重组腺病毒常见问题解答(FAQs)解析
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术85.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒常见问题与解答
腺病毒常见问题与解答1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求？有要求。
对E1和E3双缺失的腺病毒载体，比如AdMax的Kit C、Kit D等，其总包装的外源片断要求小于8 kb。
而对于只有E1缺失或E3缺失的载体，比如Kit A、Kit B等，外源片断要求小于5 kb。
注意，外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。
2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体？腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分，不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。
根据经验，完成一个完整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012VP左右.3、如何提高腺病毒的活性？提高腺病毒的活性，关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。
纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程，如果扩增的病毒滴度高，那么纯化后就会更高的。
4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR（未翻译区）的额外的碱基会影响蛋白表达吗？UTR尽可能短一些，特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。
在起始密码子ATG 前面可以加一小段（6-9bp）的碱基序列可以增强目的基因的表达，比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。
5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞？参照文献报道是很简单的办法，也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。
Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞（包括分裂和非分裂细胞），比如肝、肌肉、神经组织等。
但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞，比如乳腺癌、白血病细胞等，感染效率较低。
6、腺病毒载体在体外实验（in vitro）中应注意哪些问题？1）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。
可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。
2）在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。
避免在消化细胞后立刻感染病毒，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。
腺病毒常见问题与解答
腺病毒常见问题与解答1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求？有要求。
对E1和E3双缺失的腺病毒载体，比如AdMax的Kit C、Kit D等，其总包装的外源片断要求小于8 kb。
而对于只有E1缺失或E3缺失的载体，比如Kit A、Kit B等，外源片断要求小于5 kb。
注意，外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。
2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体？腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分，不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。
根据经验，完成一个完整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012VP左右.3、如何提高腺病毒的活性？提高腺病毒的活性，关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。
纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程，如果扩增的病毒滴度高，那么纯化后就会更高的。
4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR（未翻译区）的额外的碱基会影响蛋白表达吗？UTR尽可能短一些，特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。
