附子生物碱提取影响因素的实验探讨

附子生物碱提取影响因素的实验探讨

梁春妹3,严汝庆

(广西贺州市人民医院药剂科,广西贺州542800)

[摘要]　目的:探讨附子生物碱提取的影响因素,确定适宜的提取条件。方法:以药典法测定提取物收率,以分光光度法测定生物碱含量,采用单因素试验法,对可能影响附子生物碱提取的因素分别进行考察。结果:提取溶剂以85%乙醇为宜,采用药材中粉作为提取原料,加10倍量的提取溶剂提取2次,每次1.75h。以此条件制得的提取物收率为1.21%,生物碱含量为0.33%。结论:单因素试验所确定的提取条件稳定可行。

[关键词]　附子;生物碱;提取

[中图分类号]R283　[文献标识码]A　[文章编号]100125302(2004)0320222203

附子是常用的中药,具有回阳救逆、补火助阳之功。在许多经方如四逆汤、附子汤、参附汤、真武汤等中均有应用。其主要有效成分为生物碱类,其中有乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等。临床上附子大多使用炮制品熟附片、黑附片、黄附片等,主要是因为生附子毒性较大,经炮制加工后其中酯型生物碱被部分除去或水解,而毒性低的乌头原碱含量则增加。本笔以临床上常用的黑附片为药材样品,对其提取生物碱的工艺中常见的影响因素进行实验探讨。

1　材料、仪器

1.1　材料

黑附片(贺州市药材公司,经严汝庆鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaili Debx.的子根的炮制加工品),乌头碱对照品(中国药品生物制品检定所)。其余试剂为市售分析纯。

1.2　仪器

UV-751型分光光度计(上海第三分析仪器厂);pHs-2C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)。

2　方法

2.1　样品中生物碱的含量测定[1]

2.1.1　乌头碱对照品溶液配制　精密称取乌头碱6mg,置25m L量瓶中,加0.01m ol・L-1盐酸溶液,并添加至刻度,摇匀,即得0.24g・L-1的乌头碱对照品溶液。

2.1.2　pH缓冲溶液(pH

3.05)　精密称取无水乙

[收稿日期]　2002202210

[通讯作者]　3梁春妹酸钠0.3g,加适量水溶解,加冰醋酸11.2m L,再加水至1000m L。混匀。用pH计测定该溶液的pH值为3.05。

2.1.3　0.1%溴甲酚绿溶液　精密称取溴甲酚绿200mg,用0.05m ol・L-1NaOH溶液

3.5m L研磨,加水溶解至200m L,滤过,以氯仿除去脂溶性杂质。

2.1.4　标准曲线制备　精密量取乌头碱标准溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2m L,分别置干燥分液漏斗中,加乙酸钠缓冲液5.0m L与溴甲酚绿指示液2.0m L,加蒸馏水使总体积达到10.0m L,摇匀。再精密加入氯仿10.0m L,充分振摇3min,静置1h 后,分取氯仿层,用干燥滤纸过滤,弃去初滤液,收集续滤液至已放入0.5g无水硫酸钠的试管中,放置0.5h。用751型紫外分光光度计,于416nm处测定吸收度。回归方程:A=0.00312C-0.03568,r= 0.9985。乌头碱含量在48～288μg具有良好的线性关系。

2.1.5　样品测定方法　取各样品溶液10m L,置分液滤斗中,用浓氨水调pH10～11。用氯仿萃取5次(每次10m L),收集氯仿液,水浴蒸干。残渣用0.01 m ol・L-1HCl溶解并定容于10m L量瓶中,混匀。取此样品供试液2m L,按标准曲线方法操作,测定总生物碱含量。

2.2　样品提取物收率的测定

参照药典法[2],取各样品溶液10m L,置已恒重的蒸发皿中水浴蒸干,105℃下干燥3h,取出置干燥器中放冷30min,称重。按下式计算提取物收率(%):收率(%)=[(W2-W1)/W]×100%。式中,

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W2为带提取物的蒸发皿重,W1为蒸发皿重,W为10m L样品液相当的药材重。

2.3　各因素对附子生物碱提取的影响

2.3.1　提取溶剂　取药材粗粉,以水、pH3～4盐酸溶液、65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇等作为提取溶剂,分别加10倍药材量溶剂加热回流2次,每次3h。合并提取液,浓缩或回收乙醇后浓缩至一定的容积,各取10m L分别测定提取物收率与总生物碱的含量,比较不同溶剂的提取效率。

