凝胶过滤层析的分类
凝胶过滤层析
C. Sephadex G-150（分级范围， 5,000-400,000 D）
凝胶粒度的影响
凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱 流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒 凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐 等。 在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μ m左右较合适。对于在水中 保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μ m左右。凝胶颗粒大小 要均匀，这样流速稳定，效果较好
层析柱 （ a ）自制简易层祈柱（ 1 ．玻璃 管；2.橡皮塞；3．尼龙网）； （b）普通商品柱； （c）双底板层析柱（1.洗脱液进 出口； 2. 多孔底板； 3 ．柱床； 4 ．恒温水进口； 5 ．恒温水出口； 6．可调节的塞子）
4、样品的准备
样品的粘度：粘度大产生介质吸附， 一般要求样品粘度小于0.01Pa· s
选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小 分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd=0， 小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。
例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下 列哪种凝胶最合适？
A. Sephadex G-15（分级范围， <1,500 D） B. Sephadex G-25（分级范围，1000-5000 D）
凝胶过滤层析
定义
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层 析（size exclusion chromatography）、分子筛层 析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 透层析（Gel Permeation Chromatography）
凝胶过滤层析简介
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
柱的选择 柱的装填
同样直径的层析柱 同样长度的层析柱 同样体积的层析柱 理想的层析柱
长层析柱比短的分辨率高； 直径大的比小的分辨率高； 层析柱长的比短的分辨率高。 直径与长度之比是1：25-1：100
常用的支持物有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。 空柱中应留约1/5的水或溶剂。 不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。
测定分子量
当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。
0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。
|分类与性质
凝胶
分类性质
凝 胶 含大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构，
一般制成球状颗粒。
性
能 多孔、亲水、惰性、稳定、色谱性能好
凝胶过滤层析技术
凝胶过滤层析技术 content
凝胶过滤的基本原理
凝胶分类与性质 凝胶过滤的基本操作
凝胶过滤层析的应用
|基本原理
原理
分子
洗脱体积
分配系数
凝胶过滤法又称为分子筛层析、凝胶 层析或排阻层析,是利用凝胶 的网状结构根据分子大小进 行分离的一种方法。凝胶过
Services 滤所用的介质是由交联葡萄
| 基本操作
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
凝胶再生 凝胶保存
仅使用过一次的凝胶柱，通常进行更新平衡后 即可再次使用； 湿法：洗净的凝胶悬浮于蒸馏水和缓冲液中，应加入 适量的防腐剂如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不 先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲液进行 然微生物将生长。 平衡，平衡毕，即可重复使用 干法：用浓度逐步升高的乙醇洗净凝胶，使其脱水收 把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理 缩，再抽干乙醇，用60-80℃的暖风吹干，在室温下 方法进行，处理后重新装柱即可再行使用 保存。 半缩法：是过度法，用60%-70%的乙醇使凝胶部分脱 水，然后封口，4 ℃保存。
层析技术分离生物大分子(凝胶过滤)
4、标准曲线的制作 （1）用洗脱液配制标准蛋白溶液供全班使用，溶液中 二种蛋白的浓度各为：牛血清清蛋白（10mg/mL）、溶 菌酶蛋白（10mg/mL）。 按（3）的操作方法加入上述标准蛋白溶液0.5mL，以 3-5mL/10min的速度洗脱并收集洗脱液。 同时用核酸蛋白检测仪测定A280，并确定各种蛋白的 洗脱峰最高点，然后计算出两种标准蛋白的洗脱体积 Ve。 5、以A280为纵坐标，Ve为横坐标画出标准蛋白的洗脱 曲线。（电脑画出） 6、以Kav为横坐标，LogMr为纵坐标作标准曲线。 在标准曲线上查出未知蛋白的LogMr，其反对数便是待 测定蛋白质的分子质量。 注意：实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次 实验使用，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。