在起始密码子ATG 前面可以加一小段（6-9bp）的碱基序列可以增强目的基因的表达，比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。
5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞？参照文献报道是很简单的办法，也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。
Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞（包括分裂和非分裂细胞），比如肝、肌肉、神经组织等。
但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞，比如乳腺癌、白血病细胞等，感染效率较低。
6、腺病毒载体在体外实验（in vitro）中应注意哪些问题？1）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。
可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。
2）在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。
避免在消化细胞后立刻感染病毒，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。
吉玛重组腺病毒操作手册说明书
如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************吉玛重组腺病毒操作手册GenePharma Recombinant Adenovirus Operation Manual2017 年 6 月如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：**************************E-mail：************************目录一、产品简介 (4)二、腺病毒载体优势 (4)三、生物安全性 (5)3.1安全性 (5)3.2实验室安全措施 (5)四、流程描述 (6)五、材料与仪器 (7)5.1实验材料 (7)5.1.1细胞株 (7)5.1.2质粒 (7)5.1.3试剂 (8)5.2实验耗材及仪器 (8)5.2.1耗材 (8)5.2.2仪器 (9)六、具体步骤 (9)6.1细胞培养 (9)6.1.1活细胞计数 (9)6.1.2细胞株的冻存 (9)6.1.3细胞复苏 (10)6.1.4细胞传代 (10)6.2病毒包装 (10)6.3病毒收集 (11)6.4病毒扩增 (12)6.5病毒纯化 (12)6.6病毒重悬和保存 (13)6.7病毒滴度检测 (13)七、使用方法 (14)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************重组腺病毒在细胞水平使用 (14)7.1病毒滴度复核（有限稀释法测定） (14)7.2靶细胞感染预实验 (16)7.3正式试验 (18)八、运输和储存 (18)九、常见问题及解决方案 (19)十、吉玛案例 (20)十一、附录 (21)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************一、产品简介腺病毒(Adenovirus，Adv)是一种线性双链DNA 病毒。
腺病毒载体常见问题汇总
腺病毒载体常见问题汇总
1.问：腺病毒和AAV不同吗？
答：是的！AAV是一种小型单链DNA细小病毒，被发现是腺病毒制剂的一种污染物，而腺病毒是一类中型、无包膜的双链DNA病毒。
他们没有关系；然而，AAV的复制需要腺病毒基因E1、E4、E2a和VA的参与。
2.问：可以用腺病毒构建一个稳定的细胞系吗？
答：不，腺病毒载体只能瞬时表达使用。
3.问：腺病毒复制有缺陷吗？
答：通常是有的，因为复制所需的早期基因已从转移载体中删除。
早期基因E1由转染细胞系（293或911）提供。
为了避免产生具有复制能力的病毒，不应该连续扩增病毒，因为每一轮扩增都会增加产生具有复制能力的病毒的重组事件的机会。
4.问：什么是RCA？
答：RCA代表具有复制能力的腺病毒。
当你的腺病毒载体和包装细胞系中发现的早期基因之间的交叉事件产生野生型腺病毒时，可能会发生这种情况。
交叉事件的概率随着每一轮扩增而增加。
生物技术制药：重组腺病毒技术对肝癌的治疗
重组腺病毒技术
腺病毒（Adenovirus）是目前最高效可靠的重组病毒表达系统之一，可 用于在哺乳细胞中瞬时及高水平地表达RNA或目的蛋白。其具备以下优 点： • 1. 宿主范围广。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，除可感染几乎所
有人的细胞类型外，还可感染包括大鼠、小鼠、兔、猪、羊、猴、鸡 等物种。 • 2. 因腺病毒的感染不依赖细胞周期，故其既可以感染增殖细胞也可以 感染非增殖细胞。 • 3. 腺病毒具有嗜上皮细胞特性，因大多数肿瘤细胞均属于上皮细胞， 这使得腺病毒非常适合应用于基因治疗领域。 • 4. 病毒滴度高，可用于动物水平的实验。 • 5. 有较好的生物安全性。腺病毒携带的基因不会整合到宿主细胞基因 组中。
重组腺病毒的治疗手段
Protein
RNA
TK r-Caspase-3 其他蛋白
Mdr1(encode p-gp) miR-21s(miRNA Sponge ) FAT10