2.3.2　粉碎度　将黑附片药材分别加工成饮片、最粗粉、粗粉、中粉、细粉,分别取适量,加10倍量85%乙醇加热回流提取2次,每次3h。合并提取液,回收乙醇并浓缩成一定的容积。各取10m L分别测定测定提取物收率与总生物碱的含量。

2.3.3　溶剂用量与提取次数　取药材中粉适量,分别以6,8,10,12倍药材量85%乙醇加热回流提取2次或3次,每次3h。合并2次或3次的提取液,回收乙醇并浓缩至一定的容积,各取10m L2份,分别测定提取物收率与总生物碱的含量。

2.3.4　提取时间　取药材中粉适量,以10倍量85%乙醇加热回流提取2次,各样品每次的提取时间分别为0.5,0.75,1,1.25,1.5,1.75,2,2.25,2.5, 2.75,3h。合并2次提取液,回收乙醇并浓缩至一定容积。各取10m L2份,分别测定提取物收率与总生物碱的含量。

2.4　提取物乌头碱限量检查

取提取物242mg(相当于黑顺片生药量20g),置具塞锥形瓶中,按《中国药典》2000年版一部第150页附子[检查]项下方法操作,检查提取物中乌头碱限量。

3　结果与讨论

3.1　提取溶剂的影响

水、稀盐酸溶液、不同浓度的乙醇对附子生物碱提取的影响见表1。

表1　提取溶剂对附子生物碱提取的影响(n=3)

提取溶剂提取物收率/%生物碱含量/%水 5.11±0.280.13±0.05

pH3～4盐酸溶液 3.92±0.190.29±0.03

65%乙醇 2.15±0.080.23±0.03

75%乙醇 1.73±0.100.26±0.06

85%乙醇 1.16±0.050.31±0.02

95%乙醇0.86±0.060.27±0.05

结果表明,以85%乙醇为提取溶剂提取附子总生物碱时,生物碱的得率最高。可能是由于生物碱的脂溶性较大,采用高浓度的乙醇较易提取出来。而过高的乙醇浓度(如95%),可能由于不易渗透到药材内部,从而影响了提取率。

3.2　粉碎度的影响

不同粉碎度的附子药材,用85%乙醇提取生物碱的结果见表2。

表2　药材粉碎度对附子生物碱提取的影响(n=3)

药材粉碎度提取物收率/%生物碱含量/%饮片　0.75±0.040.22±0.03

最粗粉0.89±0.060.26±0.06

粗粉 1.16±0.040.29±0.12

中粉 1.17±0.070.33±0.08

细粉 1.18±0.090.31±0.09

一般而言,随着药材粉碎度的增大,药材与提取溶剂的接触面积增加,提取物收率与生物碱的得率也随着提高。结合大生产,采用粗粉作为附子生物碱的提取原料较为适宜。

3.3　溶剂用量与提取次数的影响

溶剂用量与提取次数对药材提取率的影响相互关联。一般而言,提取2次或3次可完成90%以上的提取率。因此,本实验主要考察了提取2次或3次时溶剂的用量对附子提取效率的影响。结果见表3。

表3　溶剂用量与提取次数

对附子生物碱提取的影响(n=3)

溶剂用量/次

(药材量倍数)

提取物收率/%

提取2次提取3次

生物碱含量/%

提取2次提取3次

60.91±0.08 1.15±0.050.25±0.040.30±0.02

8 1.08±0.12 1.16±0.110.27±0.080.31±0.05

10 1.18±0.09 1.20±0.130.32±0.040.32±0.07

12 1.19±0.07 1.18±0.140.30±0.060.33±0.10

结果表明,提取2次每次用量为药材量10倍以上时,与提取3次每次用为药材量6倍的提取物收率及生物碱含量均较相近(两者均为P>0.05),考虑到提取次数太多会使工艺时间延长,耗能增加,且3次每次6倍量与2次每次10倍量的溶剂用量总量接近。因此,认为选择提取2次每次10倍量较为适宜。

3.4　提取时间的影响

一般来说,提取时间越长,提取收率越高。但当提取时间到一定的长度时,提取物收率与生物碱的提取得率均不会再增加。为找出附子总生物碱适宜的提取时间,本实验从0.5h至3h每隔15min

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