图例：
凝胶过滤曲线 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 0 0.2 0.4 （Kav) 0.6 0.8 y = -0.9961x + 4.9165 R 2 = 0.9985
思考：SDS-PAGE和凝胶过滤分离蛋白质及测定分子量有 何不同？
(lgMR)
层析技术分离生物大分子
一、原理
分配系数
Ve – Vo Kav=
Vt - Vo Vt——层析床总体积 Ve——洗脱液体积 Vo——外水体积 分子量大，全排出 分子量中 分子量小，进入内部
Ve= Vo Ve= Vo+ KavVi Ve= Vo+ Vi
Kav=0 0< Kav<1 Kav=1
凝胶柱总体积（Vt）的测定： 在最后走样品后,距离胶柱上端作一个记号， 回收凝胶，关闭柱出水口，加入去离子水，打开 出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后 用量筒接受柱中去离子水（水面降至层析柱玻璃 筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt。
第七章 凝胶层析
一、凝胶的选择和处理 二、凝胶层析柱的设计和制备 三、凝胶层析操作 四、主要参数测算 五、凝胶层析的扩展
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一、凝胶的选择和处理
（一）凝胶的选择 (1).将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋
白质与盐类，称作类分离。
(2).将分子量相差不大的大分子物质加以分离， 如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分 离。
避免硼酸缓冲液
（二）架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）
架桥琼脂糖凝胶为琼脂 线性分子经1，3-二溴丙 醇交联的凝胶。
它的凝胶孔径均匀，机 械强度明显加大。
对热和化学物质的稳定 性 大 大 增 加 , 在 pH3~14
范围内稳定。
36
（三）超胶（Utro-gel ACA）
所谓超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。 商品名称后面的编号为两位数，各表示混合胶中聚
例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分 子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗 脱出来。
4. 分级分离范围
分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分 子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好 的线性分离。
例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为 3,000－70,000，它表示分子量在这个范围内的球形 蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。
21
一、葡聚糖凝胶 (Sephadex)
1.结构
商品名为Sephadex G类 . 交联葡聚糖的基本骨架是葡
聚糖。 再经3-氯-1，2-环氧丙烷为
交联剂，形成三维网状结构 的高分子化合物。 其交联度是通过交联剂的加 量及反应条件来控制的。
22
2 规格型号：
凝胶过滤和亲和层析
（二）、层析原理 1.以共价键将配位体与不溶性基质连接，制成层析床。 2.将欲分离样品加到柱上，与配位体有亲和性的大分子被保 留，其它直接流过。
3.改变洗脱剂组成，使吸附大分子解离和洗脱。
（三）、亲和层析的吸附剂 1、基质 1）、理想基质的性质 (1)不溶性基质应具备松散的多孔网络，大分子可以均匀和不 受阻碍地进出，并具有良好的流动性。 (2)凝胶颗粒应为规则球形，并具刚性，有利于流动和耐受静 压。 (3)基质的化学性质必须是惰性的，基质骨架与蛋白质等的反 应必须极弱以降低非特异 性结合吸附作用。 (4)凝胶的理化性质必须稳定，不因偶联配位体和吸附、洗脱 互补大分子所应用的条件而发生变化。 (5)基质必须有能活化或修饰的功能基，并且数量充足，以便 能偶联较多的配位体。
（七）、洗脱的流速
当洗脱的流速增加时，色谱的分辨率降低。 可根据不同的目的选择适合的流速。要求得到好分 辨率时，要采用长层析柱和慢流速。要得到快速分离，可 采用短层析柱和快流速。好分辨率与快速分离不可兼得。
（八）、优化
有时不是一次就可以得到很理想的分离条件，可通过优 化来选到。例如：
A : IgG, B: transferrine, C: α-chymotrypsinogen IgG与transferrin已无法在 保持好分辨率的情况下加 快洗脱速度。 Transferrine 和αchymotrypsinogen的分离可 以加快流速，分辨率仍可 为2.25。 如改变柱长，使分辨率为1， 柱长约为17cm，分离时间 由30小时变为35分钟。
亲和层析(affinity chromatography)
一、介绍
（一）、概念：亲和层析是利用配位体和大分子相互作用时 所固有的独特的生物学特性建立的一种吸附层析.
