抗体亲和力成熟
抗体亲和力成熟名词解释
抗体亲和力成熟名词解释
抗体亲和力成熟名词解释
抗体亲和力是指抗体与抗原结合的牢固程度，成熟抗体的亲和力通常比未成熟抗体高。
在免疫应答过程中，免疫系统会合成并分泌成熟抗体，这些抗体具有更高的亲和力，能够更有效地结合并清除抗原。
因此，成熟抗体是免疫应答过程中非常重要的。
成熟抗体的重要成分，对于免疫应答的成功和疾病预防具有重要意义。
在免疫应答过程中，免疫系统还会对成熟抗体进行修饰和优化，以提高其亲和力和有效性。
这些修饰和优化过程涉及到多种细胞和分子的相互作用，包括 B 细胞受体的拼接、抗体多样性的产生、抗体酶的修饰等。
因此，成熟抗体是免疫应答过程中至关重要的组成部分，对于维护人体健康和预防疾病具有重要作用。
提高抗体亲和力
提高抗体亲和力 突变策略
内 容
Content
体内二次反应时抗体可变区可以发生局部高频突变，在体外一 般用一下方法： 1、PCR错配（不定向突变）； 2、利用致突变株大肠杆菌在细胞内进行突变（不定向突变）
一些大肠杆菌由于遗传上的缺陷而具有较高的亲和力。举例：mutD5菌 株，由于DNA复制中的错配修复功能的缺陷和聚合酶Ⅲ缺乏3’→5‘外切酶 活性，导致突变率较正常菌株高1000倍以上。
西北师范大学生命科学学院 2009级生物技术1班 zcx
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Li
提高抗体亲和力 突变策略
3、人工合成寡核苷酸（定向突变）
内 容
Content
用人工合成寡核苷酸的方法，在与抗原结合的关键部位有目的地引入突 变可以提高突变效率这些突变通常局限于CDR区。其有两种类型： ①在选定的位置上完全随机，每个位置4个碱基出现的几率相等。 ②通过改进DNA合成的程序，是合成的寡核苷酸在欲导入突变的区段内 含有一定比例的突变。
亲和力抗体在生物
技术领域有更高的 使用价值，因此发 展出在体外提高抗 体亲和力方法。
西北师范大学生命科学学院 2009级生物技术1班 zcx
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Hale Waihona Puke 提高抗体亲和力 高亲和力克隆的选择
2、利用解离速度选择
内 容
Content
抗原抗体结合是一个动态平衡过程，亲和高的抗体具有具 有较慢的解离速率，在生物素化抗原的筛选体系中，当抗原抗 原体系达到平衡后，将反应体系稀释扩大。加入过量非生物素 化游离抗原，可以捕捉解离的亲和力较低的抗体，由此增加高 亲和力抗体的选择。
西北师范大学生命科学学院 2009级生物技术1班 zcx
提高抗体亲和力 突变策略
医学免疫学名词解释
医学免疫学名词解释第1章免疫学概论1、免疫immunity指机体对“自己”或“非已”的识别, 并排除“非已”以保持体内内环境稳定的一种生理反应。
2、免疫防御immunologic defence防止外界病原体的入侵及清除已入侵的病原体和有害的生物性分子。
3、免疫监视immunologic surveillance监督机体内环境出现的突变细胞及早期肿瘤，并予以清除。
4、免疫自身稳定immunologic homeostasis通过自身免疫耐受和免疫调节功能维持免疫系统内环境的稳定。
5、固有免疫innate immunity是机体在种系发育和进化过程中形成的天然免疫防御功能，即出生后就已具备的非特异性防御功能，也称为非特异性免疫。
6、适应性免疫adaptive immunity指体内抗原特异性T、B淋巴细胞接受抗原刺激后，自身活化、增殖、分化为效应细胞，产生一系列生物学效应的全过程，也称特异性免疫。
第2章免疫器官和组织1、黏膜相关淋巴组织/黏膜免疫系统MALT/MIS主要指呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道黏膜固有层和上皮细胞下散在的无被膜淋巴组织，以及某些带有生发中心的器官化的淋巴组织，如扁桃体、小肠派氏集合淋巴结及阑尾等。
2、M细胞即膜上皮细胞/微皱褶细胞，是一种特化的抗原转运细胞，散在于小肠派氏淋巴小结处。
3、淋巴细胞归巢lymphocyte homing成熟淋巴细胞离开中枢免疫器官后，经血液循环趋向性迁移并定居于外周免疫器官或组织的特定区域。
4、淋巴细胞再循环lymphocyte recirculation淋巴细胞在血液、淋巴液、淋巴器官或组织间反复循环的过程。
第3章抗原1、抗原Ag是指能与T细胞的TCR及B细胞的BCR结合，促使其增殖、分化，产生抗体或致敏淋巴细胞，并与之结合，进而发挥免疫效应的物质。
2、免疫原性immunogenicity能刺激机体产生免疫应答，即能使特定的免疫细胞活化、增殖、分化，并产生抗体和致敏淋巴细胞的特性。
中山大学在职研究生学位考试免疫学复习题及答案
中山大学在职研究生学位考试免疫学重点复习题及答案（答案仅供参考，以老师答案为准）细胞因子:是指由免疫原、丝裂原或其它因子刺激细胞所产生的具有调节适应性和固有免疫应答，促进造血，以及刺激细胞活化、增殖和分化的功能的低分子量可溶性蛋白质，为生物信息分子。
抗原提呈细胞:是指具有摄取、加工、处理抗原，并能将抗原信息提呈给淋巴细胞的一类细胞。
根据其功能可分为专职抗原提呈细胞和非专职性抗原提呈细胞，前者包括巨噬细胞、树突状细胞和B细胞；后者包括内皮细胞、纤维母细胞、上皮细胞和间皮细胞等。
抗原:能刺激机体免疫系统启动特异性免疫应答，并能与相应的免疫应答产物在体内或体外发生特异性结合的物质。
免疫耐受:机体免疫系统对某种抗原刺激表现为免疫不应答（即：不能产生特异免疫效应细胞或/和特异性抗体）的现象。
单克隆抗体:是由识别一个抗原决定簇的B淋巴细胞杂交瘤分裂而成的单一克隆细胞所产生的高度均一、高度专一性的抗体。
白细胞分化抗原:造血干细胞在分化成熟不同谱系、各个谱系分化不同阶段以及成熟细胞活化过程中，出现或消失的细胞表面标志。
模式识别受体:单核/巨噬细胞和树突状细胞等固有免疫细胞表面能够识别病原体上某些共有特定分子结构（PAMP）的受体抗原表位:指抗原分子中决定抗原特异性的基本结构或化学集团称为抗原表位或抗原决定基补体系统:是存在于人或脊椎动物血清与组织液中的一组不耐热的、经活化后具有酶活性的蛋白质。
包括30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白，故称补体系统。
移植物抗宿主反应: （GVHR）：是指由移植物中的特异性免疫细胞识别宿主组织抗原而产生的免疫应答，并引起组织损伤。
主要见于骨髓移植。
发生GVHR的条件包括宿主与移植物间组织相容性抗原不符；移植物中含有足够数量的免疫细胞，尤其是T细胞；移植受者处于免疫无能或免疫功能极度低下的状态。
Ig类别转换：在免疫应答过程中，抗原激活B细胞后膜上表达的Ig和分泌的Ig类别从IgM转换为IgG、IgA、IgE等其他类别或亚类Ig的现象。
亲和力成熟技术
亲和力成熟技术发布日期:2020/2/5 10:44:14背景[1-6]亲和力成熟是指机体正常存在的一种免疫功能状态。
在体液免疫中，再次应答所产生抗体的平均亲和力高于初次免疫应答。
这种现象称为抗体亲和力成熟。
亲和力是抗体药物的一个关键参数，通常会影响抗体的功能和药效。
一般而言，采用杂交瘤细胞技术生成的抗体或者人源化抗体已经具有相对较高的亲和力，但是这种亲和力可能并不足以满足治疗性抗体的需要。
目前，药用抗体的研发主要基于杂交瘤细胞或者体外抗体库。
通过抗原设计和抗体筛选，人们初步获得阳性的hits，再进一步通过一系列生物性质检测和功能验证，最终得到有药用潜力的抗体。
在实际研发过程中，经过了常规筛选所得的抗体，有诸多方面需要更细致的改进，包括亲和力、免疫原性、半衰期等等，抗体领域这些年来做了很多相关的研究和实践。
其中，抗体亲和力成熟是研究的重要方向之一。
理论上，抗体亲和力的提高有助于改善抗体的特异性和效力，有助于减少用药剂量，降低毒副作用等。
虽然实际的研究工作证明亲和力的提高与抗体效价的提高并不总是线性的关系，尤其在实体瘤的治疗上，但很多情况下，这个线性关系是明显存在的。
另外，发展抗体亲和力成熟的技术，不仅有助于抗体药物的研发和质量改善，同时也有助于人们更好地理解抗体与靶点相互作用的机理，更好地认识靶点的功能。
以基于抗体库的亲和力成熟策略为例：基于抗体库的抗体亲和力成熟与基于抗体库的抗体筛选并无本质差别，均为体外高亲和力抗体筛选，重点仍是两个方面，即库的构建和筛选系统的选择。
区别在于，后者所用的库在构建或合成时无偏向性或只具有针对某抗原的有限的偏向性；而前者所用的库是基于确定的抗体序列模板所构建的。
