慢病毒包装体系使用说明
慢病毒(过表达)包装步骤
慢病毒（过表达）包装步骤秦超1.转染复苏293T细胞,传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。
转染步骤：（以10cm培养皿为例）⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%—90%，保证细胞处于良好的状态,转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。
⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti—mem，混匀⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti—mem，混匀，室温静置5min⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。
2.收毒(36—48h)收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可.⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min,以沉淀细胞碎片。
⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管(用蛋白质浓缩管即可）中。
4000rpm离心至所需体积。
⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液,按每次的接毒量分装，-80℃冻存。
由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。
3.接毒接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40％—50%，务必使用生长状态良好的细胞。
将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml细胞密度60%—70%时可以再接毒一次。
4.检测及培养细胞系（48h)如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。
如需培养成细胞系,可继续培养。
如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。
慢病毒包装操作方案
v1.0 可编辑可修改慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM InvitrogenDMSO（冻存用）10%2 慢病毒包装试剂试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000InvitrogenOpti-MEM基础培养基InvitrogenPEG6000溶液50%WakoNaCl溶液40 mMHBSS溶液Invitrogen3 耗材50 mL离心管15 mL离心管10 cm细胞培养皿μm过滤器2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。
在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。
4)在室温条件下，250 g离心4分钟。
5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取 2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置 37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。
（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。
）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。
1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。
将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。
[高等教育]慢病毒包装操作说明
![[高等教育]慢病毒包装操作说明](https://img.taocdn.com/s3/m/a4ea667dfc4ffe473368abe1.png)
Clontech-Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User ManualProtocol No. PT5135-1慢病毒包装操作说明A.用Lenti-X HTX Packaging System生产慢病毒悬浮物为了获得最高效价的病毒悬液，用Lenti-X 293T细胞系，严格尊守以下说明，尤其尊守（1）培养体系和培养量（2）DNA的量和转染质量（3）无四环素血清（4）孵育时间。
所有的Xfect™转染成份，量和条件最好用Lenti-X Vectors，Lenti-X HTX 包装混合物，Lenti-X 293T细胞。
用10cm组织培养板并确保血清无四环素，四环素污染的血清对表达包装成份是有害的。
所有的实验步骤均在无菌组织培养器血中完成。
包装病毒需要有微生物安全等级2的生物安全柜中进行，注意重组的假性慢病毒包装颗粒能够感染人。
1.转染24小时前，在10cm培养板接种4-5×106个293T细胞，添加10ml的生长培养基。
在37℃，5%CO2℃条件下过夜。
在进行第7步前确保培养血有80-90%的覆盖率。
2.充分混均Xfect Polymer。
3.每个转染样品需准备两个离心管，按顺序添加如下试剂Tube 1(Plasmid DNA) Tube 2(Polymer)557µl Xfect Reaction Buffer 592.5µl Xfect Reaction Buffer 36µl Lenti-X HTX Packaging Mix 7.5µl Xfect Polymer7µl Lenti-X Vector DNA(1µg/µl)600µl 总量600µl 总量注意：Xfect Polymer 不要在室温下搁置长于30min4.充分混均每个管5.把Tube2添加到Tube1中，中速涡旋10秒。
慢病毒包装操作说明
Clontech-Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User ManualProtocol No.PT5135-1慢病毒包装操作说明A.用Lenti-X HTX Packaging System生产慢病毒悬浮物为了获得最高效价的病毒悬液，用Lenti-X 293T细胞系，严格尊守以下说明，尤其尊守（1）培养体系和培养量（2）DNA的量和转染质量（3）无四环素血清（4）孵育时间。