凝胶过滤层析原理
凝胶过滤层析原理凝胶过滤层析原理是一种生物化学技术，常用于对蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
它基于凝胶的选择性，通过分子大小和形状的差异来实现生物大分子的分离。
凝胶是一种多孔结构的凝胶体，通常由聚丙烯酰胺或琼脂糖等高分子物质组成。
凝胶过滤层析的原理就是将待分离样品加入到一层固定在糖凝胶基质上的膜中，再通过注入缓冲液使其在凝胶中进行迁移。
不同大小和形状的分子会在凝胶中通过不同的速度、途径和距离进行移动和分离。
在凝胶层析中，分子的迁移受到凝胶孔隙大小的限制。
孔隙越小，分子迁移的速度就越慢，分子会在凝胶中停留更长的时间。
因此，分子的分离程度取决于其分子大小和凝胶孔隙大小之间的差异。
凝胶层析可以分为两种类型：凝胶过滤层析和凝胶渗透层析。
凝胶过滤层析是利用凝胶基质孔隙大小的差异实现不同分子的过滤和分离。
较大的分子被阻挡在凝胶中，而较小的分子可以通过凝胶基质的孔隙，从而实现分离。
凝胶渗透层析则是利用凝胶基质孔隙中水合盖层的形成来实现分离。
分子在凝胶中形成水合物，而较大的分子受到水合盖层的阻挡，不能通过凝胶孔隙，从而停留在凝胶中。
较小的分子则可以通过凝胶孔隙，由于不形成水合物，迅速透过凝胶，实现分离。
凝胶层析可以通过调节凝胶孔隙大小来实现对不同大小分子的选择分离。
通过改变凝胶基质的组成、交联程度和浓度，可以调节凝胶的孔隙结构。
此外，还可以根据分子的分子量进行凝胶层析的选择性分离。
在凝胶层析中，常用的缓冲液是通过控制pH和离子浓度来维持凝胶中分子的稳定迁移。
较小的分子通常迁移速度较快，而较大的分子迁移速度较慢。
根据样品的性质，可以调节缓冲液的pH和离子浓度，以改变分子的迁移速度，实现更好的分离效果。
总之，凝胶层析通过凝胶基质的孔隙大小和水合盖层的形成来实现对生物大分子的分离和纯化。
凝胶过滤层析和凝胶渗透层析是其中两种常用的方法。
通过调节凝胶基质的孔隙结构和缓冲液的组成，可以实现对不同大小分子的选择性分离。
凝胶层析的研究及其应用
凝胶层析的研究及其应用凝胶层析是一种常见的分离和纯化生物大分子的技术方法，广泛应用于生物化学、分子生物学、生物医学等领域。
本文将介绍凝胶层析的研究及其应用。
一、凝胶层析的原理和分类凝胶层析是利用凝胶作为分离介质，根据生物分子在凝胶中的分子大小、形状和电荷差异，通过毛细管效应和几何阻滞效应实现生物大分子的分离和纯化。
凝胶层析可分为凝胶过滤层析、凝胶吸附层析和凝胶电泳层析三种主要方法。
1.凝胶过滤层析：根据生物分子的大小和孔径大小的选择，将较大的生物分子滞留在凝胶中，而较小的生物分子则通过凝胶颗粒。
常用的凝胶过滤介质有琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。
2.凝胶吸附层析：根据生物分子与凝胶吸附剂（如离子交换剂、亲和吸附剂）之间的亲和性差异，实现生物分子的分离纯化。
常用的凝胶吸附介质有离子交换凝胶、亲和性凝胶等。
3.凝胶电泳层析：根据生物分子的电荷差异，在电场作用下，通过凝胶孔隙内的离子迁移实现生物分子的分离。
常用的凝胶电泳介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。
二、凝胶层析的研究进展凝胶层析技术的研究中涉及到凝胶材料的制备与改性、凝胶层析流程的优化和成像技术的发展等方面。
1.凝胶材料的制备与改性：为了提高凝胶分离效果，研究人员常对凝胶材料进行制备和改性。
如调控凝胶孔隙大小、凝胶表面的亲和性等。
同时，还探索了新型的凝胶材料，如纳米凝胶和水凝胶。
2.凝胶层析流程的优化：凝胶层析的分离效果受到多种因素的影响，包括凝胶浓度、缓冲液pH值、离子浓度和柱床尺寸等。
因此，优化凝胶层析流程能够提高分离效率和纯化效果。
3.成像技术的发展：凝胶层析结合成像技术能够实时观察分离过程中的分子分布，提供有关分子大小、形状和电荷的信息。
如蛋白质凝胶电泳的银染色、荧光标记和质谱等技术的应用。
三、凝胶层析的应用凝胶层析在生物化学、分子生物学和生物医学等领域广泛应用于分离和纯化生物大分子。
1.蛋白质纯化：凝胶层析可以根据蛋白质的大小、电荷和亲和性等特性进行分离。
凝胶过滤层析
因此分子的正常Ｋav值0~1之间,这种由小 到大的顺序决定了物质流出的顺序。
排阻极限： 是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部 的最小分子的分子量。