1. 建库策略不同建库的策略可分为两个大的类别：一类是构建较大的库，将抗体CDR区域甚至整个V区做随机突变；另一类是构建较小的库，将突变集中于抗体序列上特定的区域。
构建的方法主要有CDR walking、chain shuffling、DNA shuffling等。
再次应答反应时抗体产生过程的特征
再次应答反应时抗体产生过程的特征引言再次应答反应是机体对于已经接触过的抗原再次暴露后，免疫系统产生针对该抗原的更快、更强和更持久的免疫应答。
这种反应主要由B细胞介导，其中抗体的产生是关键步骤之一。
本文将详细介绍再次应答反应时抗体产生过程的特征。
抗原再次暴露引发记忆性B细胞活化再次应答反应中，记忆性B细胞起到了重要作用。
这些细胞是在第一次感染或免疫接种后形成的，并且可以长期存活于体内。
当相同或类似的抗原再次进入机体时，它们能够迅速识别并活化。
记忆性B细胞具有以下特征：•高亲和力：记忆性B细胞表面的B细胞受体（BCR）与特定抗原结合时，其亲和力较高。
这意味着它们能够更有效地与抗原结合，并启动相应的免疫反应。
•多样性：记忆性B细胞群体中存在多个克隆，每个克隆都能识别并结合不同的抗原。
这种多样性使得机体能够应对不同类型的抗原。
•高增殖率：记忆性B细胞在再次暴露后能够迅速增殖，形成大量细胞。
这种高增殖率有助于抗体的产生和释放。
抗体亲和力成熟抗体是由B细胞分泌的特异性免疫球蛋白，其主要功能是与抗原结合并中和病原体。
在再次应答反应中，抗体的亲和力会经历成熟过程，以提高其对抗原的结合能力。
抗体亲和力成熟主要通过两个机制实现：1.亲和选择：在再次暴露后，最初产生的低亲和力抗体开始与抗原结合。
这些抗体会进一步被选择并经历突变，以产生更高亲和力的变异。
只有具有较高亲和力的B细胞才能存活下来，并进一步分化为长寿记忆B细胞或浆细胞。
2.类切换：在再次应答过程中，记忆性B细胞可以通过类切换改变其分泌的抗体的类别。
这种类切换可以将初始产生的IgM型抗体转变为其他类型的抗体，如IgG、IgA或IgE型。
不同类型的抗体在结构和功能上有所差异，因此类切换可以提供更适应特定病原体的免疫保护。
快速抗体产生和释放再次应答反应中，记忆性B细胞能够迅速分化为浆细胞并产生大量抗体。
这种快速的反应速度是由以下几个因素决定的：1.细胞内记忆：记忆性B细胞具有更高水平的mRNA和蛋白质合成能力，以及更多活跃的核仁和内质网。
抗体亲和力提高
——抗体亲和力的提高
小组成员： 李亚 刘苗
雷文丽 张雪艳
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A
B C
TEXT 01
抗体亲和力的提 高
TEXT 02 ☻亲和力是抗体的重要生物参数，在生物技术领域，亲和
力高的抗体有更高的使用价值，因此对抗体亲和力的提
高是备受人们关注的课题
TEXT 03
D
TEXT 04
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D
TEXT 04
西部牛仔（West cowboy），是指18至19世纪的美国，在西部广袤的土地， 一群热情无畏的开拓者。在美国历史上，他们是开发西部的先锋，他们富有冒险 和吃苦耐劳精神，因此被美国人称为“马背上的英雄”。 @单击更换文本
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目录 contents
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β
体外抗体亲和成熟 （多策略引入突变）
☻在体外可以用抗体库技术模拟体内的亲和 β
力成熟过程提高抗体的亲和力。
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突变策略
A B
PCR错配 利用致突变株大肠杆菌在细胞内进行突变
C D
人工合成寡核苷酸 链替换
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目录 PCR错配 A contents
☻TaqDNA聚合酶缺乏3→5的外切酶活性，在DNA合成 过程中没有校正功能 ☻改变PCR的条件，比如加入锰离子，减少脱氧三磷酸 腺苷的浓度，使错配率提升 ☻因此，通过高错配倾向PCR扩增，对可变区进行随 机突变，构建次级突变库
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目录 contents B 利用致突变大肠杆菌在细胞内进行突变
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A
抗体亲和力的提高
对于抗体亲和力的提高，一般针对两个方向
微生物与免疫
??? A. 识别和结合抗原??? B．转导抗原与BCR结合后产生的信号
??? C.Leabharlann 产生协同刺激信号??? D．B细胞活化的辅助受体
??? E．参与Ig从胞内向胞膜的转运
4．B1细胞主要存在于
??? A. 腹膜腔??? B．肠道固有层??? C. 淋巴滤泡
??? A.α1功能区??? B. β1功能区??? C.α2功能区
??? D.α2功能区??? E．α3功能区
16．细胞免疫应答引起的炎症反应主要由
??? A. Thl细胞分泌的细胞因子引起?? B．Th2细胞分泌的细胞因子引起
??? C. Th3细胞分泌的细胞因子引起?? D．Trl细胞分泌的细胞因子引起
7．B-1细胞接受碳水化合物刺激后，产生的抗体主要是
??? A. 高亲和力IgG类抗体??? B. 高亲和力IgM类抗体
??? C. 低亲和力IgG类抗体??? D．低亲和力IgM类抗体
??? E．低亲和力IgA类抗体
8．B细胞作为APC可藉其表面的BCR结合
??? A. 可溶性抗原??? B．病毒抗原??? C. 颗粒性抗原
??? D．各种抗原??? E．细菌抗原
9．可刺激成熟B细胞增殖和(或)分化的细胞因子是
??? A．IL-12??? B．IL-8??? C．TGF-β
??? D. G-CSF??? E．IL-4
10．不成熟B细胞表达的mIg主要为
??? A．mlgA??? B．mlgM??? C，mlgD
A.T淋巴细胞? B.B细胞? C.巨噬细胞?? D.树突状细胞?? E.NK细胞
简述抗体产生的基本过程
简述抗体产生的基本过程抗体是一种由免疫系统产生的蛋白质，具有识别和结合特定抗原的能力。
抗体产生的基本过程包括以下几个阶段：一、抗原刺激阶段当机体遭受外来病原体入侵时，免疫系统会被激活。
这时，免疫细胞会识别并结合病原体表面的特定分子，这些分子就是抗原。
抗原可以是微生物、细胞表面分子、药物等。
二、抗体生成阶段在接触到抗原后，B淋巴细胞会被激活并开始产生抗体。
B细胞上有许多不同的受体，每个受体只能结合一个特定的抗原。
当一个B细胞与其受体所结合的特定抗原相遇时，它就会被激活并开始增殖和分化成大量的克隆细胞。
三、亲和力成熟阶段在大量克隆细胞中，只有那些能够更好地与特定抗原结合的B细胞才会得以存活和增殖。
这个过程称为亲和力成熟。
在这个阶段，B细胞会不断改变其抗体结构，以提高与抗原的亲和力。
四、抗体分泌阶段在亲和力成熟后，B细胞就会分化成两种类型的细胞：浆细胞和记忆B 细胞。
浆细胞是一种能够产生大量抗体的细胞。
它们合成并分泌出特定抗原的抗体，以中和或清除病原体。
记忆B细胞则可以长时间存活，并在再次遇到同一抗原时迅速产生大量特定抗体。
五、免疫记忆阶段当机体再次遭受同一种病原体入侵时，免疫系统就能够更快地反应并产生更多的特定抗体。
这是因为记忆B细胞已经存在于机体中，并能够迅速增殖和分化成大量浆细胞。
这个过程称为免疫记忆。
总之，抗体产生的基本过程包括：抗原刺激、抗体生成、亲和力成熟、抗体分泌和免疫记忆等多个阶段。
这些阶段是相互联系、相互作用的，共同构成了机体免疫系统的复杂调节网络。
免疫学试题及答案
免疫学试题及答案名词解释（10题，每题3分，共30分）1、Antigen：是指能与T细胞的TCR或BCR结合，促使其增殖、分化，产生抗体或致敏淋巴细胞，并与之结合，进而发挥免疫效应的物质。
2、Immunity：免疫是指机体识别和排除抗原性异物，从而维持机体自身的生理平衡和稳定的功能。
3、单克隆抗体：由杂交瘤细胞合成和分泌的针对单一抗原表位的高度均一的特异性Ig，是由单一B细胞克隆产生的、只作用于单一抗原表位的高度均一的特异性抗体。
4、CD：应用以单克隆抗体鉴定为主的方法，将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一种分化抗原归为同一个分化群，简称CD。
