实验七--食品中金黄色葡萄球菌的检验
食品中金黄色葡萄球菌检测方法(依据GB4789)
食品中金黄色葡萄球菌的检测方法1.范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌的检测方法。
本标准第一法适用于金黄色葡萄球菌的定性检测；第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。
第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。
2.设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1恒温培养箱：36℃±1℃。
2.2冰箱：2℃～5℃。
2.3恒温水浴箱：37℃～65℃。
2.4天平：感量0.1g。
2.5均质器。
2.6振荡器。
2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器。
2.8无菌锥形瓶：容量100mL、500mL。
2.9无菌培养皿：直径90mm。
2.10注射器：0.5mL。
2.11 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.12全自动微生物生化鉴定系统。
（BD Crystal或Phoenix）。
2.13比浊仪。
（BD Phoenix比浊仪，货号440910）。
2.14比浊仪定标盒。
（BD Phoenix定标盒，货号440911）。
3.培养基和试剂3.110 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤。
3.27.5 %氯化钠肉汤。
3.3血琼脂平板。
（BD 货号脑心浸液琼脂241830胰蛋白大豆琼脂236950作为基础加兔血浆）3.4Baird-Parker 琼脂平板。
（BD 货号 276840）3.5脑心浸出液肉汤(BHI)。
（BD 货号 237400）3.6稀释液：磷酸盐缓冲液。
(BD 货号211544)3.7营养琼脂小斜面。
（BD 货号212000）3.8革兰氏染色液。
（BD 货号212539）3.9无菌生理盐水。
第一法金黄色葡萄球菌的定性检验4.检验程序金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1：图1 金黄色葡萄球菌检验程序5.操作步骤5.1样品的处理称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。
浅析食品中金黄色葡萄球菌检验方法
浅析食品中金黄色葡萄球菌检验方法摘要：金黄色葡萄球菌在自然界中有着十分广泛的分布，能造成食品污染以及细菌性食物中毒，因此在食品检测中必须重点关注金黄色葡萄球菌的检测。
目前，金黄色葡萄球菌的检测方法主要包括反向胶乳凝结法、PCR法、酶联免疫吸附法等，检测人员必须深入了解金黄色葡萄球菌的生物学特性、流行病学特点、致病性等才能保证检测的顺利进行。
关键词：金黄色葡萄球菌；葡萄球菌肠毒素；检测方法[abstract] Staphylococcus aureus is widely distributed in nature，which can cause food contamination and bacterial food poisoning. Therefore，the detection of Staphylococcus aureus should be paid more attention in food detection. At present，the detection methods of Staphylococcus aureus mainly include reverse latex coagulation，PCR，enzyme-linked immunosorbent assay and so on. Only by thoroughly understanding the biological characteristics，epidemiological characteristics and pathogenicity of Staphylococcus aureus，can the detection be carried out smoothly.[Key words] Staphylococcus aureus；Staphylococcal enterotoxin；Detection method隨着经济社会的发展，人们的生活水平逐渐提升，对食物的要求也越来越高。
食品中微生物的检测金黄色葡萄球菌检验
法国梅里埃公司生产的RPF培养基
将兔血浆包括在培养基中作为直接确认菌落的手段
-
+
凝固酶阳性葡萄球菌 : 菌落周围形成沉淀圈 (例) 金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌污染的控制 防止食品污染
防止带菌人群对各种食物的污染： 定期对生产加工人员进行健康检查，患 局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等 ）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性 肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止 其工作或调换岗位。
金黄色葡萄球菌 在甘露醇盐平板上的菌落
Staphylococcus aureus on mannitol salts agar
3、血浆凝固酶试验：
吸取1:4新鲜兔血浆0.5 mL，放入小试 管中，再加入培养24 h的金黄色葡萄球菌 肉浸液肉汤培养物0.5 mL，振荡摇匀， 置 36±1℃温箱或水浴内，每半小时观察 一次，观察6 h，如呈现凝固,即将试管倒 置或 倾斜时，呈现凝块者，被认为阳性结 果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及 肉汤作为对照。