所有的Xfect™转染成份，量和条件最好用Lenti-XVectors，Lenti-XHTX包装混合物，Lenti-X293T细胞。
用10cm组织培养板并确保血清无四环素，四环素污染的血清对表达包装成份是有害的。
所有的实验步骤均在无菌组织培养器血中完成。
包装病毒需要有微生物安全等级2的生物安全柜中进行，注意重组的假性慢病毒包装颗粒能够感染人。
61.转染24小时前，在10cm培养板接种4-5×10个293T细胞，添加10ml的生长培养基。
在37℃，5%CO2℃条件下过夜。
在进行第7步前确保培养血有80-90%的覆盖率。
2.充分混均Xfect Polymer。
3.每个转染样品需准备两个离心管，按顺序添加如下试剂Tube 1(Plasmid DNA) Tube 2(Polymer)557µlXfectReaction Buffer592.5µl Xfect ReactionBuffer36µl Lenti-X HTX Packaging Mix7.5µl Xfect Polymer7µl Lenti-X Vector DNA(1µg/µl)600µl 总量600µl 总量注意：Xfect Polymer不要在室温下搁置长于30min4.充分混均每个管5.把Tube2添加到Tube1中，中速涡旋10秒。
慢病毒包装操作方案
慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM Invitrogen2 慢病毒包装试剂PEG6000溶液50%Wako3 耗材●50 mL离心管●15 mL离心管●10 cm细胞培养皿●0.45μm过滤器● 2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。
在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C 水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。
4)在室温条件下，250 g离心4分钟。
5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。
（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。
）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。
1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。
将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。
在显微镜下观察，可看到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱离，此时应立即终止消化，若细胞仍然有大部分贴壁，可适当延长孵育时间；3)加入等体积完全培养液终止消化，并用吸管吹打培养瓶底2-3次使所有细胞彻底脱壁。
慢病毒包装实验步骤
慢病毒包装实验的要点：1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代；2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多；3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。
尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多；实验前要准备的试剂、耗材和仪器；试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL 转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。
耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。
仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。
第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）；实验前准备：安全柜开紫外灯照30分钟；把培养基和试剂放置常温；消化细胞：从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。
细胞铺板：在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。
放置培养箱中培养48h。
插入铺板后图片刚铺板后铺板1天后第三天：上午细胞转染：细胞铺板48h后，从培养箱取出293FT细胞，倒置显微镜观察，细胞密度达90%左右；吸出原有培养基，沿皿壁缓慢加入8ml完全培养基，放置于培养箱中，待转染。
基础医学研究protocol：慢病毒包装
一、puromycin杀伤曲线的制作1、12孔板中铺适量细胞（记住此时的细胞密度），每种细胞6孔2、文献查阅适宜该种细胞的puro浓度，再该值上下设定浓度梯度，通常以0.5或1为一个单位3、配制不同浓度的puro，加入细胞中，留1孔作为blank对照4、每2天更换一次培养基，并添加相应浓度的puro5、开始杀伤的第四天，观察细胞，以cell全部死亡的最低浓度作为病毒感染的puro杀伤浓度二、病毒包装：1、第一天：一盘长满的293T细胞1：3传代于10cm的平板，添加10mlDMEM培养基（10%FBS）传代后次日下午进行病毒包装，即为合适的细胞浓度2、第二天：准备转染复合物：总1ml体系复合物A：pLKO-Tet-On shRNA 20 µg (must be high purity, ≥0.5µg/ul)pLP1 6 µgpLP2 2 µgpLP/VSVG 2 µgCaCl2（2M）62.5μL加ddH2O补至500ul溶液B：2×HBSS 500ul3、用流式管加入B液并始终以合适的速度涡旋，同时缓慢加入复合物A，避免形成肉眼可见的颗粒。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在磷酸盐溶液中加入DNA-CaCl2溶液时需用空气吹打，以确保形成尽可能细小的沉淀物，因为成团的DNA不能有效地粘附和进入细胞。
4、在标准生长条件下培养12h-18h，除去培养液，加入7ml完全培养液培养细胞。
4、继转染后48h，收取上清，4度保存5、重新加入4ml 培养基，培养24h，收取上清6、1500rpm离心10min，取上清分装后存于-80（共10ml上清）三、病毒感染1、铺适量细胞（同制作杀伤曲线的细胞密度）于12孔板2、24h后细胞贴壁，更换全病毒的培养基，0.5ml病毒/孔（DMEM）或者0.3ml病毒+0.2ml medium/孔（1640）3、培养3天，待病毒表达后，加入最适浓度的puro进行杀伤，同时以一孔正常细胞作为对照。
Lenti-X HTX 慢病毒包装系统操作流程(clontech)
