 少数金属离子(稀土离子)荧光的改变,由此可进行 定性、定量研究蛋白质构象的变化。 常用荧光猝灭法测定金属离子与蛋白质的结合数 和结合常数,用共振能量转移法测定金属离子与蛋 白质分子中色氨酸残基之间的距离。
金属铜离子与蛋白质
内容：
研究的目的及意义 铜与血清白蛋白 铜与血红蛋白 铜蛋白和铜酶

研究目的及意义



在真核生物体内，铜元素参与体内的许多生化反应， 如作为电子传递链中的供体或受体；参与细胞内的呼 吸；维持铁的代谢平衡；用于色素、神经递质的合成； 作为氧化还原酶参与体内的抗氧化过程。 但体内铜离子浓度过高时会产生毒性，改变细胞内的 氧化还原状态；与某些氨基酸残基的侧链发生非特异 反应，导致蛋白质的错误折叠；与其它物质竞争酶的 活性中心，干扰酶的正常功能；产生活性氧损害机体 的DNA、蛋白质和脂类物质 。 所以，研究铜离子与生物分子的作用有重要意义。
左：铜离子、铁离子与血红蛋白反应的紫外光谱图 右：铜离子与血红蛋白反应16小时的紫外光谱图


最后采用电化学微分脉冲伏安法研究了Cu2+与 Fe2+间的作用过程，进一步证实了紫外光谱得到 的结论。 亚铁血红素离子以铁为中心体，形成6配位的正八 面体弱场。按晶体场理论，Cu2+外层电子的3d9结 构比Fe2+的3d6结构更容易形成稳定的配合物，导 致Cu2+在与血红素中的Fe2+进行竞争配位反应时 获得优势，使得铜离子取代了血红素中的亚铁离 子，从而使得体系的电化学性质及紫外光谱图都 发生了一定程度的变化。
蓝铜蛋白（I型铜蛋白）的谱学特征主要 有：



紫外光谱在590～625 nm范围内有很强的 LMCT吸收（配体到金属的电荷跃迁）； 电子自旋光谱中，由铜的核自旋引起的超精细 偶合常数非常小，这是由于Cu-S键的共价性 较大、键长较短造成的； 与一般铜配合物的氧化还原电位（约160 mV） 相比，I型铜蛋白的氧化还原电位都比较高 （200～700 mV）。


人血清白蛋白主要应用于临床、新陈代谢和遗 传方面的研究，而牛血清白蛋白常常作为蛋白 模型进行体外研究，如用于细胞培养，抗体载 体等。 BSA分子由583个氨基酸残基组成。而HSA比 BSA多2个氨基酸，即585个氨基酸残基组成。 两者的差异在于BSA缺失HSA氨基酸序列116 位和585位的残基。
血红素与血红蛋白结构

当血红蛋白不与氧结合的时候，有一个水分子 从卟啉环下方与亚铁离子配位结合，而当血红 蛋白载氧的时候，就由氧分子顶替水的位置。 血红素与它周围的疏水性氨基酸残基依靠范德 华力保持确定的空间构象。
铜离子与血红蛋白相互作用


血红蛋白在280nm附近有一个吸收峰，这是由于蛋白 质中芳香族氨基酸共轭键的紫外吸收所致，在400nm 附近有一个索瑞(soret)吸收峰，这是血红素卟啉环的 π~π*跃迁带，为强吸收峰。 测试牛血红蛋白醋酸缓冲液在加入铜离子醋酸缓冲液 前后的紫外光谱发现，在血红蛋白溶液中加入铜离子 后，不论加入的铜离子浓度有多大，在280nm处的吸 收峰均消失，而其400nm附近的强吸收峰则随着铜离 子浓度的增大降低越来越明显(下图左)，表明铜离子 浓度越大，对蛋白质π~π*跃迁带的破坏性越大。


左：2μmol/L血红蛋白与不同浓度铜离子反应分钟后的紫 外光谱图 右：血红蛋白与铜离子相互作用时随时间变化的紫外光谱 图


由此推测，Cu2+的加入，破坏了血红蛋白中芳香族的共轭 结构；而血红素400nm处的soret吸收峰随着时间的变化 逐渐减弱,于是，在不含铜离子的2μmol/L血红蛋白溶液中 滴加不同浓度的Fe2+ ，发现随着Fe2+的加入，400nm处的 吸收峰增强。 表明400nm处的吸收峰是血红素Fe2+形成的卟啉环的特征 吸收峰。血红蛋白在370nm处无明显的吸收峰，当铜离子 加入后，此处吸收峰明显增强。当反应进行了9小时后， 形成了一个很宽的吸收带，推测是Cu2+取代Fe2+后与血红 素卟啉环所形成铜络合物的吸收峰。

按活性结构中含铜原子的个数又可分为单核、 双核和多核铜蛋白。
含铜电子传递蛋白--Ⅰ型铜蛋白


目前已知的Ⅰ型铜蛋白都是参与电子传递反应 的铜蛋白，该类蛋白一般呈深蓝色，所以也称 蓝铜蛋白。 根据晶体结构，I型铜蛋白中铜的配位环境为 N2SS*，即两个His侧链上的咪唑氮原子、一 个Cys侧链上的硫原子和一个Met侧链上的硫 原子参与铜的配位，形成一个扭曲的四面体结 构。
含铜氧载体--Fra Baidu bibliotek型铜蛋白



Ⅲ型铜蛋白的主要特点是在其活性中心含有两 个铜离子，并且两个铜离子之间存在强的相互 作用。 典型代表有血蓝蛋白和酪氨酸酶。 血蓝蛋白是一种氧载体，存在于蜗虫、章鱼等 甲壳类和软体类动物的血液中。
还原型血蓝蛋白


还原型血蓝蛋白的活性中心含有两个一价铜离子， 每个铜离子与三个组氨酸侧链的咪唑氮原子配位， 两个铜离子之间未发现桥联配体。两个铜离子之 间的空腔正好容纳一个氧分子。 氧化型血蓝蛋白中尽管铜离子为二价d9构型，但 由于两个二价铜离子之间存在很强的反铁磁相互 作用，以致在室温条件下，该双核铜活性中心呈 抗磁性。氧分子结合到血蓝蛋白后，以过氧负离 子状态存在


肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形，把血红 素分子抱在里面，这条肽链盘绕成的球形结构 又被称为珠蛋白。 血红素分子是一个具有卟啉结构的小分子，在 卟啉分子中心，由卟啉中四个吡咯环上的氮原 子与一个亚铁离子配位结合，珠蛋白肽链中第 8位上一个组氨酸残基中的氮原子从卟啉分子 平面的上方与亚铁离子配位结合。
Ⅰ型铜蛋白—质体蓝素


质体蓝素存在于植物和藻类的叶绿体中，在光 合作用下，从细胞色素接受电子再传递给叶绿 体。质体蓝素的分子质量约为11000 D，氧化 还原电位为370 mV左右。 它的活性中心的铜处于变形的四面体构型，由 两个His侧链上的咪唑氮原子、一个Cys侧链上 的硫原子和一个Met侧链上的硫原子与铜配位。