重组腺病毒ADV-TK
TK（胸苷激酶基因）
（1）“自杀效应”。TK 可代谢无毒的抗病毒药物更昔洛韦 （GCV）使之成为细胞毒性产物，干扰DNA 合成，使肿瘤细 胞自发死亡。
qualification test ——DNA electrophoresis adenovirus TCID test MTT array
肝细胞肝癌表达特异性的 重组腺病毒r-Caspase-3
r-Caspase-3
（1） Caspase-3属于效应Caspase, 不具备凋亡诱导活性，外源性刺激因子 (如FasL)激活, 则导致癌细胞的不可逆凋亡。 （2）r-Caspase-3：将Caspase-3 中大、小亚基排序颠倒, 使小亚基位于大 亚基之前, 构建了重组型Caspase-3 分子, 这种分子可自发折叠形成具有活 性的三维结构形式, 而不需要上游分子的切割活化。 （3）AFP 阳性肝癌细胞表达特异性：EAFP（甲胎蛋白增强子）-PALB （白蛋白启动子） 控制。
腺病毒的一些常见问题及解答
汇总了腺病毒的一些常见问题及解答！1.目前，对于基因治疗的载体选择，很难有一个统一的结论，文章也很多，我将在如下给出。
本人认为，无论选择哪种载体，关键在于此载体在局部的表达效率。
无论是采用IN VIVO 或者EX VIVO的方法，因为我们最终的目的是要在局部表达我的目的基因，并且使其具有一定的作用。
而对于载体的副作用，目前较为公认的就是病毒载体转染效率高，但副作用大；质粒载体毒性小，但转染效率比较低。
同时，对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体，pEGFP、pDsRed、pEYFP和pECFP等：这些载体如果用于细胞水平的检测，也许会更加的方便、直观，但是，如果用于体内的基因治疗，那就不是一个理想的载体了。
而传统的表达载体如INVITROGEN公司（)的pCDNA载体系列，会更好一些。
同时，为了获得更加高效的表达，一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体，以增加外源基因的分泌表达。
正如一个疾病的治疗一样，治疗的方法越多，就证明还没有一个最有效地治疗手段。
基因治疗的载体也是同样，很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。
以上是本人的一点愚见，还请各位同道指正。
2.转染过小鼠肝癌细胞H22，请赐教：用什么方法可以达到最佳效果，脂质体、电转还是重组病毒？如果用脂质体，哪家的最好？H22细胞为悬浮细胞，用病毒（逆转录病毒和腺病毒）最为理想，一是转染效率高，二是不用筛选直接用于实验。
但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%，且影响因素多，而腺病毒感染效率高，几乎可达100%，但只能短期表达（7－10天），随着细胞传代，外源基因会逐渐丢失。
当然，H22也可用脂质体进行转染，筛选应在96孔板上进行，由于培养液少、细胞相对静止，两周后可见细胞克隆生长，在倒置显微镜下用吸管吸取克隆，进行扩大培养。
3.重组腺病毒作基因治疗，因为不是很了解，用AdEasy系统可以吗？具体的实验步骤是来自什么地方？主要细胞及试剂的来源？.BIOgene公司有整个系统，从质粒到细胞都有，我AdEasy的基本原理请参阅文献AVol.95.pp.2509-2514,March 19984.以腺病毒为载体做肿瘤细胞的基因转染，查文献，病毒滴度测定用噬斑法，但所用细胞不统一，是否有统一规定？就用肿瘤细胞来测行吗？只有能反式提供E1的细胞才能用来测腺病毒滴度，一般用HEK293细胞，用肿瘤细胞肯定不能形成噬斑。
腺病毒的一些常见问题及解答----整理自丁香园
汇总了腺病毒的一些常见问题及解答！1.目前，对于基因治疗的载体选择，很难有一个统一的结论，文章也很多，我将在如下给出。
本人认为，无论选择哪种载体，关键在于此载体在局部的表达效率。
无论是采用IN VIVO 或者EX VIVO的方法，因为我们最终的目的是要在局部表达我的目的基因，并且使其具有一定的作用。
而对于载体的副作用，目前较为公认的就是病毒载体转染效率高，但副作用大；质粒载体毒性小，但转染效率比较低。
同时，对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体，pEGFP、pDsRed、pEYFP和pECFP等：这些载体如果用于细胞水平的检测，也许会更加的方便、直观，但是，如果用于体内的基因治疗，那就不是一个理想的载体了。
而传统的表达载体如INVITROGEN公司（)的pCDNA载体系列，会更好一些。
同时，为了获得更加高效的表达，一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体，以增加外源基因的分泌表达。
/vcore/Plasmids/pUMVC6a.htm/vcore/Plasmids/pUMVC7.htm正如一个疾病的治疗一样，治疗的方法越多，就证明还没有一个最有效地治疗手段。
基因治疗的载体也是同样，很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。
以上是本人的一点愚见，还请各位同道指正。
2.转染过小鼠肝癌细胞H22，请赐教：用什么方法可以达到最佳效果，脂质体、电转还是重组病毒？如果用脂质体，哪家的最好？H22细胞为悬浮细胞，用病毒（逆转录病毒和腺病毒）最为理想，一是转染效率高，二是不用筛选直接用于实验。
