凝胶过滤层析的分类

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分配系数: Kd=(Ve-Vo)/Vi Kd=0:说明该物质完全分布于流动相,固定 相分布为零。(分子很大,不进入凝胶网孔) Kd=1:表示该种物质能均等地分布在流动相, 在两相间分配的比值为1。(分子极小,可 自由通过网孔进出凝胶) 0<Kd<1:分子大小处于这两个极端之间,它 的洗脱体积应在V0到V0+Vi之间;另一方面, 相对分子质量与洗脱体积有关,所以在有适 当的已知相对分子量的物质作为标准进行比 较的条件下,就可以根据洗脱液的体积来估 计物质的相对分子量。
凝胶层析的原理:利用具有网状结构的凝胶的分子 筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行 分离。
凝胶层析柱的总体积Vt实际上是三种体积的
总和,即V0(外水体积)、Vg(凝胶颗粒基质)、Vi(内 水体积)的总和。其中Vi和Vg之和也即是层析柱 固定的总体积。
1.总床体积: Vt =Vo+Vi+Vg 2.某一成分从层析柱内完全被洗脱出来所需洗 脱液的体积 : Ve=Vo+KdVi
应用
a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 浓缩 c. 蛋白质分子量的测定
装柱的注意事项:
源自文库
1. 柱要保持垂直。 2. 液面要高于胶面。 3. 要根据所需纯化物质的分子量选择胶 的孔径。本实验用G-50。 4. 胶要充分膨胀,并去掉小颗粒。 5. 装柱要均一,胶面要平整,柱不能留 有气泡(包括死空间),必要时可用玻 棒在凝胶表面轻轻搅拌,再让凝胶自然 沉淀。胶柱不能有断层。否则得重装。
优点: a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析 柱可反复使用 凝胶的类型: (1)Sephadex: 交联葡聚糖 G-10,15,25,50, 75,100,150,200 商品凝胶的型号,用吸水量的10倍数字表示(比如: 每克干凝胶吸水量为2.5克时,其型号为G-25) (2)Sepharose:琼脂糖凝胶 Bio-Gel A (3)Bio-Gel P:聚丙烯酰胺凝胶分子筛 (4)Sephacryl:用N,N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡 聚糖凝胶
凝胶及柱的选择
•凝胶的处理及装柱
凝胶干粉的溶胀(热溶 胀)、浮选、抽气、蓝 色葡聚糖检查、装柱、 平衡 装柱时要注意操作压。 操作压=柱内液面和出水 接管末端的高度差
样品上柱 洗脱收集
部分收集器、核酸蛋白检测仪
(蛋白质在280nm处的光吸 收值与其浓度成正比) 凝胶的保存方法
0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰
6. 装完后上样前要用洗脱液平衡。 7. 要稳压,控制洗脱液排出口与洗脱瓶 之间的高度差,并控制洗脱速度,速度 为6—7滴/分钟。 8. 使用过的柱用2倍洗脱液平衡后可再 上柱使用。 9. 上样时,缓慢沿层析柱内壁加于柱床 表面。
3.离子交换层析 固定相为离子交换剂,利 用各组分对离子交换剂的亲和力不同而 进行分离。 4.凝胶层析 固定相为多孔凝胶,利用各 组分在凝胶上受阻滞的程度不同而进行 分离. 5.亲和层析 根据生物特异性吸附进行分 离,固定相只和一种待分离组分有特异 性的亲和能力而结合,而与无结合能力 的其他组分分离。被分离的大分子与固 定相发生可逆的非共价结合(如:抗原 与抗体、激素与受体、酶的活性中心与 专一的底物等。)
凝胶过滤层析 (分子筛层析、排阻层析)
层析技术的分类: 按层析原理的分类: 1.吸附层析 固定相是固体吸附剂,利用各 组分在吸附剂表面吸附能力的差别而进 行分离。 2.分配层析 固定相为液体,利用各组分在 两种不相溶的溶剂间有不同的分配系数 来实现分离的方法。 分配系数K=(固 定相中溶质的浓度)/(流动相中溶质的 浓度)
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