＊＊＊当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较 多的食品，如牛奶和乳制品、肉、蛋等，在温度条 件适宜时，经过8～10小时即可产生相当数量的肠毒 素，肠毒素可耐受100℃煮沸30分钟而不被破坏。人 摄食该菌污染的食物 2 ～ 3 小时后可引起中毒症状， 它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。 此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶 酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。
金黄色葡萄球菌检测实验报告
金黄色葡萄球菌检测实验报告一、实验目的金黄色葡萄球菌是一种常见的病原菌，能够引起多种感染性疾病。
本次实验的目的是通过一系列的检测方法，准确检测出样本中是否存在金黄色葡萄球菌，并确定其数量和特性，为食品安全、临床诊断和环境卫生等领域提供可靠的检测依据。
二、实验原理金黄色葡萄球菌具有一些独特的生物学特性和生化反应，可通过以下几种方法进行检测：1、血浆凝固酶试验：金黄色葡萄球菌能够产生血浆凝固酶，使血浆发生凝固。
2、甘露醇发酵试验：金黄色葡萄球菌可发酵甘露醇产酸。
3、革兰氏染色：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄串状排列。
三、实验材料1、样本：食品样本（如乳制品、肉类）、临床样本（如脓液、血液）等。
2、培养基和试剂：血琼脂平板甘露醇氯化钠琼脂培养基兔血浆革兰氏染色液生理盐水3、仪器设备：恒温培养箱显微镜无菌接种环、移液管等四、实验步骤1、样本处理食品样本：称取一定量的样品，加入适量生理盐水进行均质处理，制成稀释液。
临床样本：直接进行涂片或适当稀释。
2、增菌培养将处理后的样本接种于 75%氯化钠肉汤中，置于 36±1℃恒温培养箱中培养 18 24 小时。
3、分离培养从增菌培养物中分别划线接种于血琼脂平板和甘露醇氯化钠琼脂培养基上，于 36±1℃培养 18 24 小时。
4、形态观察观察血琼脂平板上的菌落形态，金黄色葡萄球菌菌落呈金黄色，周围有明显的透明溶血圈。
观察甘露醇氯化钠琼脂培养基上的菌落，金黄色葡萄球菌能使培养基变黄。
5、革兰氏染色挑取可疑菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄串状排列。
6、血浆凝固酶试验取兔血浆与可疑菌落混合，置于 36±1℃培养箱中观察，若血浆发生凝固，则为阳性。
7、甘露醇发酵试验接种可疑菌落于甘露醇氯化钠琼脂培养基中，观察是否产酸。
五、实验结果1、形态观察在血琼脂平板上观察到金黄色、周围有透明溶血圈的菌落。
在甘露醇氯化钠琼脂培养基上观察到变黄的菌落。
食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验
金黄色葡萄球菌的流行病学
金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在， 空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可 找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要 存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上， 50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球 菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。
金黄色葡萄球菌的流行病学
近年来，美国疾病控制中心报告，由 金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅 次于大肠杆菌。
目前，随着研究的深入，一些快速和采用 现代技术的检测方法不断出现，这些新的快速 方法，一般都缩短了传统检测方法的时间，能 够较快地得到检测结果，并且操作相对简单。 比如：法国梅里埃公司生产的RPF培养基 、API检测系统等。梅里埃公司生产的mini VIDAS利用荧光免疫的方法检测葡萄球菌 肠毒素，在仪器上45 min可以得到结果。
金黄色葡பைடு நூலகம்球菌的致病性
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可 引起局部化脓 感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等， 甚至败血症、脓毒症等全身感染。 金黄色葡萄球菌的致病力 强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶： a.溶血毒素：外毒素，分甲、乙、丙、丁、戊五种，能损伤 血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死； b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液 或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞 的吞噬作用。 葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关； d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶 能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌； e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋 白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E及F六种血清型。
金黄色葡萄球菌的流行病学特点