但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%，且影响因素多，而腺病毒感染效率高，几乎可达100%，但只能短期表达（7－10天），随着细胞传代，外源基因会逐渐丢失。
当然，H22也可用脂质体进行转染，筛选应在96孔板上进行，由于培养液少、细胞相对静止，两周后可见细胞克隆生长，在倒置显微镜下用吸管吸取克隆，进行扩大培养。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中⽂操作⼿册腺病毒载体操作⼿册中⽂版腺病毒重组系统AdEasyTM操作⼿册⽬录第⼀章简介13.2AdEasyTM系统中产⽣重组腺病毒的时程3第四章主要流程2 4第⼆章应⽤重组腺病毒的优点4.1技术3 将基因克隆⼊AdEasyTM转移载体4 第三章AdEasyTM4.1.13 3.1技术概况缩写英⽂全称中⽂全称AdAdenovirus腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite5Ad5Adenovirusserotype5⾎清型腺病毒多克隆位点分钟腺病毒载体MinMinuteAdV AdenoviralVector AmpAmpicillin氨苄青霉素感染复数MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) -半乳糖苷酶β-Galβ-GalactosidaseβRNA mRNAMessengerRNA信使MWCOMOIecularWeightCut-offbpBasePair碱基对PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresisBSABovineSerumAlbumin⼩⽜⾎清⽩蛋⽩聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液互补cDNAComplementaryDNADNADNA 闭环螺旋空斑形成单位PFUPlaqueFormingUnitcccDNAClosedCircularCoiledDNA CPECytopathicEffect细胞病理效应感染后piPostInfection CsClCesiumChloride氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒培养基DMEMDulbecco'sModifiedEagleMediumDMEM RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复DMSODimethylSulfoxide⼆甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate⼗⼆烷基硫酸钠⼄⼆胺四/⼆硫苏糖醇DTTDithiothreitol TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid⼄⼆胺四⼄酸⼄酸组织培养感染剂TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%溴化⼄锭EtBrEthidiumBromide量FBSFetalBovineSerum胎⽜⾎清TCPTotalCellularProtein细胞总蛋⽩⼩时HrHourITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复溶液TETris/EDTA TE 卡那霉素KanKanamycin wtWildType野⽣型溴千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-kbKilobases半乳糖苷-3--4-氯吲哚-千道尔顿KDaKiloDaltons β-D-第⼀章简介当今基因输送技术的发展⽇趋复杂，⼀些治疗药物（⽣长激素、⼲扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋⽩（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更⾼效的基因输送⼯具。
医学：重组腺病毒载体的构建
02
重组腺病毒载体的构建涉及多个步骤，包括选择合适的腺 病毒血清型、设计外源基因的插入位点、构建重组质粒、 转染腺病毒生产细胞等。这些步骤需要精确的操作和严格 的质量控制，以确保重组腺病毒载体的安全性和有效性。
03
重组腺病毒载体的构建过程中，需要注意选择适当的腺病 毒血清型，以确保与宿主细胞的良好亲和力和低免疫原性 。同时，需要对外源基因进行适当的修饰和优化，以提高 其在重组腺病毒载体中的表达效率和稳定性。
医学重组腺病毒载体的构建
目录
• 重组腺病毒载体概述 • 重组腺病毒载体的构建过程 • 重组腺病毒载体的应用研究 • 重组腺病毒载体的安全性及挑战 • 参考文献
01 重组腺病毒载体概述
腺病毒的特点
01
02
03
宿主范围广
腺病毒对多种细胞类型具 有感染能力，包括人体细 胞。
基因容量大
腺病毒载体可以携带较大 的基因片段，适合用于基 因治疗和疫苗研发。
02 重组腺病毒载体的构建过 程
目的基因的获取与。
目的基因的处理
对目的基因进行限制性酶切、修饰、 纯化等处理，以便于后续的克隆和鉴 定。
载体的选择与处理
载体的选择