排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分 子量。
第二节 凝胶介质的分类和性质
1） 葡聚糖凝胶 ① G类葡聚糖（Sephadex） ② LH-亲脂型葡聚糖 ③ Sephacryl
凝胶过滤原理示意图
凝胶层析的几个概念
外水体积（Vo）：是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积。 内水体积（Vi）：是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体 积。 基质体积（Vg）：是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积（Vt）：是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积 （Ve）：样品中某组分洗脱下来所需洗脱液的总体积。
（2） 琼脂糖凝胶
商品名 Sepharose（瑞典）
1）2B,4B等型号，数字代表颗粒中琼脂糖的百 分含量，数字越大，分离的范围越小 2）与1，3－二溴异丙醇反应生成交联琼脂糖， 稳定性提高；
Bio－gel A(美国）
一般有A0.5, A1.5等型号，数字×106代表分 离的分子量极限；
与葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶相比，琼脂糖凝 胶机械强度和筛孔稳定性好，洗脱速度可以快些
对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水 体积和在外水体积中的浓度分配关系。
Ｋav＝（Ｖｅ－Ｖｏ）／(Ｖt － Vo)
它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔 隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无 关，也就是说它对每一物质为常数与柱的 物理条件无关。
（1）Ｋav = 0时,Ve = Vo,意味着该分子完全被排 阻于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,在固定相 分布为0,而最先流出。
凝胶过滤层析技术原理讲解
凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶过滤层析技术原理讲解(附动画)原创作者;gfzhang凝胶过滤层析(Gel Filtration Chromatography，GFC)又称尺寸排阻层析(Size Exclusion Chromatography，SEC)凝胶渗透层析(Gel Permeation Chromatography，GPC)分子筛层析(Molecular Sieve Chromatography，MSC)注:在高效液相色谱分析中，用GFC或SEC表示凝胶过滤色谱或尺寸排阻色谱，流动相通常是水溶液;在有机高分子分析中，常用GPC表示凝胶渗透色谱，流动相通常是有机溶剂;在蛋白质分离纯化中用GFC或SEC表示凝胶过滤层析或尺寸排阻层析;本文以下内容均针对蛋白质分离，因此均以凝胶过滤层析(GFC)表示。
(1)分离机理GFC填料是由高分子交联而成、内部具有网状筛孔的固体颗粒，利用球状凝胶内的筛孔的大小，不同水力学半径的分子在通过填料时运行路径存在差异，利用该差异将不同大小的蛋白质进行分离。
蛋白质分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，因此总体运行路径较短，从层析柱入口到出口所需时间较短;较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，总体运行路径较长，故在管柱内的停留时间较长;基于此原理可以区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而确定未知样品的分子量。
注1:球形蛋白与线性分子在凝胶过滤层析中的保留行为存在差异，因此使用球形蛋白制作的分子量标准曲线不能用于明胶多肽、淀粉或其它聚合物。
(2)应用范围A蛋白质分离，基于混合中不同蛋白质分子尺寸大小进行分离;B分子量测定，蛋白质分子量(球形)的对数与其在凝胶过滤层析时的保留时间呈线性关系; C样品脱盐或溶剂置换。