食品中金黄色葡萄球菌的检测分析
食品中金黄色葡萄球菌的检测分析作者：逯岩来源：《中国卫生产业》 2015年第3期逯岩抚顺市疾病预防控制中心，辽宁抚顺 113006[摘要] 目的对食品中金黄色葡萄菌检测方法中的纸片法进行分析。
方法 2013年6月—2014年6月对三类食品分别定量进行纸片法及B-P平板法的金黄色葡萄球菌检测，将各数据进行记录对比分析。
结果纸片法的检测符合良好，纸片检测与B-P平板法检测结果差异无统计学意义（P>0.05），线性相关密切。
纸片法检测与B-P平板法检测的结果一致性高。
结论纸片法检测具有易操作，省时省力的优点，可以在针对金黄葡萄球菌的食品快速检测中加以推广应用。
[关键词] 食品检测；金黄色葡萄球菌；纸片法；B-P平板法[中图分类号] R155.5[文献标识码] A[文章编号] 1672-5654（2015）01（c）-0020-02Analysis and detection of Staphylococcus aureus in foodLU YanFushun City Center for Disease Control and prevention of Liaoning，Fushun 113006，China[Abstract] Objective The paper detecting method of aureus in food analysis of. Methods In 2013 June to 2014 June detection of Staphylococcus aureus in three types of foods were quantitatively. Disk diffusion method and B-P plate method， eachdata record comparison analysis. Results The detection of paper method accord well，no significant difference between the detection results of slip detection and B-P plate method (P>0.05)， linear correlation closely. Test paper method detection and B-P plate method results consistency. Conclusion Disc assay is easy to operate，time-saving advantages， can be extended and applied in the rapid detection of Staphylococcus aureus in food for.[Key words] Food detection；Staphylococcus aureus；Slip method；B-P plate method[作者简介] 逯岩（1978-），女，黑龙江拜泉县人，主管检验师，本科，研究方向：微生物检验。
食品中金黄色葡萄球菌检验方法
食品中金黄色葡萄球菌检验方法金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ) 是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。
而对于金黄色葡萄球菌在速冻食品中的存在量，卫生部于2011年11月24日公布食品安全国家标准《速冻面米制品》，允许金葡菌限量存在。
实验设备耗材吸管(1ml、10ml)、恒温培养箱(36±1℃)、冰箱、均质器、振荡器、平皿、稀释瓶、天平、显微镜、接种棒等培养基和试剂普通肉汤培养基、胰蛋白胨大豆肉汤、Baird-Prker琼脂平板、缓冲蛋白胨水(BP)、凝固酶试验冻干血浆检验程序(非选择性增菌法)检样25g+225mlBP胨水10ml匀液+10ml双料胰胨肉汤操作步骤1.称取25g固体样品;吸取25mL液体样品，加入225mLBP胨水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。
2.吸取10mL上述混悬液，接种于10mL双料胰蛋白胨大豆肉汤中，置36±1℃培养2h。
3.再加入20ml 含20%NaCl的单料胰蛋白胨大豆肉汤，置36±1℃培养24±2h。
4.划线转种2个表面干燥的Baird-Parker琼脂平板上，36±1℃培养46±2h。
5.挑取可疑菌落移种到肉汤培养基中，置36±1℃温箱培养24h。
6.取肉汤培养物0.3ml同0.5ml凝固酶试验冻干血浆于8mm*100mm试管内充分混合，置36±1℃培养，定时观察是否有凝块形成，至少观察6h，以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动为阳性。
试验中需同时做已知阳性和阴性对照。
对可疑结果，应进行革兰氏染色、镜检和其他辅助试验。
7.本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5～1μm。
在Baird-Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。
食品中微生物的检测-金黄色葡萄球菌检验
血平板上金黄色葡萄球菌 菌落形态
金黄色葡萄球球菌的单个菌落在血 平板上呈金黄色，有时也为白色， 平板上呈金黄色，有时也为白色，大而 突出、圆形、不透明、表面光滑， 突出、圆形、不透明、表面光滑，周围 有溶血圈。 有溶血圈。
金黄色葡萄球菌 BP平板上的菌落形态 在BP平板上的菌落形态