5、免疫耐受：对抗原特异应答的T与B细胞，在抗原刺激下，不能被激活产生特异免疫效应细胞，从而不能执行正免疫应答的现象。
或者：免疫系统在其中一种抗原刺激下，表现出的特异性无应答状态。
6、Ig同种型转换：每个B细胞开始时一般均表达IgM，在免疫应答中首先分泌IgM，但随后可表达和产生IgG、IgA或IgE，其IgV不发生改变，同种型转换在抗原诱导下产生，并受T细胞分泌的细胞因子调节。
7、调理作用：指抗体如IgG的Fc段与中性粒细胞、巨噬细胞上的IgFc受体结合，从而增强吞噬细胞的吞噬作用。
8、补体：广泛存在于血清、组织液和细胞膜表面，激活后具有酶活性的蛋白质，包括30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白，故称补体系统。
9、细胞因子：由机体多种细胞分泌的小分子蛋白质，通过结合细胞表面的相应受体发挥生物学作用。
10、抗原提呈：抗原提呈细胞将抗原分子降解并加工处理成多肽片段，以抗原肽-MHC的形式，表达于抗原提呈细胞的表面，被T细胞受体（TCR）识别，从而将抗原信息传递给T细胞1、半抗原：仅具备抗原性而不具备免疫原性的物质，称为不完全抗原，又称半抗原。
半抗原与载体结合后，可成为完全抗原。
2、细粘附分子：是众多介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互接触和结合分子的总称。
根据其结构特点可分为整合素家族、选择素家族等。
可内化的人源抗Met基因工程抗体Fab的亲和力成熟与特性分析
可内化的人源抗Met基因工程抗体Fab的亲和力成熟与特性分析PILII!…,】l,,v,ResearchPapers墨滋龃可内化的人源抗Met基因工程抗体Fab的亲和力成熟与特性分析朱进㈤赵萍lI2焦永军王昕"曹伯良,卜冯振卿"管晓虹"fl'南京医科大学卫生部抗体技术重点实验室,南京210029;)VrdnAndelResearchInstitute,AntibodyLaboratory,MI,49503,USA;,南京军区军事医学研究所,南京2100021摘要应用噬菌体展示技术制备抗Met(HGF受体,'个与肿瘤发生,侵袭和转移相关原癌基区l产物)特异性,高亲和力的全人Fab片段.Fab基因分三步合成,以从错配PCR突变库中筛选出的Fab基因可变区为模板,扩增VH和VL基因,分别与CHl,CL基因融合,合成Fd和L基因,再拼接合成Fab基因,克隆于pComb3XSS中,构建Fab次级抗体库.经细胞筛选和固相筛选,获得高亲和力阳性克隆.工程菌经IPTG诱导表达,SDS—PAGE和蛋F1质印迹分析,在25ku和27ku出现预期大小蛋白质条带.Fab分子经流式细胞术,免疫沉淀,细胞免疫荧光检测,结果表明,Fab能够与sll4和MKN45细胞膜上的Met胞外区特异性结合,而与阴性细胞NIH3T3不结合.抗体内化分析显i,Fab 能够与标记肥皂草毒素(ZAP)的抗人IgG结合,并进入细胞内,抑制Met阳性细胞的牛长,揭示该抗体能够与Met特异性结合,并H被细胞内化.该抗体有望成为肿瘤临床诊断或治疗的候选分子.关键词肝细胞生长因子受体,噬菌体抗体库,亲和力成熟,内化抗体学科分类号Q78随着恶性肿瘤对人类健康威胁的加剧,抗肿瘤研究已成为当令生命科学中极富挑战性且意义重大的领域.研究发掘选择性作用于特定靶点的高效,低毒,特异性强的新型抗癌药物是当今抗肿瘤药物研究的重要方向.而以酪氨酸激酶为靶点的药物研发已成为国际抗肿瘤药物研究的热点[121.目前为止, 已有十多种蛋白酪氨酸激酶抑制剂和抗体进入临床或临床前试验阶段,并取得了令人鼓舞的治疗效果,如1998年美国食品和药物管理局(Foodand DrugAdministration,FDA)批准Herceptin用于治疗某些HER2阳性的转移性乳腺癌f31.蛋白酪氨酸激酶有近6O种,分属2O个家族,其中包括HGF受体Met家族.目前已开展针对HGF/SF和Met的肿瘤治疗,包括应用HGF/SF受体的反义核酸分子,小分子RNA,酪氨酸激酶抑制剂,HGF/SF或/和Met拮抗剂以及抗Met或抗HGF/SF的抗体等『4~叼.2O世纪9O年代重组DNA技术促进了鼠源抗体的临床应用,有上百种抗体药物已进入临床或后期临床试验,如抗肿瘤抗体药物Herceptin,Rituxan等在美国相继批准用于临床,单抗治疗得到了迅速发展,成为生物技术药物研究开发的热点【7j.为了克服单克隆抗体分子质量过大,免疫原性强等缺点,科研人员发展了嵌合抗体,人源化抗体,天然全人抗体以及转基因小鼠等技术,在此基础之上开发出许多小分子抗体片段【81.由于基因工程抗体自身的特点,使其在肿瘤的导向治疗,抗病毒治疗,基因治疗及临床诊断等方面均得到发展,具有广阔的应用前景.本研究以Met为靶标,以噬菌体抗体展示技术为平台,通过抗体重链与轻链互补决定区(CDR.H和CDR.L1部分基因的突变,构建抗Met通讯联系人.Tel:025—86663100,E-mail:*******************.cn 收稿日期:2006—05—31,接受日期:200609.3074生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.的次级抗体库,筛选高亲和力,可内化的抗Met全人基因工程小分子抗体,为研制抗肿瘤药物,肿瘤的诊断和临床治疗提供新的选择.1材料与方法1.1载体和菌株噬菌粒pComb3XSS和pComb3XTT由Barbaslaboratory.theScrippsResearchInstitute惠赠,XL1.Blue购自Invitrogen公司,TOP10F为Stratagene公司产品.1.2工具酶,酶标抗体和引物Taq酶,T4DNA连接酶为Invitrogen公司产品,I内切酶为Roche公司产品.HRP标记的抗M13抗体购自AmershamPharmaciaBiotech公司,Rhodemine标记的抗人Fab购自Sigma公司,FITC标记的抗兔IgG标抗体购自JacksonImmunoresearch公司,其他常规试剂均为Invitrogen和Sigma公司产品,Fc—Met融合蛋白购自R&D公司.实验中所用引物由lnvitrogen公司合成.1.3细胞株S114细胞为稳定表达人Met蛋白的NIH3T3转化细胞株;MKN45为过表达Met的人脑胶质瘤细胞株.培养液为DMEM加入10%FBS,培养条件为37℃,5%CO.1.4抗MetFab抗体次级库的构建1.4.1根据实验室筛选出的全人抗MetFab抗体重链和轻链基因的互补决定区列和Kobat抗体库基因序列数据,设计并合成数/,J核苷酸引物,分别在CDR—Hl,CDR—H2,CDR—H3,CDR—L2和CDR—L3引入有限突变和随机突变.1.4.2以经过错配PCR突变和亲和力初步成熟并筛选出的抗MetFab抗体重链和轻链可变区基因为模板,通过不同引物的配对组合,VL1NL3,VL2/VL4在轻链可变区CDR—L2,CDR—L3引进随机突变,VH2/VH6,VH1/VH4(VH3/VH6),VH1/vH5在重链可变区的CDR—H1,CDR—H2, CDR—H3引入有限突变或随机突变,合成高度多样性的重链可变区基因和轻链可变区基因,经重叠延伸PCR,扩增并拼接合成VH和vL基因库.1.4.3pComb3XTT重组载体为模板,扩增重链,轻链恒定区基因.重链与轻链可变区基因vH,vL和IgG1的CH1,CL为模板,经重叠延伸PCR合成Fd和L基因,将Fd和L基因融合,经3轮PCR合成编码Fab基因.1.4.4Fab基因和pComb3XSS载体分别经I酶切,纯化和连接后,重组质粒用电转化法导入感受态大肠杆菌XL1一Blue中.1.5抗Met特异性内化抗体的筛选1.5.1基于活细胞表面受体的抗MetFab抗体的筛选.以转化并稳定表达Met基因的细胞系S1l4为阳性靶分子进行筛选,以NIH3T3细胞作为阴性筛选细胞.将新鲜制备的,约10"噬菌体抗体首先与S114的前体细胞NIH3T3(Met一)相混合并孵育一定时间,去除抗体库中能够与NIH3T3相结合的非特异性抗体.孵育混合物的上清再与S114细胞(Met) 共同孵育,用完全培养液洗涤细胞10次.将细胞重悬于适量的培养液中,置于细胞培养箱,37~C孵育1h,让结合于细胞表面的噬菌体抗体内化.用甘氨酸缓冲液(pH2.8)洗涤细胞,去除未内化但仍结合于细胞上的噬菌体抗体.冻融并超声破碎细胞,胰酶消化被内化的噬菌体,感染大肠杆菌XL1一blue, 进行下一轮的扩增和筛选.1.5.2噬菌体抗体的固相筛选.将经过NIH3T3/S114细胞系5轮阴性/阳性细胞筛选并富集的噬菌体,进一步用固相抗原筛选.