附子生物碱提取影响因素的实验探讨

附子生物碱提取影响因素的实验探讨梁春妹3,严汝庆(广西贺州市人民医院药剂科,广西贺州542800)[摘要]　目的:探讨附子生物碱提取的影响因素,确定适宜的提取条件。

方法:以药典法测定提取物收率,以分光光度法测定生物碱含量,采用单因素试验法,对可能影响附子生物碱提取的因素分别进行考察。

结果:提取溶剂以85%乙醇为宜,采用药材中粉作为提取原料,加10倍量的提取溶剂提取2次,每次1.75h。

以此条件制得的提取物收率为1.21%,生物碱含量为0.33%。

结论:单因素试验所确定的提取条件稳定可行。

[关键词]　附子;生物碱;提取[中图分类号]R283　[文献标识码]A　[文章编号]100125302(2004)0320222203 附子是常用的中药,具有回阳救逆、补火助阳之功。

在许多经方如四逆汤、附子汤、参附汤、真武汤等中均有应用。

其主要有效成分为生物碱类,其中有乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等。

临床上附子大多使用炮制品熟附片、黑附片、黄附片等,主要是因为生附子毒性较大,经炮制加工后其中酯型生物碱被部分除去或水解,而毒性低的乌头原碱含量则增加。

本笔以临床上常用的黑附片为药材样品,对其提取生物碱的工艺中常见的影响因素进行实验探讨。

1　材料、仪器1.1　材料黑附片(贺州市药材公司,经严汝庆鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaili Debx.的子根的炮制加工品),乌头碱对照品(中国药品生物制品检定所)。

其余试剂为市售分析纯。

1.2　仪器UV-751型分光光度计(上海第三分析仪器厂);pHs-2C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)。

2　方法2.1　样品中生物碱的含量测定[1]2.1.1　乌头碱对照品溶液配制　精密称取乌头碱6mg,置25m L量瓶中,加0.01m ol・L-1盐酸溶液,并添加至刻度,摇匀,即得0.24g・L-1的乌头碱对照品溶液。

2.1.2　pH缓冲溶液(pH3.05)　精密称取无水乙[收稿日期]　2002202210[通讯作者]　3梁春妹酸钠0.3g,加适量水溶解,加冰醋酸11.2m L,再加水至1000m L。

混匀。

用pH计测定该溶液的pH值为3.05。

2.1.3　0.1%溴甲酚绿溶液　精密称取溴甲酚绿200mg,用0.05m ol・L-1NaOH溶液3.5m L研磨,加水溶解至200m L,滤过,以氯仿除去脂溶性杂质。

2.1.4　标准曲线制备　精密量取乌头碱标准溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2m L,分别置干燥分液漏斗中,加乙酸钠缓冲液5.0m L与溴甲酚绿指示液2.0m L,加蒸馏水使总体积达到10.0m L,摇匀。

再精密加入氯仿10.0m L,充分振摇3min,静置1h 后,分取氯仿层,用干燥滤纸过滤,弃去初滤液,收集续滤液至已放入0.5g无水硫酸钠的试管中,放置0.5h。

用751型紫外分光光度计,于416nm处测定吸收度。

回归方程:A=0.00312C-0.03568,r= 0.9985。

乌头碱含量在48～288μg具有良好的线性关系。

2.1.5　样品测定方法　取各样品溶液10m L,置分液滤斗中,用浓氨水调pH10～11。

用氯仿萃取5次(每次10m L),收集氯仿液,水浴蒸干。

残渣用0.01 m ol・L-1HCl溶解并定容于10m L量瓶中,混匀。

取此样品供试液2m L,按标准曲线方法操作,测定总生物碱含量。

2.2　样品提取物收率的测定参照药典法[2],取各样品溶液10m L,置已恒重的蒸发皿中水浴蒸干,105℃下干燥3h,取出置干燥器中放冷30min,称重。

按下式计算提取物收率(%):收率(%)=[(W2-W1)/W]×100%。

式中,・222・W2为带提取物的蒸发皿重,W1为蒸发皿重,W为10m L样品液相当的药材重。

2.3　各因素对附子生物碱提取的影响2.3.1　提取溶剂　取药材粗粉,以水、pH3～4盐酸溶液、65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇等作为提取溶剂,分别加10倍药材量溶剂加热回流2次,每次3h。