琼脂平板上菌落呈圆形， 在Baird-Parker琼脂平板上菌落呈圆形，表面光 琼脂平板上菌落呈圆形 凸起、 直径2～ 滑、凸起、湿 润，直径 ～3 mm。灰黑色至黑色，有 。灰黑色至黑色， 光泽，常有浅色（非白色）的边缘， 光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围绕以不透明 沉淀），其外常有一清晰带。 ），其外常有一清晰带 圈 （沉淀），其外常有一清晰带。当用接种针触及 菌落时具有黄油样粘稠感。 菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的 菌株，除没有不透明圈和清晰带外， 菌株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相 水食品中分离的菌落， 同。从长期贮存的冷冻或脱 水食品中分离的菌落， 其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙， 其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地 较干燥。 较干燥。
金黄色葡萄球菌的流行病学
近年来，美国疾病控制中心报告，由 近年来，美国疾病控制中心报告， 金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位， 金黄色葡萄Байду номын сангаас菌引起的感染占第二位，仅 次于大肠杆菌。 次于大肠杆菌。
金黄色葡萄球菌的流行病学特点
季节分布，多见于春夏季； 季节分布，多见于春夏季；中毒食品 种类多，如奶、 鱼及其制品。 种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此 剩饭、油煎蛋、 外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起 的中毒事件也有报道。 的中毒事件也有报道。 上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%， 上呼吸道感染患者鼻腔带菌率 ， 所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。 所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。
实验七--食品中金黄色葡萄球菌的检验
实验七食品中金黄色葡萄球菌的检验一、实验目的要求1、了解食品的质量与金黄色葡萄球菌检验的意义.2、掌握金黄色葡萄球菌的生物学特性.3、掌握金黄色葡萄球菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断。
4、掌握食品中金黄色葡萄球菌检验的方法和技术。
二、原理葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品（剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌.金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。
可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。
如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险,检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。
金黄色葡萄球菌能产生凝固酶,使血浆凝固,多数致病菌株能产生溶血毒素,使血琼脂平板菌落周围出现溶血环,在试管中出现溶血反应.这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。
三、试剂和仪器(一）最先准备的器材规格名称数量用途1、500ml广口瓶1个稀释样品2、500ml三角瓶1个制生理盐水3、250ml三角瓶3个制培养基等4、10×100mm试管6支血浆凝固酶试验5、1ml移液管2支6、10ml移液管 2 支7、直径为90 mm平皿12套制血平板B—P平板8、250ml量筒1支（二）应灭菌的其它器材剪刀1把不锈钢汤匙1把称量纸适量（三）应制备的培养基培养基总量所用容器1.无菌水50ml/瓶1瓶250ml三角瓶（全班共用)2.0。
85%生理盐水70ml/瓶1瓶250ml三角瓶（全班共用)3.0.85%生理盐225ml/瓶1瓶500ml三角瓶4.7。
5％NaCl肉汤50ml/瓶1瓶250ml三角瓶5.普通营养琼脂100ml/瓶1瓶250ml三角瓶6.B—P培养基95ml/瓶1瓶250ml三角瓶7.兔血液5ml四、实验内容(一）、增菌培养法样品处理→→选择性增菌→→选择性平板分离→→血浆凝固酶试验鉴别→→结果报告第一天样品处理和增菌培养(一）、样品处理固体或半固体食品：以无菌操作称取25g样品，放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1～2min，制成1：10样品匀液。
食品中金黄色葡萄球菌检验
食品中金黄色葡萄球菌检验（一）原理金黄色葡萄球菌进入人体内，可引起局部的痈疾和蜂窝组织炎，还可引起肺炎、心肌炎、骨骼炎、肾盂肾炎等系统化脓性感染，甚至可发展成败血症。
此外，食品中生长金黄色葡萄球菌是食品卫生中的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌在食品中会产生肠毒素，食用后将引起食物中毒，这在我国细菌性食物中毒事件中，仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌。
因此，检验食品中金黄色葡萄球菌有实际意义。
绝大多数金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生金黄色色素，菌落周围有透明的溶血圈，在厌氧条件下能分解甘露醇产酸，产生血浆凝固酶和耐热性的DNA 酶。
（二）仪器和设备（1）显微镜（2）培养箱：（36±1）℃（3）离心机（4）灭菌吸管：1mL、10mL（5）灭菌小试管（6）培养皿：皿底直径9cm（7）均质机（8）载玻片（10）酒精灯（11）水浴锅（三）培养基和试剂（1）胰酪胨大豆肉汤培养基成分：胰酪胨（或胰蛋白胨）17g 磷酸氢二钾 2.5g植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）3g 葡萄糖 2.5 g氯化钠100g 蒸馏水1000mL 制法：将上述各成分混合，加热时轻轻搅拌使之溶解，分装三角瓶后，于121℃下高压灭菌15min。