加入经细胞筛选的噬菌体抗体于Met抗原包被的免疫板中孵育,37~C1h.用不同的洗涤试剂如PBST或NHSCN经过多次不同强度的洗涤,去除未结合或者亲和力比较弱的噬菌体,胰酶消化结合在抗原上的噬菌体,感染大肠杆菌XL1一blue,进行下一步分析.1.6Fab的表达与纯化取PhageELISA值最高的克隆,构建TOP10表达工程菌,取单菌落过夜培养并经IPTG诱导表达.表达上清与细菌沉淀高渗提取上清混合,经FPLC纯化,与ProteinL结合的Fab经洗脱和透析处理后,用于活性分析.1.7Fab的免疫学特性分析1.7.1ELISA分析.用羊抗人IgG2mg/L包被酶联板,4℃过夜,次日用封闭液37℃封闭1h后洗板,加入Fc—Met融合蛋白4℃过夜.次日用封闭液37℃封闭lh后洗板,加入梯度稀释的Fab抗体,37~C孵育lh洗板,加入l:l000稀释HRP标记的羊抗人Fab,37~C孵育lh后洗板,显色,酶标仪测A吸光度值.1.7.2免疫沉淀.将Sl14,MKN45和NIH3T3细胞裂解液经冻融,超声和离心后,分别取lml上朱进等:可内化的人源抗Met基因工程抗体Fab的亲和力成熟与特性分析?75? 清夜加入10g的Fab,4~C旋转孵育2h,加入洗涤后rProteinG50l,4~C旋转孵育过夜.样品经PBST2次洗涤后,加入5012xSDS.PAGE电泳上样缓冲液处理,蛋白质印迹检测.1.7.3流式细胞术分析.用S114和NIH3T3细胞在4℃条件下3%BSA封闭15min,洗涤后加入Fab,4"C孵育30min,加入FITC标记的羊抗人Fab,4℃孵育30min.细胞经PBS洗涤两次后,用FACSCaliburcytometer检测,CellQuest分析软件分析(BectonDickinson,Heidelberg,Germany).1.7.4免疫荧光双染检测.将MKN45和NIH3T32种细胞同时培养于同一细胞室中,固定后用封闭液室温封闭30min,同时加入Fab和兔抗人Met抗体,37℃孵育1h.加入Rhodemine标记的抗人Fab和FITC标记的抗兔IgG2种二抗,37~C孵育1h,PBS洗涤后用DAPI染色,LeicaTCSNT激光共聚焦显微镜分析.1.8亲和力测定参照文献[9],用非竞争ELISA法测定抗体的亲和力.1.9Fab内化特性分析为分析Fab分子的内化,用标记肥皂草毒素(saporin1的抗人IgG的Hum—ZAP间接标记Fab分子.肥皂草毒素能够与细胞核糖体亚基结合,抑制细胞蛋白的合成,引发细胞的死亡.Hum—ZAP为连接有肥皂草毒素的抗人IgG,能够与人源抗体分子IgG或Fab特异性结合,被具有内化特性的抗体分子带入细胞内,抑制细胞的蛋白质合成.Hum—ZAP 与抗MetFab按比例混合后,加入培养有NIH3T3和Sl14细胞的96孔培养板中,MTS/PMS法检测.2结果2.1抗Met次级抗体库的构建Fab基因合成分3步进行(图1,2).Fab抗体基因和pComb3XSS载体分别用I酶切,经胶回收并定量后,16℃连接过夜,多次电转导入感受态大肠杆菌XL1一blue,获得了库容为8.96x10.全人抗MetFab抗体库.随机挑取转化克隆,提取重组质粒.DNA测序结果表明,在18个VH和16个VL克隆中,序列正确的克隆分别为15个和13个,其正确率分别为84.2%和83.3%.()臣王懑口ll_[][二二OmpAvLCLpelBpelBvHCHl(d)■■【二二Fd二匿■■[二Fab/[_[二].+---//pLacZFabgene~IFig.1SchematicoutlineoftheapproachusedforFablibraryconstructionLight-chainandheavy—chainFdfragment—encodingDNAsequenceswereamplifiedindependently,fusedbyoverlap—extensionPCR,andcloneddirectionallybyusingtwoasymmetricsitesoftherarecuttersfiI.F abWastranscribedas asingledicistronictranscriptunderthecontrolofoneLacZpromoter. Theamberstopcodon(cross)betweentheantibody genesandbacteriophagegeneⅢenablestheproductionofsolubleFabfragmentsinanon—suppressorstrainofEcoli.(a) Thegenesforthevariableandconstantregionswereamplifiedseparately.(b)Heavy—chainFdandlightchainDNAswere assembledbyvariableregionsandtheirconstantcounterpartrespectivelyusingoverlapPCR .(C)FdandlightchainwerefusedtOformFab—encodingsequencesbyoverlapPCR.(d)FabgenesweredirectionallyclonedintopComb3X SSphagemidbymakinguseoftheIsite.bp65O—+850—400—300一生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.Fig.2ThreeroundsnfPCRforFabrepertoirecloning:DNAladderfbps).2Fah:3Fdfi'agmemofhea~'chain4:I.ign1 "chain;j:Constantregionlighlchain:6:Con~tamc)nofheavy chain:7V ariablere,on01lightchain:.V adablcregionofheavy chain2.2阳性噬菌体抗体克隆的筛选经过5执NIH3T3,,'Sl14细胞筛选和2次固州筛选的噬菌体.感染大1j而十十菌xL1一Blue,随机挑取80个克隆以phageELISA进行咎定,t}-66个为阳性克降阳性牢为825%选取PhageEL1SA检测结果较高的阳性兜隆.过夜培养后提取质串盘许测序.DNA序列分析结果表明,10个【确序列中,有2种不同的『列,分别为Fl和F2F】为8个,F2为2个重复PhageELISA结粜表ll』j.Fl的^.值最高_}鞍稳定.提示F】可能足和力较高的克隆.2.3抗MetFab抗体的表达及纯化Fab诱导表达结果显示.温度对Fab分泌性表达影响较大.在37℃条件下,培养}清未见Fab蛋白.在25℃和20℃时.上清中出现Fab,表达量较低诱导表达前的培养液II加入2%萄褚抑制基础表达.新鲜培养液重悬卸l蔚,;01l八fa1ku36—22—--IFig.3SDS-PAGEandWesternblotanalysisofpurified Fabfa}Fabcoomassiebluestaining.,Standardmol~utemassmarker.j: Fab;m1WestemblotofFobIPTG在25℃条件F诱导表达.{J_硅提高Fab的分泌.表达最l3).2.4抗MetFab抗体免疫学特性分析FobELISA榆测分析我刚.Fab稀释滴度从40糟剑2560倍时,^.Corr值从()782降低剑0I】2(Blank0078l;纪嫂淀结果硅示,Fab能够结台sl14干uMKN45纠抛中的Met}jJ_『体蛋白(17Oku)千¨Met功能赁1(140ku){41.12jku=::Met170—-{:;MetL40一::=:Fig.4[mmunopreeipitathmandWesternblotanalysisofFob Metprotemfromcellexlmcts…immunoprecitatedwithFaband dcl~clcdbyW~lemblolanaly4s,2MKN45S1I4andNIH3T3 celllysatc~mnlunopreclpitalcdwithFab:{:g1I4[ysalconly:5.6: MKN45andSII4celllv--ale1ml1_unaprecipltaledw~thoulFah FACS分所结果显示该Fab抗体能够与犬鞋表达Met基因的S1I4细胞特性结台.与:刘j蛙细胞NIH3T3胞没有构结合(罔51荧光烈染结果挺I归,Fab抗体引驯-r2细胞MKN45的结合信号.