中山大学硕士研究生生物医学课程 转录调控基本方法共61页
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转录调控研究常用方法
1. 检测基因的表达水平： mRNA：RT-PCR Protein：WB，ICC，IHC，IF Transcription：报道基因
2. 证明转录因子的功能： 增强: overexpression, constitutively activate 抑制: inhibitor，dominant negative, siRNA，KO mice
3. 导入外源基因方法： 质粒转染，病毒感染，稳定细胞株
转录调控研究常用方法
4. 从源头寻找差异基因方法： gene chip, ChIP on chip, ChIP sequence
5. 启动子分析： 确立启动子核心区 预测启动子上的转录因子结合位点
6. 证明转录因子结合在启动子上： EMSA，ChIP
滴度最高可达109 TU/ml
可插入不超过10kb的 外源片段，滴度 随插入片段长度 增加而降低
高免疫原性
低免疫原性
滴度最高可达105 TU/ml
可插入不超过5kb的 外源片段，滴度随 插入片段长度增加 而降低
低免疫原性
c-Jun靶基因：dp5, puma, caspase-3, atf3, drak2
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合
27
dp5上调是神经元凋亡所必需
28
siRNA
30
Jonathan Ham Lab
32
ATF位点介导c-Jun靶基因上调
ATF site TTACCTCA
反式作用因子 c-Jun/ATF2
7. 蛋白质与蛋白质相互作用 Co-IP, GST-pull down, BiFC, FRET，PLA…
c-Jun靶基因及其对神经元凋亡的调控
3
意义
❖ 神经元凋亡 → AD、PD等神经退行性疾病 ❖ 信号转导与基因调控研究－寻找调控凋亡的关键分子 ❖ 揭示神经退行性疾病机制并确立新的防治靶点
4
JNK/c-Jun是神经元凋亡的关键通路
Dp5启动子上有c-Jun结合的ATF位点
dp5启动子上的ATF位点对其转 录活性是否重要？
报道基因
ATF位点是dp5上调的关键位点
22
c-Jun是否直接结合在dp5启动 子的ATF位点上？
23
Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)
24
c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合
2. 证明转录因子的功能： 增强: overexpression, constitutively activate 抑制: inhibitor，dominant negative, siRNA，KO mice
• 撤NGF处理交感神经元 • 撤钾处理小脑颗粒神经元 • β淀粉样蛋白处理大脑皮质神经元 • 黑质多巴胺神经元凋亡
……
5
6
c-Jun的靶基因是什么？
Fas L Mol Cell Biol 2019
Mol Cell Neurosci 2019 J Cell Biol 2019
Bim Neuron 2019
alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promo.cgi?dirDB=TF_8.3&idCon=135804298400&getFile=resumSearchRes.html alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3
13
JNK/c-Jun介导dp5 表达上调
14
c-Jun直接调控dp5
直接调控: c-Jun结合dp5启动子 触发dp5表达
确立dp5启动子核心区
分析dp5启动子上的TF位点
❖ TRANSFAC：
gene-regulation/pub/databases.html
❖ GenomatixSuite：需注册 ❖ ALGGEN：
Neuron 2019 Neurosci Lett 2019
7
8
寻找c-Jun促凋亡靶基因 －基因芯片方法
促凋亡靶基因： 1 凋亡时上调 2 Ad-169抑制 3 促凋亡作用
25K,5K,5K+ Ad-169 提RNA cDNA
Affymetrix gene chip
Δ169结构示意图
腺病毒技术
p12ATF -( TTACATCA )- c-Jun/ATF2 p12ATF -(GGACATCG)-mut
45
c-Jun 、ATF2协同促凋亡
constitutively activate
c-Jun/ATF2二聚体促进神经元凋亡
49
BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation Assay)
34
c-Jun异二聚体的靶序列
35
36
37
38
39
c-Jun/ATF2形成二聚体
40
Immunoprecipitation (IP)
c-Jun/ATF2介导ATF活性
抑制c-Jun或ATF2保护神经元凋亡
43
干扰c-Jun、ATF2抑制神经元凋亡
44
atf-decoy抑制神经元凋亡
感染率80％
病毒 表达系统 病毒基因组
复制 是否整合
感染细胞类型 表达丰度 表达时间 滴度 克隆容量
免疫原性
各类病毒比较见下表
腺病毒 Adenovirus
慢病毒 Lentivirus
双链DNA病毒
RNA病毒
腺相关病毒 Ad-associated virus
单链DNA 病毒
自主复制 病毒基因组游离于宿主
Chang-Deng Hu et al. 2019, Mol Cell
凋亡时BiFC增多
Fos↑→BiFC↓, Fos↓→BiFC↑
Βιβλιοθήκη Baidu52
Fos抑制c-Jun/ATF2二聚体形成
53
Fos保护神经元
54
55
转录调控研究常用方法
1. 检测基因的表达水平： mRNA：RT-PCR Protein：WB，ICC，IHC，IF Transcription：报道基因
基因组外，瞬时表达
分裂和不分裂细胞
自主复制
病毒基因组整合于宿 主基因组，长时 间、稳定表达
分裂和不分裂细胞
复制缺陷
病毒基因组整合于宿 主基因组，长时间、 稳定表达
分裂和不分裂细胞
高水平表达
中水平表达
高水平表达
快（1-2 天）
慢 ( 2-4天 )