(3)填料要求一般状况下，用于制备凝胶过滤层析的填料应不吸附目标成份，所有欲分离物质均被洗脱出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。
色谱分离技术凝胶筛分
缺点：
5
凝胶强度低，可耐受的压力通常低于0.2个大气压，
6
故流速低，通常的线速度小于20cm/h。因此，处理速度
7
较慢。但Superdex的最大耐受压力可达15个大气压，流
8
速也提高近10倍。
9
无机填料：
表面改性后的硅胶，主要是用有机物或聚合物对硅胶
颗粒进行处理，增加其亲水性并消除或抑制体积排阻以
Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生
物， 能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。
琼脂糖凝胶：
1
商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，
2
pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。
3
琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维
09
子大小的顺序流出色谱柱（层析柱）从而达到分
10
离的目的。
凝胶过滤介质：良好的凝胶过滤介质应满足如 下要求： （1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任 何化学或物理相互作用； 蛋白质的分级和除盐效果只与溶质的相对分子量、 分子形状和凝胶结构（孔径分布）有关，与所用洗脱液 的pH值和离子强度等物性无关。 （2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试 剂中保持稳定，使用寿命长； （3）具有一定的孔径分布范围； （4）机械强度高，允许较高的操作压力。
分离操作模式 洗脱展开：最常用 前沿（迎头）分析 顶替展开
用于大量制备
根据溶质和固定相间的作用机理
01
凝胶过滤
02
离子交换
03
反相色谱
04
疏水层析
05
亲和色谱
06
分配机理
凝胶过滤层析的分类
凝胶过滤层析的分类
凝胶过滤层析是一种常用的生物制剂分离和纯化技术，主要用于生物大分子的精细纯化和结构研究。
它是利用小孔隙的凝胶纤维或颗粒作为固定相，在其内部通过物质的分子筛选和分散作用，实现对混合物中生物大分子的分离和纯化。
根据其分离原理、凝胶基质和实现机制，可以将凝胶层析分为以下几类：
1. 分子筛层析
分子筛层析是利用具有一定孔径分布的凝胶基质分离混合物中分子大小差异较大的生物大分子。
该技术通常使用具有不同孔径大小的凝胶柱，较小的分子可透过凝胶孔道而较大的分子则被阻滞并在凝胶孔道内停留，从而实现克隆、富集和大分子的纯化。
2. 逆流层析
逆流层析是将混合物中组分与凝胶基质相互作用后，通过逆向流动，选择性地读出不同组分。
该技术主要利用大分子与凝胶基质的亲和作用，通过连续返流溶液在凝胶柱内的往复流动，将具有亲和性的分子迅速疏水排放，从而实现分离和纯化。
离子层析是基于凝胶基质与某些离子的亲和性而实现分离纯化的技术。
离子层析通常采用常见的阴离子或阳离子的亲和柱，利用空间分离、分子交互作用和高效分离的特性。
离子层析是分离、富集和分析各种生物大分子分子的重要技术手段之一。
4. 亲和层析
亲和层析是基于凝胶基质与生物大分子之间的特异性结合而实现分离纯化的技术。
该技术利用富集目标大分子与凝胶基质亲和性较高的特点，通过配对反应的选择性结合，进一步提高其纯化效率和选择性。
综上所述，凝胶过滤层析的分类主要包括分子筛层析、逆流层析、离子层析和亲和层析。
随着生物制剂的应用不断扩大和完善，各类凝胶层析的应用和发展将日趋重要。
第七章层析分离技术2——凝胶过滤层析
（1）介质不带电荷, 具有化学惰性，不与被分离物 质发生化学反应，条件温和，不会使物质变性；
（2）色谱介质不需再生,可反复便用； （3）分离效率高，回收率较高； （4）广泛应用于生物大分子的初级分离，脱盐等。 （5）分辨率较低，需采用细长柱。 （6）经过凝胶过滤色谱后样品被稀释，上样前需
显影响 其分离效果不受去污剂、促溶盐类、变性剂等影响 能在多种有机溶剂存在下使用
②Superdex
根据分级范围不同，可分为若干型号（见表5.6，P80）， 其中，数字越大，孔径越大。 prep grade 颗粒较大。