合并提取液,浓缩或回收乙醇后浓缩至一定的容积,各取10m L分别测定提取物收率与总生物碱的含量,比较不同溶剂的提取效率。

2.3.2　粉碎度　将黑附片药材分别加工成饮片、最粗粉、粗粉、中粉、细粉,分别取适量,加10倍量85%乙醇加热回流提取2次,每次3h。

合并提取液,回收乙醇并浓缩成一定的容积。

各取10m L分别测定测定提取物收率与总生物碱的含量。

2.3.3　溶剂用量与提取次数　取药材中粉适量,分别以6,8,10,12倍药材量85%乙醇加热回流提取2次或3次,每次3h。

合并2次或3次的提取液,回收乙醇并浓缩至一定的容积,各取10m L2份,分别测定提取物收率与总生物碱的含量。

2.3.4　提取时间　取药材中粉适量,以10倍量85%乙醇加热回流提取2次,各样品每次的提取时间分别为0.5,0.75,1,1.25,1.5,1.75,2,2.25,2.5, 2.75,3h。

合并2次提取液,回收乙醇并浓缩至一定容积。

各取10m L2份,分别测定提取物收率与总生物碱的含量。

2.4　提取物乌头碱限量检查取提取物242mg(相当于黑顺片生药量20g),置具塞锥形瓶中,按《中国药典》2000年版一部第150页附子[检查]项下方法操作,检查提取物中乌头碱限量。

3　结果与讨论3.1　提取溶剂的影响水、稀盐酸溶液、不同浓度的乙醇对附子生物碱提取的影响见表1。

表1　提取溶剂对附子生物碱提取的影响(n=3)提取溶剂提取物收率/%生物碱含量/%水 5.11±0.280.13±0.05pH3～4盐酸溶液 3.92±0.190.29±0.0365%乙醇 2.15±0.080.23±0.0375%乙醇 1.73±0.100.26±0.0685%乙醇 1.16±0.050.31±0.0295%乙醇0.86±0.060.27±0.05 结果表明,以85%乙醇为提取溶剂提取附子总生物碱时,生物碱的得率最高。

可能是由于生物碱的脂溶性较大,采用高浓度的乙醇较易提取出来。

而过高的乙醇浓度(如95%),可能由于不易渗透到药材内部,从而影响了提取率。

3.2　粉碎度的影响不同粉碎度的附子药材,用85%乙醇提取生物碱的结果见表2。

表2　药材粉碎度对附子生物碱提取的影响(n=3)药材粉碎度提取物收率/%生物碱含量/%饮片　0.75±0.040.22±0.03最粗粉0.89±0.060.26±0.06粗粉 1.16±0.040.29±0.12中粉 1.17±0.070.33±0.08细粉 1.18±0.090.31±0.09 一般而言,随着药材粉碎度的增大,药材与提取溶剂的接触面积增加,提取物收率与生物碱的得率也随着提高。