最终pH为7.3±0.2。
（2）7.5%的氯化钠肉汤培养基成分：蛋白胨10g 蒸馏水1000mL 牛肉膏3g pH=7.4 氯化钠75g 制法：将上述各成分加热溶解，校正pH，分装于三角瓶中，在121℃下高压灭菌15min。
（3）黄豆粉浸液取黄豆粉5g、氯化钠10g，加入蒸馏水100mL。
置100℃水浴内加热1h，放于冰箱中过夜。
吸取上清液即为黄豆浸液。
（4）牛肉消化汤成分：绞碎牛肉1000g 15%氢氧化钠溶液27mL胰蛋白酶40mL 三氯甲烷1mL氯化钠10g 蒸馏水2000mL 制法：①称取碎牛肉，加蒸馏水，隔水加热到80℃，维持15min。
②加氢氧化钠溶液，pH试纸呈弱碱性，冷至40℃。
金黄色葡萄球菌的测定
食品中金黄色葡萄球菌的检测一、实验目的1、学习和掌握金黄色葡萄球菌的检测方法。
2、了解测定过程中的反应原理。
二、实验原理金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球型菌，分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气，能产生黄色色素。
需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃、PH7.4。
耐盐性强，在含7.5－15%NaC肉汤培养基中能生长。
能产生毒素和酶，如溶血毒素（在血琼脂平板上能形成溶血圈）、血浆凝固酶（区分葡萄球菌是否具有致病性的重要标志）等。
三、实验材料1、被检样：酱油（以金黄色葡萄球菌为对照）2、培养基：（1）．7.5%NaCl肉汤培养基成分：蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化钠 75g蒸馏水 1000m1pH 7.4（2）Baird－Parker培养基制法：将各成分加于蒸馏水中，加热煮沸使完全溶解，冷至25℃，调至pH7.0±0.2，分装每瓶95mL，121℃高压灭菌15min，临用时加热溶化琼脂，冷至50℃左右，于每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL，摇匀后倾注平皿培养基，卵黄亚碲酸盐增菌剂配制：将新鲜鸡蛋浸泡在适当的HgCl2溶液（1∶1000）中约1min，以无菌操作打开鸡蛋，使蛋黄与蛋白分开，将蛋黄加于生理盐水中（3＋7，V／V）充分摇匀，于50mL蛋黄乳液中加入10mL过滤除菌的1％亚碲酸钾水溶液，混匀，4±1℃贮存。
3、试剂：革兰氏染色液、生理盐水4、仪器与设备：恒温培养箱、高压灭菌锅、托盘天平、电炉、吸管、三角瓶、平皿、试管、试管架、酒精灯、75%酒精棉球等。
四、方法与步骤1、检样稀释：以无菌手段吸取酱油样品25m1放于含有225ml灭菌稀释液——生理盐水的玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇作成l：l0的稀释液。
2、增菌：吸取5mL1：10的检样稀释液，接种于50mL已灭菌的7.5%Nacl肉汤培养基内，37℃培养24h。
同时以5mL生理盐水接种于50mL已灭菌的7.5%Nacl肉汤培养基内做对照。
食品中金黄色葡萄球菌检验操作规范(已完)
食品中金黄色葡萄球菌检验操作规范1 检验依据本方法参照GB4789.10-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌菌检验》第二法金黄色葡萄球菌 Baird-Parker平板计数法。
2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.3 恒温水浴箱：37 ℃～65 ℃。
2.4 天平：感量0.1 g。
2.5 均质器。
2.6 振荡器。
2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
2.8 无菌锥形瓶：容量100 mL、500 mL。
2.9 无菌培养皿：直径90 mm。
2.10 注射器：0.5 mL。
2.11 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
3 培养基和试剂3.1 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤；3.2 7.5 %氯化钠肉汤；3.3 血琼脂平板；3.4 Baird-Parker 琼脂平板；3.5 脑心浸出液肉汤(BHI)；3.6 兔血浆；3.7 稀释液：磷酸盐缓冲液；3.8 营养琼脂小斜面；3.9 革兰氏染色液；3.10 无菌生理盐水。
7 检验程序（第二法金黄色葡萄球菌 Baird-Parker平板计数）金黄色葡萄球菌平板计数程序见图2。
图2 金黄色葡萄球菌Baird-Parker 平板法检验程序8 操作步骤8.1 样品的稀释8.1.1 固体和半固体样品：称取25 g样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或置盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2 min，制成1:10的样品匀液。
8.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
食品安全国家标准 金黄色葡萄球菌检验
食品安全国家标准金黄色葡萄球菌检验1 范围本标准规定了食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的检验方法。
本标准第一法适用于食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的定性检验；第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的计数；第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的计数。
