抗体亲和力成熟

题目：噬菌体文库系列——抗体亲和力成熟

摘要：多策略组合应用，搭配噬菌体展示技术，效果棒棒哒

近年来，随着抗体药物的广泛上市，抗体已经取代基因治疗成为生物制药领域的主要生力军。而抗体在疾病诊断、治疗和预防方面的作用很大程度上取决于其亲和力的高低，随着抗体工程技术的不断发展，如何提高抗体亲和力已成为抗体工程的难题之一。围绕这一问题人们已经从不同的角度展开了研究，例如，提高抗体库的质量、增加抗体库的多样性、进行抗体重链或轻链的替换以及点突变有目的进行氨基酸替换等都能不同程度地提高抗体亲和力。

抗体亲和力表示抗体与抗原结合能力的大小。抗体亲和力成熟是指机体正常存在的一种免疫功能状态。在体液免疫中，再次应答所产生抗体的平均亲和力高于初次免疫应答，这种现象称为抗体亲和力成熟。

噬菌体展示技术作为一种先进的抗体库构建技术能结合多种技术手段，于体外实现抗体的亲和成熟，并配合亲和筛选方法获得具有高亲和力的抗体。在噬菌体抗体展示技术中，VH和VL基因的随机重组，在一定程度上模拟了体内抗体亲和力成熟的过程。如果结合其它技术则可以使抗体的亲和力提高到一个更高的层次，下面介绍一些抗体亲和力成熟的方法。

体外抗体亲和力成熟的几种策略

要想实现抗体的亲和力体外成熟，就必须充分地了解天然抗体的亲和力体内成熟原理，设计模拟体内可能出现和存在的变化，从而促进抗体的体外进化。

天然抗体的亲和力成熟可以分为体细胞高频突变和克隆选择两个过程。在天然抗体亲和力成熟的过程中，抗原刺激下的体细胞高频突变有着举足轻重的作用，因此亲和力体外成熟的策略也多在抗体基因突变水平上，即采用各种突变方法来模拟体内的高频突变。

1.随机突变

（1）错配PCR

通过改变PCR反应条件，提高核酸错配率将随机突变引入基因序列。该技术可以通过提高镁离子浓度、加入锰离子、失衡4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）浓度、使用低保真DNA 聚合酶等方法，来提高抗体基因的突变率。

除此之外，突变率的高低也可以采用改变模板DNA 的复制次数进行控制。复制次数越多，突变率将累积得越高。理论上经过多轮的PCR反应可获得0.15%~3%的突变频率，再用突变的抗体基因库建立噬菌体抗体库，最后从中筛选高亲和力抗体。噬菌体展示技术有效的改善了使用错配PCR技术导致的抗体亲和性和特异性的丧失，以及有效突变体过少的问题。

（2）DNA改组

DNA改组技术是对同源的抗体基因，采用脱氧核糖核酸酶Ⅰ将其切割成不超过50 bp的片段，再随机组合后进行PCR扩增成完整的抗体基因。它包含了抗体片段随机化切割、重组和筛选的过程，一定程度上模拟了天然抗体的亲和力成熟过程，并加快了体外定向进化速度。采用连续多轮的DNA改组具有去除有害突变优势。另外，DNA 改组获得的突变体，突变位点可以位于非抗原直接接触的区域，有扩大库容的作用。

（3）链改组

链改组即链替换技术，是固定抗体的一条轻链或重链不变，而将另一条重链或轻链经过突变处理后，重新与固定链配对，以提高抗体亲和力的方法。该方法保留一条链不变，目的是为了保持抗体的特异性，而将经过突变处理的另一条链与其配对，是为了增加抗体的亲和力，以筛选到更高亲和力的抗体，重复进行链替换和亲和力筛选将产生更高亲和力的抗体。

将噬菌体展示技术与此技术结合构建次级抗体库将使该法更便利。链改组技术能有效提高抗体亲和力，但如果无法明确了解指定抗原的基因结构，或者抗体基因片段未能拥有一个比较完整的初级抗体库，则不适合使用链改组技术。

（4）突变株

Escherichia coli MutD5 是最常用的大肠埃希菌突变株，该菌株可以校对和复制后错配修复缺陷，产生高频率的单个碱基替换，突变率高于普通菌株105倍。突变株法的优势是突变发生在转化宿主菌后，而其他方法的突变均发生于转化之前，而转化效率是限制大容量突变库构建的关键因素之一。使用突变株法可以构建库容为1012- 1014个克隆的超大容量抗体库，利用噬菌体展示技术筛选高亲和抗体，通过该法的可以获得一些未能在定向突变中获得的突

变体。但是该方法较难对突变率进行控制，且获得的随机突变也可能发生于载体部分，造成有害突变。

2.定向引入突变

CDR重组

由于天然抗体在亲和力成熟过程中，体细胞高频突变发生区域并非均匀分布，而是主要集中在与抗原直接接触的CDR(complementarity-determining region,CDR)区。这样既可以获得足够的序列多样性，又不会破坏蛋白质结构。因此在抗体的亲和力体外成熟中，CDR 区是最常选用的定点突变区域。

CDR重组技术即将多种突变或经过设计的DNA序列引入抗体多个CDR区，再利用抗体库技术将这些CDR区进行多次重组，已达到亲和成熟的目的。该技术使噬菌体展示技术得到了更广泛的应用，并且相对于热点突变其能更完整的模拟体内抗体轻链与重链重排的整个过程，该方法可结合多种技术使用。

除了CDR区突变外，天然抗体亲和力成熟中的突变热点也是常见的定点突变位点。这些热点通常包含或接近AGY和RGYW（R = A or G；Y = C or T；W = A or T）序列。

基因工程抗体亲和力成熟的过程其实就是一个体外的分子进化，多样化的选择和扩增的过程。根据对抗体亲和力成熟的认知，各种模拟体细胞高频突变有效引入突变的策略是亲和力成熟的核心，而基于不同原理的突变策略的组合应用可能对基因工程抗体的亲和力成熟有协同增强的作用。研究基因工程抗体的亲和力成熟，制备得到高亲和力的抗体，可以帮助我们在临床上使用低剂量达到我们需要的生物学效应，减少剂量导致的毒性反应，增加治疗效果，在抗体药物研发进程中至关重要。

案例展示