结合大生产,采用粗粉作为附子生物碱的提取原料较为适宜。

3.3　溶剂用量与提取次数的影响溶剂用量与提取次数对药材提取率的影响相互关联。

一般而言,提取2次或3次可完成90%以上的提取率。

因此,本实验主要考察了提取2次或3次时溶剂的用量对附子提取效率的影响。

结果见表3。

表3　溶剂用量与提取次数对附子生物碱提取的影响(n=3)溶剂用量/次(药材量倍数)提取物收率/%提取2次提取3次生物碱含量/%提取2次提取3次60.91±0.08 1.15±0.050.25±0.040.30±0.028 1.08±0.12 1.16±0.110.27±0.080.31±0.0510 1.18±0.09 1.20±0.130.32±0.040.32±0.0712 1.19±0.07 1.18±0.140.30±0.060.33±0.10 结果表明,提取2次每次用量为药材量10倍以上时,与提取3次每次用为药材量6倍的提取物收率及生物碱含量均较相近(两者均为P>0.05),考虑到提取次数太多会使工艺时间延长,耗能增加,且3次每次6倍量与2次每次10倍量的溶剂用量总量接近。

因此,认为选择提取2次每次10倍量较为适宜。

3.4　提取时间的影响一般来说,提取时间越长,提取收率越高。

但当提取时间到一定的长度时,提取物收率与生物碱的提取得率均不会再增加。

为找出附子总生物碱适宜的提取时间,本实验从0.5h至3h每隔15min・322・(0.25h)取一个时间点进行考察。

结果见表4。

表4　提取时间对附子生物碱提取的影响(n=2)提取时间/h提取物收率/%生物碱含量/%0.500.870.230.750.920.251.00 1.010.281.25 1.080.291.50 1.150.311.75 1.190.342.00 1.200.332.25 1.190.332.50 1.210.352.75 1.200.323.00 1.180.34 结果表明,当每次提取时间≥1.75h时,提取物收率与生物碱得率不再随提取时间的延长而增加。

因此,确定附子生物碱每次提取时间为1.75h。

3.5　提取物中乌头碱限量检查结果表明,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上不出现的斑点。

可知本实验所制备的提取物生物碱中乌头碱含量符合药典规定。

4　讨论及小结生附子是毒性较大的中药,临床上使用有严格规定。

本实验所用的药材为黑附片经炮制后毒性降低,因为其中的乌头碱含量下降。

另外,由于本实验采用极性较大的溶剂提取,且提取时间较长,一定程度上也使乌头碱水解。

本实验采用药典乌头碱限量检查法对提取物中乌头碱进行了检查,结果发现乌头碱在提取物中含量甚微,基本上不能被检出。

表明本实验所得的提取物的乌头碱基本被水解成乌头原碱,因此毒性较低、安全性较大。

综合4个因素的实验结果可以看出,本实验所选择的考察因素对附子生物碱的提取均有较大的影响。

通过本单因素试验,可确定附子(黑附片)生物碱的的提取条件为:取附子药材中粉适量,加10倍药材量的85%乙醇作为提取溶剂提取2次,每次1.75h。

以此提取条件提取附子生物碱3批,提取物收率为(1.21±0.05)%,生物碱得率为(0.33±0.02)%,表明所确定的提取条件稳定可行。

[参考文献][1]　陈其华,范丽霞.中成药中乌头总碱的酸性染料比色测定法.中国中药杂志,1991,16(8):476.[2]　中国药典.一部.2000.附录:63.Study on experimental factors for extraction of alkaloidsfrom Aconitum carmichailiLI ANG Chun2mei,Y AN Ru2qing(Pharmaceutical Department,People’s Hospital o f H ezhou,H ezhou542800,China)[Abstract]　Objective:T o determine the suitable conditions for extracting alkaloidals from Aconitum carmichaili.Method:Using meth2 ods in Chinese Pharmacopeia for determining yields of extraction,which include spectrometry and single2factor tests,we investigated vavious factors that w ould affect the extraction of alkaloids from Aconiti.R esult:The suitable extractant was85%ethanol,starting material was medi2 um2size powder of aconiti,10times of the v olume of the s olvent was used in extraction for twice1.75h each time.The extraction yield was1. 21%,with a content of0.33%alkaloids.Conclusion:Extraction conditions determined with single factor test was consistent and feasible.[K ey w ords]　Aconitum carmichaili;alkaloids;extraction[责任编辑　刘 ]・422・。