2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.3 恒温水浴箱：37 ℃～65 ℃。
2.4 天平：感量0.1 g。
2.5 均质器。
2.6 振荡器。
2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
2.8 无菌锥形瓶：容量100 mL、500 mL。
2.9 无菌培养皿：直径90 mm。
2.10 L涂布棒。
2.11 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
3 培养基和试剂3.1 7.5 %氯化钠肉汤：见附录A 中A.1。
3.2 血琼脂平板：见附录A 中A.2。
3.3 Baird-Parker 琼脂平板：见附录A 中A.3。
3.4 兔血浆纤维蛋白原（RPF）琼脂培养基：见附录A 中A.4。
3.5 脑心浸出液肉汤(BHI) ：见附录A 中A.5。
3.6 兔血浆：见附录A 中A.6。
3.7 稀释液：磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.7。
3.8 营养琼脂小斜面：见附录A 中A.8。
3.9 革兰氏染色液：见附录A 中A.9。
3.10 无菌生理盐水：见附录A 中A.10。
第一法金黄色葡萄球菌定性检验4检验程序金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1。
图1 金黄色葡萄球菌检验程序5 操作步骤5.1 样品的处理称取25 g 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。
食品微生物之检验方法-金黄色葡萄球菌之检验
食品微生物之檢驗方法－金黃色葡萄球菌之檢驗1. 適用範圍：本方法適用於食品中金黃色葡萄球菌及其腸毒素（enterotoxins）之檢驗。
2. 檢驗方法2.1. 工作環境：工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。
每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。
2.2. 器具及材料2.2.1. 乾熱滅菌器。
2.2.2. 高壓滅菌釜。
2.2.3. 冰箱：能維持5 ±3℃者。
2.2.4. 培養箱：能維持內部溫度溫差±1.0℃以內者。
2.2.5. 水浴：能維持水溫溫差±0.2℃以內者。
2.2.6. 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）：能適用於無菌操作者。
2.2.7. 天平：可稱量到2000 g，靈敏度為0.1 g；可稱量到120 g，靈敏度為5 mg。
2.2.8. 顯微鏡：能放大至1000倍之一般光學顯微鏡。
2.2.9. 旋渦混合器（Vortex mixer）。
2.2.10. 離心機：轉速可達3000 rpm以上。
2.2.11. pH測定儀。
2.2.12. 加熱器。
2.2.13. 吸管輔助器（Pipette aid）。
2.2.14. 微量吸管（Micropipette）：10 μL、20 μL、200 μL及1000 μL。
2.2.15. 吸管（Pipette）：已滅菌。
1 mL吸管應有0.01 mL之刻度、5及10 mL吸管應有0.1 mL刻度。
2.2.16. 吸管尖（Tip）：可滅菌。
10 µL、20 µL、200 µL及1000 µL。
2.2.17. 培養皿：已滅菌，內徑約90 mm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮痕或其他缺點。
2.2.18. 稀釋用容器：無菌袋或有1000 mL、500 mL、99 m及90 mL標記附蓋（栓）之可滅菌廣口瓶。
食品中金黄葡萄球菌及其检验
食品中金黄葡萄球菌及其检验第七章食品中致病球菌的检验第一节金黄葡萄球菌及其检验金黄色葡萄球菌及其检验金黄色葡萄球菌属于微球菌科葡萄球菌属,金黄色葡萄球菌是该属中的一个种引起人类疾病的葡萄球菌主要是金黄色葡萄球菌,除可引起皮肤组织炎症外,还可产生肠毒素如果该菌在食品中大量生长繁殖,产生毒素,人误食了含有毒素的食品,就会发生食物中毒,因此,由该菌引起的中毒为毒素型食物中毒食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在威胁,所以检验食品中的金黄葡萄球菌及数量具有实际意义主要内容一、金黄色葡萄球菌的生物学特性二、金黄色葡萄球菌的检验一、金黄色葡萄球菌的生物学特性、形态与染色分型简介、培养特性生化特性毒素与酶抵抗力致病性、形态与染色：(staphylococcusaureus)典型的金黄色葡萄球菌为球型直径μm 左右显微镜下排列成葡萄串状。
金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛大多数无荚膜。
革兰氏染色阳性。
典型的金黄色葡萄球菌为球型直径mm左右显微镜下排列成葡萄串状。
葡萄球菌革兰染色镜下图金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片金黄色葡萄球菌的透射电镜照片分型简介血清学分型：金黄色葡萄球菌水解获得两种抗原成分：蛋白抗原和多糖抗原蛋白抗原主要为葡萄球菌A 蛋白（SPA)是一种表面抗原以上金黄色葡萄球菌有此抗原无特异性。
多糖抗原为半抗原有型特异性。
噬菌体分型根据肠毒素分型根据血浆凝固酶分型、培养特性金黄色葡萄球菌营养要求不高在普通培养基上生长良好需氧或兼性厌氧最适生长温度°C,最适生长pH。
金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性可在NaCl肉汤中生长。
在肉汤培养基中生长迅速℃,培养后h,呈均匀浑浊生长,延长培养时间,管底出现少量沉淀,轻轻振摇,沉淀物上升,旋即消散,培养d后可形成很薄的菌环,在管底则形成多量粘稠沉淀。