抗Met的彩克隆抗体信号番,而阴对州钏胞NIH3T3基本没有信号(6l,显示Fob抗体是特异性结合丁划胞表面的HGF受件Met蛋臼以们f究结果表明.Fab分子具有与Met胞外I的灭然构象结合的能力柯l特异陀,萁亲和常数,14763×10mol/L,i突变前抗体的亲霉J力Kd值5.24xl0mol,'Ll丰HlE,提一断约90倍.2.5抗MetFab抗体内化特性分析MTS,,'PMS榆}结果示,100ngFal0(】ngHum—ZAP能够有效抑制细胞的生长DIl入的药物增加I圳胞生长抑制摩电I孵增r'加八的Fab,"Hum.ZAP量从l∞ng增加剑800ng叫,孵育96h后,圳咆牛抑制率2599%提高到7338%,而仅加入抗体或毒豢的sI14细咆和加入两者混台物的NIH3T3细胞晌}乏未受明显影响(罔7).该结果提,Fah分子能够s114细胞表面的Met特异性结台.并HlJ成的抗原一抗体复合物能够被转入细胞内此该Fob分子I-rJHJ偶联抗f=ll}j癣的毒素,化学药物或放射性物质.作为肿痛牛物治疗的性选分子)lcn¨{l20l帅4|l朱进等:可内化的人源抗r~lel基因工程抗体Fab的亲和力成熟与特畦分析F#5rhebindingabilityqpFFabwtesledbyFAt'SanalysisNIl1I3……lhl川wilhhh…1l川-Ⅲda…tihLlm口1]nh0u,【mJ]liLt)l¨witlnl㈨l4cl……cubawilhhb帅lIIT(咄…nnli-IFal,'¨岫Ivc"dl……1n…}ahfrc…IJ1c1¨gn(loealiLufl●l¨deteeti¨i1i (I)F?lhand_uhbilnII.MIanlFh●Jdy,andRh..damln.c0Ⅷadanti-FnI,mibod)a『IdFIq(-conjugatedanti—rahbilantibodMKN45klllt~NiltlIccll~wlLuh[ir~dⅢtP1c.…lch口ⅢbcFjg?7InhibitionratioonSI14cell,aryingccIllr…liFabnndIlun-ZAI,in96h●bab;=/Ap:-FabizAP3讨论77HGF受诈(Met)客脆以异策¨帕形^.世卅个50ku"刊个145kIl岫B,"p.,【肚以航键十『i琏.q,他J肚仆.Bl,}{f胞外Ji,』々}ff…地目『x3j仆爿i』,}地～斛氨腹馓怖Mcl自J呲ff-7.s川u也【【Ir(hepaLocytegrowthfactor,HGF),',fj_【【J(scat~etlhctortSF)Me1HGF/SF1痈,帅帆删K朦瓢眦)黼帛,r惭煽帆『订别癌和腑城惭等gm豪哒J此Met已戚『:物淆疗的怀.凡源执Met节m～__一∞l_l==一_.』㈣如m0tlIl1_l…78生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys. 工程抗体成为较好的"导弹"本实验室从天然抗体库中筛选出抗MetFab分子,但其亲和力较低,需进行亲和力成熟,而抗体库的筛选是抗体亲和力成熟的重要步骤.抗体库的筛选策略直接影响筛选的结果.目前,有固相筛选,液相筛选和活细胞筛选等方法,不同的方法各有优缺点,需要结合实验目标进行选择和优化组合.在本研究中,首先选用Met过表达细胞Sl14和阴性细胞NIH3T3进行5轮消减筛选,再用Met包被的免疫板筛选2轮.细胞筛选的优势是,细胞表面膜蛋白多经过翻译后修饰,具有特定的空间构象,筛选出的抗体能够高效,特异地结合靶标,可以直接用于体外或体内的研究.固相筛选可以提高筛选的特异性和筛选效率【l31.实验结果表明,利用该方法获得的随机克隆的阳性率为82.5%.在抗体筛选过程中,洗涤的严谨性和洗涤强度对实验结果同样有着明显影响.洗涤强度过弱,出现较高的假阳性,超过85%的克隆含空载体或截短的抗体基因片段.因为噬菌粒较小的噬菌体,包装速度相对要快,外源蛋白的毒性也影响着噬菌体的增殖.在宽松的洗脱条件下,经过几轮扩增,这些非特异的噬菌体会迅速增~jH[14,151.在抗体免疫学特性分析中,采用酶联免疫,免疫沉淀,流式细胞术,细胞双染等方法,从多个方面验证该抗体的特异性.在ELISA检测中,采用真核表达的Met抗原包板,使筛选和鉴定抗原尽可能与细胞表面的抗原结构相一致,细胞筛选和固相筛选相结合,提高了筛选的效率.在II)和FACS中,用Sl14细胞(Met转化的NIH3T3细胞)和NIH3T3细胞作对照研究,提高了实验结果的准确性,用两种荧光染料和抗Met特异性单抗scFv,同时检测培养在同一培养室中的MKN45和NIH3T3,保证了实验结果的可靠性.基因工程抗体具有免疫原性弱,组织穿透能力强,便于大规模生产等优点,但抗体的亲和力仍然是人源基因工程抗体临床应用的瓶颈.已有的文献表明,大量的研究工作致力于高亲和力抗体的筛选.Weinstein等的研究认为,过高的亲和力抗体导致位阻效应的产生,影响抗体的穿透力,尤其是针对实体瘤的抗体.抗体的亲和常数达到10～10一s具有较好的临床应用价值1.在本研究中,抗体的亲和力从值5.24x10mol/L,增加到4.763×10mol/L,提高约90倍,同时保持与Met胞外区结构域的结合特异性,通过与特定抗肿瘤药物偶连,可强化临床治疗效果11,从而为肿瘤的临床治疗提供候选药物.参考文献lFabbroD,RuetzS,BuchdungerE,et.Proteinkinaseastagetsfor anticanceragents:frominhibitorstousefuldrugs.FharmacolTher. 2002,93(2～3):79~982ShawverLkSlamonD,UllrichA.Smartdrugs:tyrosinekinase inhibitorsincancertherapy.Cancercell,2002,l(2):117--1233CiardielloF,TortoraG.Anovleapproachinthetreatmentofcancer: targetingtheepidermalgrouthfactorreceptor.ClinCancerRes, 2001,7(1O):2958~29704MatsumotoK,NakamuraT.NK4(HGF—antagonist/angiogenesis inhibitor)incancerbiologyandtherapeutics.CancerSci,2003,94(4):321～3275CaoB,SuYL,OskarssonM,eto1.Neutralizingmonoclonal antibodiestohepatocytegrowthfactor/scatterfactor(HGF/SF) displayantitumoractivityinanimalmodels.ProcNatlAcadSciUSA,2001,98(13):7443~74486BorowiakM.Metprovidesessentialsignalsforliverregeneration. ProcNatlAcadSciUSA,2004,101(29):10608~106137PopkovM,JendreykoN,McGavemDB,et.Targetingtumor angiogenesiswithadenovirus—deliveredanti—Tie一2intrabody.Cancer Res,2005,65(3):972--98l8RothlisbergerD,HoneggerA,PluchthunA.Domaininteractionin thefragment:acomparativeevaluationofthesingle—chainFvand Fabformatengineeredwithvariabledomainsofdifferentstability.J MolBio1.2005.347(4):773～7899BeattyJD,BeattyBG,VlahosWG.Measurementofmonoclonal antibodyaffinitybynon-competitiveenzymeimmunoassay.J ImmunolMethods,l987,100(1):l73～l7910BladtF,RiethmacherD,IsenmannS,et.Essentialroleforthec-Metreceptorinthemigrationofmyogenicprecursorcellsintothe limbbud.Nature,l995,373(6543):768--77l1lShinomiyaN.V