Superdex peptide Superdex 30 prep grade Superdex 75、200 （ prep grade ）
根据交联之前母胶中琼脂糖的含量不同，Sepharose CL系 列凝胶也有三种类型：Sepharose CL-2B、Sepharose CL4B和Sepharose CL-6B。
特点
Sepharose CL系列凝胶在颗粒直径、分级范围方面与Sepharose系 列完全相同
在pH稳定范围、机械强度（流速）及温度稳定性等方面得到了很 大的改进
二、凝胶过滤介质
2. 凝胶介质的种类
按基质组成主要可以分为 ：
葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯 -二乙烯苯凝胶、二氧化硅凝胶，以及由两种物质混合 形成的如琼脂糖-葡聚糖混合凝胶、聚丙烯酰胺-葡聚糖 混合凝胶等。
按凝胶过滤层析能达到的柱效和分辨率又可分为：
标准凝胶介质：颗粒尺寸较大（一般为100~250 μm），机
（1）葡聚糖凝胶（Sephadex ） G-数字 联度越大，分级范围越小。）
凝
胶 过
（2）琼脂糖凝胶
实验六凝胶过滤层析
一 实验原理
凝胶层析是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相， 由于在层析过程中样品不同的蛋白质具有不同的洗脱， 使不同的分子量的组分得以别离的层析方法。凝胶层 析的别离过程是在装有多孔物质如交联聚苯乙烯、多 孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等填料的柱中进展的。
填料颗粒含有许多不同大小的孔隙。这些孔隙对于溶 剂分子而言是很大的，他们可以自由扩散出入。对于 溶质分子而言，如果分子大小适宜时，那么可以不同 程度地往孔隙中扩散，大分子量的溶质分子只能占有 较小的孔隙，而小分子量的溶质分子除能占住大孔隙 外，还可以占有另外一些起更小的孔隙。
其定量关系符合以下公式：
Ve=Vo+KV1 Ve：某一溶质的洗脱体积 Vo：层析柱的外水体积 Vi：层析柱的内水体积 K：某一溶质的分配系数
二试剂和器材
1．试剂
Sephadex G-75 0.005M PBS 兰色葡聚糖 样品溶液
二试剂和器材
2．器材 〔1〕带夹套层析柱：φ：h=1:24 〔2〕加样器 〔3〕分部收集器 〔4〕核酸蛋白检测仪 〔5〕小玻棒
三 操作步骤
2 层析柱的选择 对于大分子量化合物的分级别离，要求
柱床体积大于样品体积25倍以上，最高 可达100倍，层析柱的径高比也在25100之间。为了减少温度对别离蛋白质 活性的影响，层析柱外加夹套，通入低 温循环水，以保持低温。
三 操作步骤
3 凝胶柱的装填和凝胶床的检查 将层析柱垂直固定，层析柱预装1/5的平衡溶液，再将适当浓度
三 操作步骤
5 洗脱与收集 为了防止柱床体ห้องสมุดไป่ตู้的变化，造成流速降低及重复
性下降，整个洗脱过程应始终保持一定的操作压。 流速不能过快且要稳定。洗脱液的成分不应改变。 洗脱液采用分部收集器收集，以核酸蛋白检测器 检测洗脱峰。
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析法是一种常用的实验室分析技术，它可以将混合溶液分离成不同的成分。
该方法主要利用一种含有疏水性的底物的结构性聚合物（凝胶）作为滤床，通过滤床上物
质的比较灵活的空间配比，利用物质的大小、形状、电荷、形态等分子特性的不同，进行
凝胶过滤层析，实现它们的分离和分离富集提纯加离。
凝胶过滤层析实验室分析中，根据物质与凝胶分子相互作用方式不同，分为离子交换
层析和非离子交换层析两种方式。
离子交换层析中，常用的凝胶有Amberlite XAD-2、Amberlite IR-120等；而非离子交换层析中，常用凝胶有Sephadex G-50、Sepharose 4B、Flysorb V、ComboGel等。
凝胶过滤层析实验属于实验离子交换，首先应正确配置实验设备，然后将原混合胶固
化成凝胶颗粒，最后将混合溶液放入过滤室中，并以规定的渗透速率和浓度进行过滤，
实现各成分的分离和分离技术的提纯。
通过此技术，不仅能有效地分离和提纯高浓度的有
用物质，而且可以获得具有不同性质的物质，获得较高纯度的有用物质。
凝胶过滤层析作为一种相对简单、快捷、可操作性强的实验方法，已广泛应用于药用
植物材料及药物分析、环境污染物实验分析、食品分析、细胞培养分析等领域，可满足实