根据实验需求选择适合的载体，如腺病毒载体、质粒载体等。
载体的处理
重组腺病毒载体的构建过程简介
选择合适的腺病毒血清型
根据应用需求选择对特定细胞类型感染力强、 免疫原性弱的腺病毒血清型。
构建重组质粒
将目的基因插入腺病毒载体的转移质粒中， 形成重组质粒。
转染与筛选
将重组质粒转染进包装细胞，筛选出能够产 生重组腺病毒的细胞克隆。
病毒扩增与纯化
在筛选出的细胞克隆中扩增重组腺病毒，并 进行纯化和浓缩。
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养 85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖85.1.3 QBI-293A细胞的冻存 85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生95.2.1 感染QBI-293A细胞 95.2.2 病毒空斑形成 95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 95.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 105.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 115.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增 125.5.3 Western杂交 135.5.4 Southern杂交和点杂交 135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定 145.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 165.7.1 不连续密度梯度离心 175.7.2 连续密度梯度离心 175.7.3 病毒溶液去盐和浓集 175.8 病毒滴度测定 185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法 205.8.3 50%组织培养感染剂量法 20第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组 24 6.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactop yranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒包装原理 流程全解析
腺病毒包装原理
腺病毒（Adenovirus）是一种线性双链DNA无包膜病毒，对分裂期细胞和非分裂期细胞均具有感染能力，且具有嗜上皮细胞性。
重组腺病毒载体是以腺病毒为基础发展起来的工具病毒载体，具有宿主范围广，免疫原性强，基因容量大，不与基因组整合，瞬时表达等特点。
重组腺病毒（AdV）是人血清5型腺病毒（Ad5），一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
腺病毒缺失了早期表达基因序列E1和E3区。
E1是腺病毒复制所必须的，E1的缺失使其不能自身复制，只能依靠包装细胞如293A细胞提供的反式互补进行复制扩增，以此保证腺病毒的安全性。
源井生物所提供的腺病毒颗粒经过超速梯度离心和过滤，并通过壳蛋白免疫法进行滴度测定。
腺病毒的滴度在10^10~10^12pfu/ml，完全可以满足各类实验的使用要求。
产品规格
服务流程及质量控制：
基因表达腺病毒
源井生物通过构建腺病毒表达载体并包装成腺病毒。
使用过表达腺病毒感染细胞后可以实现目的基因瞬时高表达。
腺病毒包装容量大，重组片段可达4.5kb。
基因敲除腺相关病毒载体选择：
基因干扰腺病毒
源井生物通过构建腺病毒干扰载体并包装成腺病毒。
使用干扰腺病毒感染细胞后可以实现干扰RNA瞬时高表达。
基因干扰腺病毒载体选择：
注明| 文章是源井生物原创，转载请注明。
腺病毒操作手册
Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作手册(Version 2.0)上海吉凯基因技术有限公司 二〇〇九年二月地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 1 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒实验系统腺病毒是一种的线型双链 DNA 无包膜病毒， 它的 DNA 和核心蛋白形成的内核， 蛋白外壳 是直径约 80nm 的正二十面体，由 240 个六 面体和 12 个位于正二十面体顶部的五面体 构成。
Genechem 重组腺病毒系统是将携带外源基 因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的 包装质粒共转染 HEK293 细胞， 通过 Cre/loxP 系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。
重组腺病毒能够表达较大的外源基因片段， 感染分裂和非分裂细胞，具有广泛的宿主。