andeWoudeGF.SuppressionofMetexpression:a possiblecancertreatment.ClinCancerRes,2003,9(14):5085～509012ZhangYW.V andeWoudeGF.HGF/SF—Metsignalinginthe controlofbranchingmorphogenesisandinvasion.JCellBiochem, 2003,88(2):408～4l713SoufiauC,RothackerJ,HennerR,et.Humanantibodyfragments specificforepidermalgrowthfactorreceptorselectedfromlargenon—immunisedphagedisplaylibraries.GrowthFactor,2004,22(3):185～19414LeclercE,LiemannS,WildeggerG,eto1.Selectionand characterizationofsinglechainFvfragmentsagainstmurine recombinantprionproteinfromasynthetichumanantibodyphagedisplaylibrary.HumAntibodies,2000,9(4):207--21415WeinerLM,CarterP.Tunableantibodies.NatureBiotech,2005,23(5):556～5572007;34(1)朱进等:可内化的人源抗Met基因工程抗体Fab的亲和力成熟与特性分析?79?16OsdolW,FujimoriWeinsteinJN.Ananalysisofmonoclonal antibodydistributioninmicroscopictumornodules:consequences ofa"bindingsitebarrier".CancerRes,1991,51(18):4776～478417CarterP.Improvingtheefficacyofantibody—basedcancertherapies. NatRevCancer,2001,1(2):118～12918GumT.Therapeuticantibodies:magicbulletshitthetarget.Nature,2002,417(6889):584~586AffinityMaturationandCharacterizationofInternalizedHumanAnti-MetRecombinantAntibodyFabZHUJin,,ZHAOPing,JIAOY ong—Jun",WNGXin",CAOBo—Liang,FENGZhen—Qing",GUANXiao—Hong('LaboratoryofAntibodyTechniqueofMinistryofHealth,NanjingMedicalUniversity,Nanj ing210029,China;V anAndelResearchInstitute,AntibodyLaboratory,MI49503,USA;~HuadongMedicalInstituteofBiotechniquesNanjing210002,China) AbstractHiaffinity,fullyhumanantibodyfragmentFabthatspecificallybindtoHGFrecepto r,Met(aproto—oncogeneproductandakeymoleculeontumorigenesis,invasionandmetastasis),wasselecte dfromphagedisplayantibodylibrary.Toconstructantibodylibrary,theFabgenefragmentwasconstructe din3steps.The variableregiOngeneswereamplifiedfromVHandVLofanti—MetFabselectedfromerror —pronePCRmutationlibrary.FabgenewasassembledbyoverlapPCRandpurifiedanddigestedwithI,andinsertedi ntopComb3XSS.Positivephage—displayedantibodycloneswereselectedonlivecelllinesandimmobilizedprotein. ThepurifiedFabwasverifiedbySDS—PAGEandWestemblot,whichshowedtwobandsatabout25kuand27ku attheexpectedsizes.ToanalyzetheimmunologicalcharactersofFabforMetbinding,flowcyt ometryand immunoprecipitationassaysweresetupandcarriedoutwithS114,MKN45andNIH3T3celll ines.Theresults demonstratedFabcouldbindnativeMetspecificallyontheS114andMKN45cellsurface.Inv itrocytotoxicassayshowedthatonlyHum—ZAP/anti—MetFabcomplexcouldinhibittheMetpositivecellgrowth,itilluminatedthatanti—MetFabboundtheMetonMetpositivecellsurfaceandwereinternalized.ForMetnegativecel llineNIH3T3, nosignificantinhibitionamongthedifferentdosagesofFabandHum—ZAP.Theresultsshowedthatanti—MetFab antibodyfragmentscouldrecognizeMetextracellulardomaininnativeconformationwithre lativelyhighaffinity.Importantly,theseantibodyfragmentswereabletobeinternalizedintoMetover—expressedtumorcelllinesthroughbindingtotheMetreceptor,andcouldbeappliedasapotentialpowerfulreagentsforcl inicaltherapy.Keywordshepatocytegrowthfactorreceptor(Met),phage—displayedantibodylibrary,affinitymaturation,internalizedantibodyCorrespondingauthor.Tel:86—25—86663100.E—mail:*******************.cn Received:May31,2006Accepted:September30,2006'。
提高抗体亲和力
实验显示，抗体与 抗原结合能力巨大， 远超过体内的选择 能力，同时通过体 外亲和力成熟可获 得极高亲和力的抗 体，应用广阔。
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提高抗体亲和力 内 容 Content
高亲和力克隆的选择
3、改变洗脱条件
为了筛选得到高亲和力的抗体，可以提高洗脱液的洗脱能 力，如降低PH值。举例：不同浓度的硫氰酸盐具有不同能力 的洗脱能力，被用于测定抗体的相对亲和力。在噬菌体抗体筛 选中，用不同浓度的硫氰酸盐溶液在抗体库筛选中作为洗脱液， 这样可以洗脱不同亲和力的抗体，由此可以选择出高亲和力抗 体。
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提高抗体亲和力
总 结 Summary
亲和力是抗体的重 要生物学参数，高 亲和力抗体在生物 技术领域有更高的 使用价值，因此发 展出在体外提高抗 体亲和力方法。
体内亲和力成熟所 能达到的程度是有 限的，体外可以定 向的进行菌株的突 变，选择性更高， 选出抗体的亲和力 更强。