慢
滴度高达1012pfu/ml
可插入高达8kb的外源 片段，滴度随插入片 段长度增加而降低
1. 检测基因的表达水平： mRNA：RT-PCR Protein：WB，ICC，IHC，IF Transcription：报道基因
2. 证明转录因子的功能： 增强: overexpression, constitutively activate 抑制: inhibitor，dominant negative, siRNA，KO mice
3. 导入外源基因方法： 质粒转染，病毒感染，稳定细胞株
转录调控研究常用方法
4. 从源头寻找差异基因方法： gene chip, ChIP on chip, ChIP sequence
5. 启动子分析： 确立启动子核心区 预测启动子上的转录因子结合位点
6. 证明转录因子结合在启动子上： EMSA，ChIP
滴度最高可达109 TU/ml
可插入不超过10kb的 外源片段，滴度 随插入片段长度 增加而降低
高免疫原性
低免疫原性
滴度最高可达105 TU/ml
可插入不超过5kb的 外源片段，滴度随 插入片段长度增加 而降低
低免疫原性
c-Jun靶基因：dp5, puma, caspase-3, atf3, drak2
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合
27
dp5上调是神经元凋亡所必需
28
siRNA
30
Jonathan Ham Lab
32
ATF位点介导c-Jun靶基因上调
ATF site TTACCTCA
反式作用因子 c-Jun/ATF2
7. 蛋白质与蛋白质相互作用 Co-IP, GST-pull down, BiFC, FRET，PLA…
c-Jun靶基因及其对神经元凋亡的调控
3
意义
❖ 神经元凋亡 → AD、PD等神经退行性疾病 ❖ 信号转导与基因调控研究－寻找调控凋亡的关键分子 ❖ 揭示神经退行性疾病机制并确立新的防治靶点
4
JNK/c-Jun是神经元凋亡的关键通路
Dp5启动子上有c-Jun结合的ATF位点
dp5启动子上的ATF位点对其转 录活性是否重要？
报道基因
ATF位点是dp5上调的关键位点
22
c-Jun是否直接结合在dp5启动 子的ATF位点上？
23
Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)
24
c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合
2. 证明转录因子的功能： 增强: overexpression, constitutively activate 抑制: inhibitor，dominant negative, siRNA，KO mice
• 撤NGF处理交感神经元 • 撤钾处理小脑颗粒神经元 • β淀粉样蛋白处理大脑皮质神经元 • 黑质多巴胺神经元凋亡
……
5
6
c-Jun的靶基因是什么？
Fas L Mol Cell Biol 2019
Mol Cell Neurosci 2019 J Cell Biol 2019
Bim Neuron 2019
alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promo.cgi?dirDB=TF_8.3&idCon=135804298400&getFile=resumSearchRes.html alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3
13
JNK/c-Jun介导dp5 表达上调
14
c-Jun直接调控dp5
直接调控: c-Jun结合dp5启动子 触发dp5表达
确立dp5启动子核心区
分析dp5启动子上的TF位点
❖ TRANSFAC：
gene-regulation/pub/databases.html
❖ GenomatixSuite：需注册 ❖ ALGGEN：
Neuron 2019 Neurosci Lett 2019
7
8
寻找c-Jun促凋亡靶基因 －基因芯片方法
促凋亡靶基因： 1 凋亡时上调 2 Ad-169抑制 3 促凋亡作用
25K,5K,5K+ Ad-169 提RNA cDNA
Affymetrix gene chip
Δ169结构示意图
腺病毒技术
p12ATF -( TTACATCA )- c-Jun/ATF2 p12ATF -(GGACATCG)-mut
45
c-Jun 、ATF2协同促凋亡
constitutively activate
c-Jun/ATF2二聚体促进神经元凋亡
49
BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation Assay)
34
c-Jun异二聚体的靶序列
35
36
37
38
39
c-Jun/ATF2形成二聚体
40
Immunoprecipitation (IP)
c-Jun/ATF2介导ATF活性
抑制c-Jun或ATF2保护神经元凋亡
43
干扰c-Jun、ATF2抑制神经元凋亡
44
atf-decoy抑制神经元凋亡
感染率80％
病毒 表达系统 病毒基因组
复制 是否整合
感染细胞类型 表达丰度 表达时间 滴度 克隆容量
免疫原性
各类病毒比较见下表
腺病毒 Adenovirus
慢病毒 Lentivirus
双链DNA病毒
RNA病毒
腺相关病毒 Ad-associated virus
单链DNA 病毒
自主复制 病毒基因组游离于宿主
Chang-Deng Hu et al. 2019, Mol Cell
凋亡时BiFC增多
Fos↑→BiFC↓, Fos↓→BiFC↑
Βιβλιοθήκη Baidu52
Fos抑制c-Jun/ATF2二聚体形成
53
Fos保护神经元
54
55
转录调控研究常用方法
1. 检测基因的表达水平： mRNA：RT-PCR Protein：WB，ICC，IHC，IF Transcription：报道基因
基因组外，瞬时表达
分裂和不分裂细胞
自主复制
病毒基因组整合于宿 主基因组，长时 间、稳定表达
分裂和不分裂细胞
复制缺陷
病毒基因组整合于宿 主基因组，长时间、 稳定表达
分裂和不分裂细胞
高水平表达
中水平表达
高水平表达
快（1-2 天）
慢 ( 2-4天 )
慢
滴度高达1012pfu/ml
可插入高达8kb的外源 片段，滴度随插入片 段长度增加而降低