、培养特性葡萄球菌在普通营养琼脂平板上培养h后,可形成圆形凸起、边沿整齐、表面光滑、湿润、有光泽、不透明的菌落直径mm。
食品中金黄色葡萄球菌检验
式（2）
案例
T A1B1/ C1 A2B2 / C2其中Leabharlann 1.1d样品稀释液
10-1
10-2
典型菌落数
183
21
T：样品中金黄色葡萄球菌菌落数；
用于做血浆凝固
A1：第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数；
5
5
酶菌落数
A2：第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数；
B1：第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数； 血浆凝固酶阳性
二、金黄色葡萄球菌定性检测
注意事项
Baird-Parker平板： 胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏:提供碳源、氮源、硫、维生素和痕量矿物元素 丙酮酸钠:生长促进剂 亚碲酸盐:对除金黄色葡萄球菌外的其他能分解卵黄菌株有毒性，并使菌落产生黑色 卵黄:提供营养和有利于观察卵磷脂环 甘氨酸和氯化锂:对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。
36±1℃， 24~48h
圆形，光滑突起，湿润，直径23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘 常为淡色（米黄色或灰白色略带 灰色或黄色的白色），周围为一 混浊带，在其外缘常有一透明圈。 用接种针接触菌落似有黄油树胶 的粘稠感。
革兰氏染色
血浆凝固酶鉴别
金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球 菌，排列呈葡萄球状，无芽孢
血平板上其典型菌落呈金黄色，有时也为白色，大 而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。
36℃±1 ℃
45h~48h
计数及血浆凝固酶试验
GB 4789.10-2016 金黄色葡萄球菌的检验第二法
报告
操作规程
样品稀释 同菌落总数检验
选择合适稀释度 接种涂布BP平板
三、金黄色葡萄球菌定量检测
样品处理
移1ml
食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验
血平板上金黄色葡萄球菌 菌落形态
金黄色葡萄球球菌的单个菌落在血 平板上呈金黄色，有时也为白色，大而 突出、圆形、不透明、表面光滑，周围 有溶血圈。
金黄色葡萄球菌 在BP平板上的菌落形态
在Baird-Parker琼脂平板上菌落呈圆形，表面光 滑、凸起、湿 润，直径2～3 mm。灰黑色至黑色，有 光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围绕以不透明 圈 （沉淀），其外常有一清晰带。当用接种针触及 菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的 菌株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相 同。从长期贮存的冷冻或脱 水食品中分离的菌落， 其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地 较干燥。
*金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生 问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起 的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%， 加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此 类中毒事件也非常多。肠毒素形成条件： 存放温度，在37℃内，温度越高，产毒 时间越短； 存放地点，通风不良氧分压低易形成肠 毒素； 食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同 时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。
法国梅里埃公司生产的RPF培养基
将兔血浆包括在培养基中作为直接确认菌落的手段
-
+
凝固酶阳性葡萄球菌 : 菌落周围形成沉淀圈 (例) 金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌污染的控制 防止食品污染
防止带菌人群对各种食物的污染： 定期对生产加工人员进行健康检查，患 局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等 ）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性 肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止 其工作或调换岗位。
＊＊＊当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较 多的食品，如牛奶和乳制品、肉、蛋等，在温度条 件适宜时，经过8～10小时即可产生相当数量的肠毒 素，肠毒素可耐受100℃煮沸30分钟而不被破坏。人 摄食该菌污染的食物2～3小时后可引起中毒症状， 它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。 此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶 酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。
食品金黄色葡萄球菌的检验方法
食品金黄色葡萄球菌的检验方法