GFP-adenovirus 感染的代表细胞――腺病毒可以感染绝大多数细胞TCA8113SGC-7901NRKPC-3Huh-7GliaRabbit Mesenchymal Stem CellsHuman Mesenchymal Stem CellRat Cardiac Fibroblasts地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 2 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作过程一, 注意事项:1. 操作病毒时请尽量使用生物安全柜。
腺病毒安全使用和注意事项
腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3)操作病毒时需要特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
4)接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5)如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。
6)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。
7)实验完毕后请用香皂清洗双手。
➢腺病毒储存与稀释的注意事项1）腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于-80 ℃。
注：a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴度测定方法）。
2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳)。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
重组腺病毒具有以下几个显著优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织；感染效率高达100%，可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染；对外源基因容载能力大（可以高达8Kb）；不整合基因组；滴度高，操作方便。
因此，重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。
目前常用的腺病毒载体基于人腺病毒5型（Ad5），其基因组是36Kb长的线性双链DNA。
腺相关病毒常见问题解答
腺相关病毒常见问题解答Q1：AAV的注射方式，有尾静脉注射也有局部原位注射，该怎么选？AAV的体内注射（给药）方式分为系统性给药和局部给药，系统性给药主要有尾静脉、颈静脉、眼眶静脉和腹腔静脉给药；局部给药方式常见的包括脑立体定位、肌肉定点注射、心肌原位注射、玻璃体腔内注射、关节腔注射等；系统性给药是特点是病毒注射的体积较大，一般需要100~1000μl不等，病毒在体内扩散的范围广，一般系统性给药的方式操作较为简单，给药比较方便；局部给药则病毒注射量要求较少，一般100μl以内，但对滴度要求较高；由于是直接将AAV递送到目标组织，局部给药会有更好的靶向性，如果是临床基因治疗，局部给药注射的病毒量少，因此病理毒性会更小。
Q2：AAV注射小鼠，多少病毒量才够呢？影响AAV注射总量的因素很多，比较重要的有血清型、目标组织类型、注射方式（局部or全身）、动物模型（如大鼠or小鼠）等，对于有文献报道的，可参考文献的注射方法，最好设置几个不同的梯度。
例如AAV9感染小鼠心脏组织（心肌细胞），可采用尾静脉注射也可采用心肌多点注射的方式，尾静脉注射推荐1011 vg/mL，100μL；原点注射则推荐1010 vg/mL，20 μL/点。
想了解更多不同组织的AAV注射病毒量的推荐可以联系我们。
Q3：AAV注射后多久起效？有办法缩短其表达时间吗？在我们的上期有提到，AAV进入细胞后需经历一个从单链DNA变成双链DNA的过程，因此，目的基因开始表达所需的时间较长，一般在1周左右或以上可以检测到，这个也跟目的基因相关，不同基因的表达高峰时间是不同的。
另外，可采用自互补AAV（Self-complementary Recombinant Adeno-Associated Virus ，scAAV）加快表达速度，scAAV是通过改造其中的一个ITR使得AAV可形成二聚体，其进入细胞可直接进行表达，在多种组织中表达更迅速且表达水平更高。
腺病毒包装重组的技术详解
腺病毒包装重组的技术详解⼀、什么是⼀、什么是腺病毒包装系统腺病毒包装系统1. 腺病毒包装系统包括：1)1个腺病毒载体：含有缺失了E1和E3基因的腺病毒基因组序列的质粒。
2)l 株包装细胞株：表达El 基因的293细胞。
野⽣型腺病毒基因组是⼀条约36 kb 的线性双链DNA (dsDNA)分⼦。
基因组的两个末端被称为Inverted Terminal Repeat (ITR)，末端之间含有腺病毒DNA 复制所需基因。
在病毒DNA 复制周期早期表达的基因，称为早期基因，主要有4个，按表达先后顺序依次是E1、E2、E3、E4。
在病毒DNA 复制周期晚期表达的基因，称为晚期基因，主要有5个，按表达先后顺序依次为Ll 、L2、L3、L4、L5。
为了制备出⾃我失活的重组腺病毒，E1基因会被删除，使重组腺病毒成为⼀种安全的基因运输⼯具。
为了增加包装能⼒，E3基因也同时被删除，因为E3基因产物会提⾼宿主的免疫反应，⽽且对病毒⽣产不重要。
缺失了E1和E3基因的腺病毒基因组序列被克隆到质粒上构建成腺病毒载体。
El 基因⽚段被整合到293细胞基因组中，包装病毒颗粒时，Pacl 消化的腺病毒载体转梁到表达E1基因的293细胞。