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提高抗体亲和力 内 容 Content 突变策略
4、链替换
以亲本抗体的在固定其重 链，用同样的方法选择具有更高亲和力的轻链。
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提高抗体亲和力 内 容 பைடு நூலகம்ontent
突变策略
体内二次反应时抗体可变区可以发生局部高频突变，在体外一 般用一下方法：
1、PCR错配（不定向突变）； 2、利用致突变株大肠杆菌在细胞内进行突变（不定向突变）
靶向治疗的抗体药物研发技术
靶向治疗的抗体药物研发技术抗体药物作为现代医学领域的重要研究方向之一，已经成为促进生物医药发展的重要力量。
其中靶向治疗的抗体药物更是受到越来越多的关注和重视，因为它能够直接作用于肿瘤细胞或特定分子，对患者产生的副作用较小，疗效也更为显著。
靶向治疗的抗体药物研发技术也越来越成熟，涉及到多个学科，包括生物医学、生物技术、化学、药理学等。
其中最主要的就是抗体工程技术。
抗体工程技术是指将人工合成、修饰或改变抗体结构、功能、亲和力或特异性的方法和工具，以制备具有预期药物性质的抗体分子。
在靶向治疗的抗体药物研发中，抗体工程技术扮演了至关重要的角色。
一. 抗体工程技术1.1 基因克隆技术基因克隆技术是制备重组抗体的基础。
通过PCR扩增完整的重链和轻链，然后把它们克隆到表达载体中，使得细胞能够表达和分泌一种完整的抗体。
这种技术可以用于制备任何单克隆抗体。
1.2 亲和力成熟亲和力成熟是通过人工重复模拟免疫选择过程和随机突变，诱导抗体产生突变，以增加其亲和力和特异性的过程。
亲和力成熟技术不仅可用于获得更好的治疗药物，还能够改变生物体内分子的功能。
1.3 重组抗体技术抗体的常规制备需要分离纯化，若要增加其稳定性和便于存储，可以制备成重组抗体。
重组抗体从良好的表达系统中分离出加工后的Fc片段，与想要的可变区域（VH和VL）重组，从而制备成目标抗体。
1.4 变异区域的人工修饰变异区域的人工修饰是基于Crystal的结晶数据，结果中可以确定抗体间相互作用的侧链残基。
对这些位点进行人工修正可改变抗体与其目标细胞结合的亲和力和特异性。
二. 靶向治疗的抗体药物研发2.1 抗体药物研发的三个阶段抗体药物的研发周期通常包括预临床阶段、临床阶段和上市后阶段。
其中，预临床研究是采用细胞和小鼠体内和体外试验来确定其基本性质和生物学特性；临床试验是必须进行的道阶段，必须采用临床实验，在检测其安全性和功效方面，以满足FDA、EMA、中国FDA药品注册的监管要求；上市后阶段主要是通过对药物的长期跟踪和评估，发掘药物的安全问题，以保障病人的安全。
亲和力成熟服务
亲和力成熟服务服务简介亲和力是影响抗体药物功能和药效的关键参数，高特异性和高亲和力有助于减少剂量和副作用，而亲和力成熟技术是提高抗体亲和力的主要技术。
抗体亲和力成熟(antibody affinity maturation)是指机体在受到外源物质入侵时，淋巴B 细胞的抗体基因重排，超变区CDR的高频突变从而产生分泌不同亲和力抗体的淋巴B细胞。
低亲之后亲和力低的B 细胞就会死亡，后代中特异性高与亲和力高的B细胞存活下来识别外源物质。
服务内容百欧泰生物通过计算机辅助模拟某氨基酸被取代的可能性，预测氨基酸被取代后对抗体结构及与靶抗原结合的影响，利用噬菌体展示或细胞表面展示技术筛选出具有高亲和力的抗体。
抗体亲和力成熟的基本原理BCR基因重排后的成熟B细胞受到抗原刺激后，会发生重链和轻链V区的高频率突变，再经过FDC捕获抗原使表达高亲和力BCR的B细胞免于凋亡。
这一过程之后的后代B细胞的BCR对抗原的平均亲和力得到提高。
这样的体细胞高频突变属于二次免疫应答，帮助可有效识别抗原的抗体进一步成熟，有助于机体有效抵抗外来抗原的再次入侵。
因此，抗体亲和力成熟的策略之一就是模拟细胞高频突变。
突变方式亲和力成熟技术的关键是选择突变区域和引入突变，突变方式主要分为以下几种：1.点突变：包括定点突变和随机诱变，随机突变是指抗体基因的全长或部分区域随机引入突变；定点突变是指对CDR 进行定点突变。
2. 链置换：保留某个特定抗体的重链或轻链，另一条链与一个随机化的互补链进行组合，经过噬菌体抗体库筛选从中筛选更高活性的突变株。
3. DNA重组：将同源的抗体基因用脱氧核糖核酸酶Ⅰ将其切割成不超过50bp的片段，再随机组合后进行PCR扩增后完成的抗体基因。
抗体亲和力成熟突变库
抗体亲和力成熟突变库哎，抗体亲和力成熟突变库？这听起来像个超级难懂的东西，但其实它跟我们日常生活的免疫系统也有着千丝万缕的联系。
你想啊，抗体就像是我们身体里的警察，专门负责识别并抓捕那些不速之客——细菌、病毒啥的。
它们可厉害了，每个抗体都是经过专门“训练”出来的，能够精准地锁定入侵者。
这一过程呢，叫做“亲和力成熟”，听起来是不是有点像一个人从懵懂无知到经验丰富的成长过程？不过，成长的路上可不是一帆风顺的！你想象一下，一个抗体刚出来时，也就是一个新兵蛋子，虽然有一定的功能，但还是不够精准，像个没经过磨练的菜鸟。
要是能通过不断的试错，逐渐变得更强，识别目标的准确度越来越高，那就能更有效地保护我们的身体了。
这就是亲和力成熟的关键所在。
简单点说，就是抗体在“战场”上通过不断的“实战演练”，经过一次又一次的突变，让它的亲和力变得越来越强。
好啦，我们今天要聊的这个“突变库”，就是抗体在这个成长过程中的一部分。
说白了，它就像是一个“数据库”，记录着抗体在不断突变过程中，所有的改进和优化。
这些突变并不是随便来的，而是通过一些非常高效的方式，比如“随机突变”和“筛选”，让那些最强的抗体脱颖而出。
这就像你去参加一个选拔赛，虽然最开始你可能并不是最优秀的那个，但经过几轮筛选之后，最后留下的那个，肯定是最能打的！大家可能会好奇，突变库到底怎么运作的？这个过程挺神奇的。
想象一下你是一个科学家，要在成千上万种不同的抗体中找到最牛的那个。
这时候，你就得依赖这些突变库了。
你把大量的抗体基因放进去，经过一番“乱七八糟”的基因突变，再通过筛选，最后找到那些“顶级”的抗体。
这个过程就像是在大海捞针，但也充满了无限的可能。
就算一开始你很难找到最合适的抗体，但通过不断的试探和优化，总有一天你会碰到那个“完美契合”的！为什么这个突变库这么重要？原因很简单，它让我们可以快速且高效地找到最适合的抗体。
这对于开发新的疫苗、治疗疾病，尤其是像癌症、艾滋病这些恶性疾病的治疗，简直是无价的。
简述抗体产生的一般规律简答
简述抗体产生的一般规律抗体是由B细胞分泌的一类具有特异性结合能力的球蛋白，它们能够识别和结合入侵机体的抗原，发挥重要的体液免疫作用。
抗体产生的过程受到多种因素的影响，包括抗原的性质、数量、途径、佐剂、机体的状态等。
抗体产生的一般规律可以从以下几个方面进行简述：一、初次应答和再次应答初次应答是指机体初次接触抗原时发生的免疫应答，其特点是：潜伏期长：指由机体接受抗原刺激到血清中特异性抗体被检出之间的阶段，一般为5~7天，取决于抗原的性质、数量、途径等。
抗体浓度低：指血清中特异性抗体的滴度或效价，一般为1:10~1:100。
半衰期短：指血清中特异性抗体浓度下降到一半所需的时间，一般为几天到几周。
最先产生IgM：指血清中出现的第一类特异性抗体，其分子量大、亲和力低、互补结合位多，能够激活补体系统。
亲和力低：指抗体与抗原结合的巩固程度，反映了抗体与抗原表位之间的相互作用力。
再次应答是指机体再次接触相同抗原时发生的免疫应答，其特点是：潜伏期短：指由机体接受抗原刺激到血清中特异性抗体被检出之间的阶段，一般为1~3天，远远短于初次应答。
抗体浓度高：指血清中特异性抗体的滴度或效价，一般为1:1000~1:10000，有时可比初次应答高10倍以上。
半衰期长：指血清中特异性抗体浓度下降到一半所需的时间，一般为几个月到几年。
产生的抗体以IgG为主：指血清中出现的主要类别的特异性抗体，其分子量小、亲和力高、互补结合位少，能够穿过胎盘、激活细胞毒性T细胞等。
亲和力高：指抗体与抗原结合的巩固程度，反映了抗体与抗原表位之间的相互作用力。
再次应答是由于初次应答后形成了记忆细胞，在再次接触相同抗原时能够迅速活化并分化为效应B细胞和更多的记忆细胞。
再次应答的强弱主要取决于两次抗原刺激的间隔时间长短：间隔短则应答弱，因为初次应答后存留的抗体可与再次刺激的抗原结合，形成抗原-抗体复合物而被迅速清除；间隔太长则反应也弱，因为记忆细胞只有一定的寿命。
抗体亲和力成熟方法
抗体亲和力成熟方法**《抗体亲和力成熟方法，听我给你唠唠》**嘿，朋友！今天来跟你好好唠唠抗体亲和力成熟的方法，这可是个相当重要的事儿。
首先啊，咱得搞清楚啥是抗体亲和力成熟。
