黑色素细胞中黑色素含量的测定和酪氨酸酶活性的测定

黑色素细胞中黑色素含量的测定

和酪氨酸酶活性的测定方法

一、黑色素含量的测定

1.B16小鼠黑色素瘤细胞的准备

离心收集约107个细胞，再用PBS洗2次，离心条件为1000rpm、5min，细胞沉淀备用。

2.除杂

向细胞沉淀中加入200µL纯水重悬细胞，再加入1mL乙醇/乙醚混合液（体积比为1:1），充分摇匀并于室温下静置15min。时间到后，该混合物于3000rpm，5min条件下继续离心，弃上清液，沉淀备用。

3.黑色素颗粒溶解与检测

向所得细胞沉淀中加入1mL10%的DMSO（用1MNaOH配制），充分振荡后于80℃条件下封口放置30min。时间到后于470nm波长处检测吸光度值。黑色素含量计算：

黑色素含量=A/细胞数

二、酪氨酸酶活性的测定

1.B16黑色素瘤细胞的准备

离心收集约107个细胞，再用PBS洗2次，离心条件为1000rpm、5min，细胞沉淀备用。

2.细胞裂解

想细胞沉淀中加入1mL0.5%脱氧胆酸钠，于0℃条件下放置15min。

3.酪氨酸酶活性的测定

时间到后，向以上混合物中加入3mL0.1%L-dopa（用0.1MpH=6.8的磷酸缓冲液配制，该反应混合液应在配制后2h内使用），反应温度37℃，于475nm波长处检测反应0min和10min时的吸光度值。酪氨酸酶活性计算：

酪氨酸酶活性=（A0-A10）/细胞数