El 基因激活了其他早期基因和晚期基因的表达，这些基因表达产物和Pacl 消化的质粒DNA 组装成病毒颗粒。
⼆、什么是⼆、什么是腺病毒过程腺病毒过程⽣产携带⽬的基因的重组腺病毒颗粒，过程如下图：将环形腺病毒载体通过Pacl位点酶切后获得两末端是ITR序列的线性双链DNA，再转染线性化DNA到包装细胞。
线性化双链DNA分饰两个⾓⾊，既是病毒基因组，⼜是病毒蛋⽩表达所参照的基因模板序列。
基因组与病毒蛋⽩组装成病毒颗粒，病毒颗粒在细胞内成熟后，使得细胞破裂，从⽽使病毒颗粒释放到培养液中。
然后收集细胞和培养液，反复冻融细胞和培养液的混合物，离⼼收集上清，获得粗病毒。
此时的粗病毒量通常不会很⾼，⼀般会将粗病毒感染更多的包装细胞，以扩增病毒量。
腺相关病毒常见问题与解答
腺相关病毒常见问题与解答腺相关病毒常见问题与解答1、腺相关病毒载体是不是只要能转入细胞就可以整合到宿主细胞基因组中？如果不是，那么整合率大概有多少？是不是跟靶细胞类型有关呢？野生型AAV病毒感染细胞后倾向于整合到19号染色体的AAVS1位点。
这个特性是与其rep基因功能和ITR结构以及染色体特定位置的序列相关的．AAV载体是经过改造的，已经去除了其repcap基因，因此已经失去了特异整合的特性。
对于不同的靶细胞，AAV载体的整合几率是不同的。
越来越多的研究发现，在许多组织中AAV载体进入细胞后并不整合，而以附加子（episome）形式存在，最为典型的是在肌肉中。
也有些研究报道AAV载体的整合是相对随机的，有整合到活跃的基因中的倾向。
2、据说AAV在细胞上的表达远比不上在动物体内的表达，为什么？AAV载体在体外实验中用于转导培养细胞时，常发现其表达水平较低，而且有表达延迟现象。
这是因为AAV基因组是单链的，它进入细胞以后，必须要有一个由单链变为双链的过程，然后其所携带的外源基因才能进行转录和翻译，在没有辅助病毒或其它辅助因子的情况下，这种AAV由单链DNA在细胞内复制形成双链DNA的过程是十分缓慢的，因此相对于其它双链DNA病毒载体如单纯疱疹病毒（HSV）和腺病毒（Ad），其表达明显延后。
此外，AAV对细胞毒性低，培养的细胞在加入AAV后，细胞分裂生长能力不受太大的影响，这样也对AAV载体有一种稀释作用，也导致其表观表达水平较低。
而在体内应用时，注射部位的组织细胞通常没有显著增殖，不会出现AAV载体被稀释的情况，而且在体内各种促进AAV 载体所携带外源基因表达的各种因子相对丰富，故体内应用时，AAV载体的表达水平比较高。
研究表明辅助病毒或其它辅助因子可以明显促进单链DNA复制成双链DNA，从而明显提高外源基因的表达水平，故在体外应用可以考虑加入辅助病毒（Ad5）或丁酸钠（终浓度10~50mmol/L），这样可以提高表达水平达5~10倍。
构建重组腺病毒
重组腺病毒载体1、片段处理先测质粒含量，限制性内切酶NheI和SpeI双酶切含有目的基因的T 载体质粒DNA，双酶切体系根据质粒含量而定，TaKaRa公司的的Buffer与体系总体积比为10:1，酶10U/µL可切底物1µg（实际操作时通常加2-4倍量，但所加酶的体积不能超过反应总体积的十分之一）。
先进行琼脂糖凝胶分离，用洁净的刀片切出目的条带，纯化回收目的片段（试剂盒）。
限制性内切酶SpeI单酶切pAd4△E3穿梭质粒，酶切4-6小时，先取少量进行凝胶电泳，电泳时设立未切的质粒对照，以确定质粒被完全切开，如果没有完全切开，继续延长时间或加大酶量酶切，确定酶切完全后，进行去磷酸化，纯化回收线性pAd4△E3穿梭质粒（要根据质粒的大小确定合适的纯化回收方法）。
2、连接16℃，过夜。
体系：连接酶的Buffer通常为2X，所以，这里就要加总体积1/2的Buffer，同样，连接酶的量也不能超过总体积的1/10!!3、转化入DH5α细胞取10µL连接产物加入100µLDH5α感受态细胞（实验室保存的感受态细胞保存在-70度，取出前要准备好冰水混合物，将感受态细胞取出后，迅速放入冰水）中，轻轻混匀后冰浴30min（目的是让连接产物中的DNA分子与细胞膜吸附在一起）；42℃水浴热激90s（使细胞膜上的孔径变大，DNA分子进入内部），再立即冰浴3min（让细胞膜上的孔快速闭合）；加入890µL LB培养基，37℃温和振荡1h；8000rpm离心5min; 无菌弃去600µL上清，重新悬浮；均匀涂布于含氨苄青霉素（pAd4△E3穿梭质粒不是卡那霉素抗性，而是氨苄青霉素，这是最最重要的）的培养皿上，培养12h。
4、挑分离良好的单克隆，接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37度剧烈震荡（240rpm）摇菌挑取数个菌落，接种于LB培养基中，37℃震荡过夜培养。
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Q8.重组腺病毒的推荐存储条件是什么？
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Q2.怎么确定我所用的细胞模型可以感染腺病毒？
答：腺病毒有很广泛的宿主范围。它可以感染人类或者其他哺乳动物细胞系或原代细胞，包括可分裂的和不可分裂的细胞。只有少数细胞系不被感染。一些淋巴细胞系对腺病毒有更强的抵抗性，因此需要大量的病毒来感染细胞。为了客户的方便，我们提供含有报告基因的病毒，如Ad-CMV-B-gal和Ad-CMV-GFP从而方便的进行您的预实验。
终点稀释实验的生物学原则类似于空斑形成实验，尽管二者过程和测量是不同的，而该法计算病毒滴度的公式则较之复杂。