验研究中分离富集提纯加离的需要。
第五章-凝胶过滤层析
第五章 凝胶过滤层析 第一节 概 述
凝胶过滤具有的优势 : （1）凝胶介质不带电荷，具有良好的稳定性，分离条件温 和，回收率高，重现性好； （2）通常情况下，溶液中存在各种离子、小分子、去污剂、 表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响，层析还能 在不同pH、温度下进行； （3）应用范围广，能分离的物质相对分子质量的覆盖面 宽，从几百到数百万，因此既适用于分子量较低的寡糖、寡 肽、聚核苷酸等生物小分子的分离，也适用于蛋白质、多糖、 核酸等大分子物质的纯化； （4）设备相对简单、易于操作、分离周期短、连续分离时 层析介质不需再生即可反复使用。
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
一、凝胶过滤的概念
不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶色谱分离原理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子，它们 完全进入凝胶颗粒网孔内部，洗脱时所受阻力最大，流程也 最长，最后从层析柱中被洗脱； 3.分子量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子，它们依 据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的，是该凝胶介质 的有效分离对象。 如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限，或者 均小于分级范围下限，它们就无法通过层析而分离。
二、生物分子的相对分子质量、分子大小和形状
每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围，分级范 围是凝胶介质的重要参数。 根据其分级范围，可以将溶质分子分为三类： 1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子，它们 完全被排阻在凝胶颗粒网孔外，从颗粒间隙中通过，所受阻 力最小，流程也最短，首先从层析柱中被洗脱下来；
凝胶过滤层析
6、洗脱和收集
打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。 用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。
层析柱 （a）自制简易层祈柱（1．玻璃 管；2.橡皮塞；3．尼龙网）； （b）普通商品柱； （c）双底板层析柱（1.洗脱液进 出口；2.多孔底板；3．柱床； 4．恒温水进口；5．恒温水出口； 6．可调节的塞子）
4、样品的准备
样品的粘度：粘度大产生介质吸 附，一般要求样品粘度小于 0.01Pa· s 样品的浓度：样品浓度以不大于4 ％为宜，样品浓度过大往往导致 粘度增大。如果样品浑浊，应先 过滤或离心除去颗粒后上柱
该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵 抗力，在pH4.0-9.0的缓冲液中是稳定的。 琼脂糖凝胶室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰 胺和葡聚糖凝胶。 琼脂糖凝胶在干燥状态下保存时易破裂，故一般存放 在含防腐剂的水溶液中，同时还要避免剧烈的搅动。 琼 脂 糖 凝 胶 按 其 浓 度 来 分 有 Sepharose 2B(2 ％ ) 、 4B(4％)和6B(6％)。 Sepharose 6B的机械强度大于2B，但是筛孔小于 2B。
C. Sephadex G-150（分级范围， 5,000-400,000 D）
凝胶粒度的影响
凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱 流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒 凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐 等。
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