你就把抗体想象成一个个小战士，亲和力就是它们抓坏人（抗原）的本事。
成熟呢，就是让这些小战士变得更厉害，抓坏人一抓一个准！那第一步，咱得给这些小战士来个“特训”。
就像你锻炼身体一样，得有针对性地训练。
这时候就得用随机突变的办法，给抗体基因来点小变化。
这就好比给小战士换了把更锋利的武器，或者让他们学会新的招式。
比如说，咱可以用易错 PCR 技术，就跟抽奖似的，让抗体基因有机会发生各种各样的小突变。
这一步可得小心点，别一下子突变太多，不然小战士都不认识自己是谁啦，还怎么打仗！第二步呢，就是“选拔精英”。
把经过特训后的小战士们拉出来溜溜，看看谁的本事大。
这就要用到各种筛选技术啦，比如噬菌体展示技术。
想象一下，把这些小战士都放在一个大舞台上，让抗原这个坏人出来挑衅，谁能最快最准地抓住坏人，谁就是精英！这过程就像超级选秀，能者上，不行的就淘汰。
第三步，“强强联合”。
把那些表现优秀的小战士的基因组合在一起，创造出更强大的超级战士。
这就好比把武林高手的武功秘籍融合在一起，威力加倍！通过基因重组，让抗体的亲和力蹭蹭往上涨。
第四步，“实战检验”。
把新合成的抗体放到实际环境中去试试，看看是不是真的厉害。
这就像让新兵上战场，真刀真枪地干一场，行就行，不行咱再回去改进。
我跟你说，我之前做这个的时候，那可是状况百出。
有一次啊，我在“特训”那步，不小心搞过头了，结果弄出来一堆乱七八糟的抗体，完全没法用，就像一群没头苍蝇一样，别提多郁闷了。
还有一次在“选拔精英”的时候，我眼睛看花了，差点把弱鸡当成了高手，还好及时发现，不然可就闹大笑话啦！总之，抗体亲和力成熟这事儿，虽然有点复杂，但只要咱按照这几步来，一步一个脚印，肯定能让咱们的小战士变得超级厉害！朋友，加油干，相信你也能搞定！记住哈，随机突变要适度，筛选要精准，组合要有技巧，检验要严格。
基因工程抗体亲和力成熟的策略
基因工程抗体亲和力成熟的策略
胡晓林;张春明
【期刊名称】《免疫学杂志》
【年(卷),期】2006(22)6
【摘要】近年来,抗体因其高度的特异性在诊断和药物的靶向治疗上备受青睐,相关行业的发展也极为迅猛。
在体内诊断和治疗上,基因工程抗体具有众多鼠源性单克隆抗体无可比拟的优势,但前者亲和力低是制约其实际应用的瓶颈问题,作者将就基因工程抗体亲和力成熟的策略及其应用进行综述。
【总页数】3页(P702-704)
【关键词】亲和力成熟;基因工程抗体;突变
【作者】胡晓林;张春明
【作者单位】中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R392.2
【相关文献】
1.基因工程抗体亲和力成熟研究进展 [J], 于礼;梁米芳
2.基因工程抗体的体外亲和力成熟 [J], 汪保安;王琰
3.全人源单克隆抗体体外亲和力成熟的策略 [J], 徐金兵;刘煜
4.基于基因突变的基因工程抗体亲和力成熟研究 [J], 邓龙;周思;郭新东
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题目：噬菌体文库系列——抗体亲和力成熟
摘要：多策略组合应用，搭配噬菌体展示技术，效果棒棒哒
近年来，随着抗体药物的广泛上市，抗体已经取代基因治疗成为生物制药领域的主要生力军。
而抗体在疾病诊断、治疗和预防方面的作用很大程度上取决于其亲和力的高低，随着抗体工程技术的不断发展，如何提高抗体亲和力已成为抗体工程的难题之一。
围绕这一问题人们已经从不同的角度展开了研究，例如，提高抗体库的质量、增加抗体库的多样性、进行抗体重链或轻链的替换以及点突变有目的进行氨基酸替换等都能不同程度地提高抗体亲和力。
抗体亲和力表示抗体与抗原结合能力的大小。
抗体亲和力成熟是指机体正常存在的一种免疫功能状态。
在体液免疫中，再次应答所产生抗体的平均亲和力高于初次免疫应答，这种现象称为抗体亲和力成熟。
噬菌体展示技术作为一种先进的抗体库构建技术能结合多种技术手段，于体外实现抗体的亲和成熟，并配合亲和筛选方法获得具有高亲和力的抗体。
在噬菌体抗体展示技术中，VH和VL基因的随机重组，在一定程度上模拟了体内抗体亲和力成熟的过程。
如果结合其它技术则可以使抗体的亲和力提高到一个更高的层次，下面介绍一些抗体亲和力成熟的方法。
体外抗体亲和力成熟的几种策略
要想实现抗体的亲和力体外成熟，就必须充分地了解天然抗体的亲和力体内成熟原理，设计模拟体内可能出现和存在的变化，从而促进抗体的体外进化。
天然抗体的亲和力成熟可以分为体细胞高频突变和克隆选择两个过程。
在天然抗体亲和力成熟的过程中，抗原刺激下的体细胞高频突变有着举足轻重的作用，因此亲和力体外成熟的策略也多在抗体基因突变水平上，即采用各种突变方法来模拟体内的高频突变。
1.随机突变
（1）错配PCR
通过改变PCR反应条件，提高核酸错配率将随机突变引入基因序列。
该技术可以通过提高镁离子浓度、加入锰离子、失衡4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）浓度、使用低保真DNA 聚合酶等方法，来提高抗体基因的突变率。
除此之外，突变率的高低也可以采用改变模板DNA 的复制次数进行控制。
复制次数越多，突变率将累积得越高。
理论上经过多轮的PCR反应可获得0.15%~3%的突变频率，再用突变的抗体基因库建立噬菌体抗体库，最后从中筛选高亲和力抗体。
噬菌体展示技术有效的改善了使用错配PCR技术导致的抗体亲和性和特异性的丧失，以及有效突变体过少的问题。
（2）DNA改组
DNA改组技术是对同源的抗体基因，采用脱氧核糖核酸酶Ⅰ将其切割成不超过50 bp的片段，再随机组合后进行PCR扩增成完整的抗体基因。
它包含了抗体片段随机化切割、重组和筛选的过程，一定程度上模拟了天然抗体的亲和力成熟过程，并加快了体外定向进化速度。
采用连续多轮的DNA改组具有去除有害突变优势。
另外，DNA 改组获得的突变体，突变位点可以位于非抗原直接接触的区域，有扩大库容的作用。
（3）链改组
链改组即链替换技术，是固定抗体的一条轻链或重链不变，而将另一条重链或轻链经过突变处理后，重新与固定链配对，以提高抗体亲和力的方法。
该方法保留一条链不变，目的是为了保持抗体的特异性，而将经过突变处理的另一条链与其配对，是为了增加抗体的亲和力，以筛选到更高亲和力的抗体，重复进行链替换和亲和力筛选将产生更高亲和力的抗体。
将噬菌体展示技术与此技术结合构建次级抗体库将使该法更便利。
链改组技术能有效提高抗体亲和力，但如果无法明确了解指定抗原的基因结构，或者抗体基因片段未能拥有一个比较完整的初级抗体库，则不适合使用链改组技术。
（4）突变株
Escherichia coli MutD5 是最常用的大肠埃希菌突变株，该菌株可以校对和复制后错配修复缺陷，产生高频率的单个碱基替换，突变率高于普通菌株105倍。
突变株法的优势是突变发生在转化宿主菌后，而其他方法的突变均发生于转化之前，而转化效率是限制大容量突变库构建的关键因素之一。
使用突变株法可以构建库容为1012- 1014个克隆的超大容量抗体库，利用噬菌体展示技术筛选高亲和抗体，通过该法的可以获得一些未能在定向突变中获得的突
变体。
但是该方法较难对突变率进行控制，且获得的随机突变也可能发生于载体部分，造成有害突变。
2.定向引入突变
CDR重组
由于天然抗体在亲和力成熟过程中，体细胞高频突变发生区域并非均匀分布，而是主要集中在与抗原直接接触的CDR(complementarity-determining region,CDR)区。
这样既可以获得足够的序列多样性，又不会破坏蛋白质结构。
因此在抗体的亲和力体外成熟中，CDR 区是最常选用的定点突变区域。
CDR重组技术即将多种突变或经过设计的DNA序列引入抗体多个CDR区，再利用抗体库技术将这些CDR区进行多次重组，已达到亲和成熟的目的。
该技术使噬菌体展示技术得到了更广泛的应用，并且相对于热点突变其能更完整的模拟体内抗体轻链与重链重排的整个过程，该方法可结合多种技术使用。
除了CDR区突变外，天然抗体亲和力成熟中的突变热点也是常见的定点突变位点。
这些热点通常包含或接近AGY和RGYW（R = A or G；Y = C or T；W = A or T）序列。
基因工程抗体亲和力成熟的过程其实就是一个体外的分子进化，多样化的选择和扩增的过程。
根据对抗体亲和力成熟的认知，各种模拟体细胞高频突变有效引入突变的策略是亲和力成熟的核心，而基于不同原理的突变策略的组合应用可能对基因工程抗体的亲和力成熟有协同增强的作用。
研究基因工程抗体的亲和力成熟，制备得到高亲和力的抗体，可以帮助我们在临床上使用低剂量达到我们需要的生物学效应，减少剂量导致的毒性反应，增加治疗效果，在抗体药物研发进程中至关重要。
案例展示。