尽管空斑形成实验和终点稀释实验给出了有感染能力或者有作用的病毒的滴度，但它们是通过人眼给出分值的，并受人及过程的变化的影响。对于相同的病毒源，不同人给出显著不同的滴度读值是很普遍的。
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Q7.对于体外实验（细胞实验）CsCl纯化或层析柱纯化有必要么？
答：对于长期存储，病毒应该被保存在-80°C，特别是在经过CsCl或层析柱纯化后。在-80°C,病毒可以稳定保存6个月到一年，在某些情况下甚至可以达到2年。如果病毒是在添加血清或BSA的DMEM中储存在-80°C,它能够稳定储存更长的时间并可以经受多次冻融过程。
另外，如果病毒经过CsCl纯化并被保存在PBS或Tris溶液(10mM Tris PH8.0, 2-3%甘油或蔗糖),应该避免反复冻融，因为这将导致滴度显著下降。
Q7.对于体外实验（细胞实验）CsCl纯化或层析柱纯化有必要么？
Q8.重组腺病毒的推荐存储条件是什么？
Q9.腺病毒表达系统承载外源基因的容量？
Q10.腺病毒有多种血清型，哪一种是基因传递中最普遍使用的？
Q11.什么是RCAs？
Q12.目前存在的许多病毒载体系统，包括：腺病毒、逆转录病毒和慢病毒，针对我的实验应该使用哪个系统？
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Q3.感染细胞时腺病毒的最佳浓度？
答：要得到最佳的实验结果，确定腺病毒的最佳用量是非常重要的。如果用量不足，那么不能达到100%的感染效率，如果用量太高，会对细胞有毒害作用或者其他不可预测的效应。我们应该尽量用最小浓度的病毒来达到100%的基因传递效率。这个最佳的浓度因不同的细胞类型而有显著差异。为了确定你的细胞系的最适病毒用量，可以用带报告基因的腺病毒做预实验，如AdCMV-B-gal或者AdCMV-GFP。用不同稀释倍数的报告基因病毒感染细胞，在感染1-2天后检测感染效率。可以通过B-gal染色或者通过在荧光显微镜下观察细胞的GFP的表达情况来确定可达到100%感染效率但又不会引起细胞表型变化病毒浓度范围。
重组腺病毒常见问题解答(FAQs)
Q1.使用重组腺病毒需要的生物安全级别？
Q佳浓度？
Q4.感染腺病毒时所需要的培养基的量？
Q5.VP，PFU，IFU的区别？哪一个能更好地反映所使用的有活性的病毒的量？
Q6.病毒的滴度是如何测定的？
Q1.使用重组腺病毒需要的生物安全级别？
答：我们所提供的重组腺病毒是E1/E3区缺失的复制缺陷型病毒。根据NIH官方的参考信息，重组腺病毒的生物安全等级被确定为II级，您只需要BL-II级实验设施，值得注意的是，大多数实验室都具备BL-II级的实验设施。野生型腺病毒可复制，能引起感冒和很强的免疫反应，通常不会引起很严重的疾病。要想获得更多生物安全信息，请参考网站
另外，空斑形成实验能够检测有感染能力的病毒，是一个生物学实验。一般来讲，用一系列病毒稀释物感染单层HEK293细胞。病毒将会在感染的细胞中繁殖，最终导致细胞毒性效应，并被释放出来。释放的病毒将感染邻近的细胞。这整个过程将被不断重复，最终导致空斑的形成。为了阻止病毒扩散到细胞的其他区域并开始新的空斑形成过程，在完成最初的感染后，要将一层软琼脂铺在细胞的表层上面。
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Q4.感染腺病毒时所需要的培养基的量？
答：作为参考，我们推荐您按照如下的量加培养基（已混入病毒）：
10cm培养皿：8-10ml/孔6孔板：1ml/孔12孔板：0.5ml/孔24孔板：0.2ml/孔
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Q5. VP，PFU，IFU的区别？哪一个能更好地反映所使用的有活性的病毒的量？
答：VP(Viral particles)反映病毒颗粒的总数（包括活病毒和死病毒），由于在病毒制备过程中，每次活/死病毒比率都不同，VP并不能反映有活性的病毒的数量。
我们已经针对多种细胞系做了预实验，加入已混合病毒的培养基，6-8小时或者过夜。对于大多数细胞系来说病毒浓度在2 x 105 - 1 x 106 IFU/PFU (infectious unit)/ml培养基都能得到10%的感染效率而且不会有副作用。我们推荐在您实验系统中用报告基因病毒重新摸索一下最适培养基用量。
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Q6.病毒的滴度是如何测定的？
答：测定腺病毒的滴度有三种常用的方案：（1）OD260检测，（2）空斑形成实验，（3）终点稀释实验。
OD260可以检测病毒DNA和蛋白的浓度，但不能区分完整的、有感染能力的病毒和损伤的、无感染能力的病毒。这是一个可以检测全部病毒（包括存活和死亡的病毒）含量的物理实验。因此通过检测OD260可以反映并计算出病毒颗粒（VP）的浓度。但在检测OD260以前，病毒首先必须被纯化。
PFU（plaque formation unit）代表可感染的或者活病毒的数量。能反映实验中所需要的病毒的量。
IFU（infectious unit）相当于PFU
大多数情况下所制备的病毒，VP/PFU比值在20:1到50:1范围。
应用VP（viral particles）做单位会与实际应用的活病毒的数量有很大出入。用IFU或者PFU做单位会得到比较一致的结果。