1，仪器和设备
1．1恒温培养箱：36±1℃
1．2恒温水浴箱：45±1℃
1．3高压灭菌锅
1．4均质器
1．5试管:18×150mm 18×180mm
1．6锥形瓶:500ml 250ml
1．7平皿：直径为90mm
1．8灭菌吸管
1．9灭菌均质杯
1．10酒精棉
1．11天平:感量0.1g
1．12冰箱：0-4℃和-15～-20℃
2．培养基的制备
2.1生理盐水
称氯化钠8.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，分装锥形瓶和18×150mm试管内，每管吸9ml,121℃高压灭菌15min。
2.2胰蛋白胨大豆肉汤
称大豆肉汤30g和氯化钠95g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装18×180mm试管内，每管吸10ml,121℃高压灭菌15min。
2.3Baird-parker培养基
称6.3g溶于95ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装锥形瓶内，121℃高压灭菌15min。
冷却至50℃，加入1瓶亚碲酸钾卵黄增菌液（冻干粉加5ml无菌生理盐水溶解）混匀。
倾注平板备用，待平板凝固后放入冰箱0-4℃。
2.4普通肉汤培养基
称18g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装18×180mm试管，每管吸10ml，121℃高压灭菌15min。
2.5冻干血浆（凝固酶试验）。
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实验七食品中金黄色葡萄球菌的检验
一、实验目的要求
1、了解食品的质量与金黄色葡萄球菌检验的意义。
2、掌握金黄色葡萄球菌的生物学特性。
3、掌握金黄色葡萄球菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断。
4、掌握食品中金黄色葡萄球菌检验的方法和技术。
二、原理
葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。
金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。
可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。
如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。
金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。
这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。
三、试剂和仪器
（一）最先准备的器材
规格名称数量用途
1、500ml广口瓶1个稀释样品
2、500ml三角瓶1个制生理盐水
3、250ml三角瓶3个制培养基等
4、10×100mm试管6支血浆凝固酶试验
5、1ml移液管2支
6、10ml移液管 2 支
7、直径为90 mm平皿12套制血平板B-P平板
8、250ml量筒1支
（二）应灭菌的其它器材
剪刀1把不锈钢汤匙1把称量纸适量
（三）应制备的培养基
培养基总量所用容器
1.无菌水50ml/瓶1瓶250ml三角瓶（全班共用）
2.0.85%生理盐水70ml/瓶1瓶250ml三角瓶（全班共用）
3.0.85%生理盐225ml/瓶1瓶500ml三角瓶
4.7.5%NaCl肉汤50ml/瓶1瓶250ml三角瓶
5.普通营养琼脂100ml/瓶1瓶250ml三角瓶
6.B—P培养基95ml/瓶1瓶250ml三角瓶
7.兔血液5ml
四、实验内容
（一）、增菌培养法
样品处理→→选择性增菌→→选择性平板分离→→血浆凝固酶试验鉴别→→结果报告
第一天样品处理和增菌培养
（一）、样品处理
固体或半固体食品：以无菌操作称取25g样品，放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1～2min，制成1:10样品匀液。
液体食品:：用灭菌吸管吸取25mL样品，放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇制成1:10样品匀液。
（二）、增菌培养
接种操作：吸取5mL稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中。
37°C培养24小时。
培养：放于36±1℃培养24h。
培养结果：在NaCl肉汤中呈混浊生长，胰蛋白胨肉汤中有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长。
第二天接种选择性平板进行分离培养
（一）、接种选择性平板
取增菌液1环，划线接种于血平板或B－P平板。
（二）、培养
放于36±1℃培养24h。
第三天观察分离结果、镜检、做血浆凝固酶试验
（一）、观察分离结果
结果：金黄色葡萄球菌，在血平板上呈：金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈；在Baird-Parker平板上：菌落为圆形，直径2-3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带，在其外层有一透明圈。
（二）、革兰氏染色、镜检
操作：革兰氏染色→镜检
结果：金黄色葡萄球菌，革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞，直径0.5-1μm。
（三）、结果报告：
综合形态特征，血平板情况以及血浆凝固酶试验结果，判别检样有否金黄色葡萄球菌作出报告。
五、思考题
1、金黄色葡萄球菌在血平板或B－P平板上的菌落特征如何？为什么？
2、食品中能否允许有个别金黄色葡萄球菌存在？为什么？
3、鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标是什么？。