Lenti-X™ HTX 高效慢病毒包装系统操作一览PT5135-2目录重要 (1)存储&处理 (1)转染操作 (2)重要：以下操作是针对Lenti-X 载体，Lenti-X HTX 高效包装系统和Lenti-X 293T 细胞系(Cat. No. 632180)的优化操作。
转染操作需在100 mm 培养板中进行，转染培养基和收集病毒的培养基中需使用Tet System Approved FBS (无四环素污染)。
以下所有操作需在无菌环境下进行，需要使用生物安全等级为2的仪器设备进行病毒操作并做好自身的防护措施。
存储&处理：●使用前，室温解冻Xfect™ Polymer (100 μg/μl)。
解冻后，将Xfect Polymer 置于4°C保存，最多12 months。
●使用前，室温解冻Xfect Reaction Buffe。
解冻后摇匀，将Xfect Polymer 置于4°C保存，最多12 months。
●使用完Xfect Polymer后，盖紧管盖，放回带有干燥剂的锡箔袋。
Figure 1. Lenti-X 293T细胞最优转染密度（左图）和转染后细胞检测时间（右图），转染筛选标记是ZsGreen 绿色荧光蛋白。
转染操作（100 mm板）：1.转染前约24 hr，以4–5 x 10e6Lenti-X 293T细胞/100 mm板的密度接种10 ml细胞，37°C、5% CO2 培养过夜。
转染时的细胞融合度应该为80–90%。
2. 漩涡混匀fect Polymer。
3. 对于每个转染样本，准备2个离心管，按照以下顺序混匀试剂：注意 Xfect Polymer预混液室温放置不要超过30min。
4. 漩涡混匀各管混合物。
5. 将Xfect Polymer预混液和DNA预混液以适中的速度漩涡10sec。
6. 室温孵育10 min，以形成便Xfect/DNA复合物。
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
一、包装细胞293T细胞得培养一、293T细胞得冻存1、随着传代得次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2、在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3、倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留得培养基。
4、加入0、25%得胰酶，消化10-20s后倒去。
5、镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6、细胞计数。
7、将细胞离心，1000rpm，2min。
8、根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10、第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞得传代1、当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好得生长状态。
2、消化细胞，方法同上。
3、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4、分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞得复苏1、当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存得细胞进行复苏。
2、打开水浴锅，设置温度为40℃。
3、查瞧细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存得细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4、将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5、放回37℃、3%CO2与95%相对湿度得培养箱中培养。
6、第二天观察细胞存活率。
倒掉旧得培养基，加入10ml新鲜培养基。
二、慢病毒得包装、浓缩与滴度测定1、所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2、TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems，cat、no、4304437)3、TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems，cat、no、401970)4、TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems，cat、no、4316844)用于包装得293T细胞得培养用于包装得293T细胞(ATCC No、CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
慢病毒包装试剂盒说明书
YRGene 慢病毒包装试剂盒说明书产品编号：LPK010 产品规格：10个10cm 皿 产品简介：赢润生物的慢病毒包装试剂盒包括如下成分：（1） 优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物，可兼容大多数慢病毒表达载体。
（2） 高效转染试剂（Invitrogen Lip2000原装产品分装，293T 细胞转染效率接近 100%）。
（3 ）高效率的慢病毒浓缩液，无需超速离心，也不需要价格昂贵的过滤柱，快速富集病毒粒子，其优 势在于操作安全简单，对设备要求低，产毒效率高，能够快速、高效地收获高滴度病毒。
产品组成：1. 转染前，传代 293FT 细胞于10cm 培养皿中（例如，接种 1 x 107细胞于10cm 培养皿中，使用完全 培养基DMEM+10%FBS培养），当细胞密度能够达到 90-95%即可进行转染。
Tips :培养基里面不要添加抗生素。
2. 转染前1-3小时，更换培养基，加入7ml 新鲜的完全培养基（DMEM+10%FBS ）,注意不要添加抗生素。
3. 准备转染。
在5ml 离心管中，分别配制 A 管与B 管试剂（Tube A and Tube B ）配好后，放置5min ，然后将A 管缓慢加入B 管，混合均匀。
室温放置20min ，使得脂质体-DNA 混合物形成。
Tips :混合后可能会出现淡淡的乳白状，不会影响转染。
然后将混合液逐滴均匀加入 10cm 培养皿，轻微混匀。
置于37C, 5% CO ?培养箱中培养过夜。
4. 第三天，更换培养基，加入 10ml 的完全培养基，同样注意不要加抗生素。
5. 转染后48-72h 后收取上清，转移至 15ml 离心管。
Tips :上清里面含有病毒，请小心操作。
6. 3000rpm 在4C 离心15min ，去除沉淀。
7. 上清液用0.45卩m 滤器过滤后转移到新的离心管中。
慢病毒浓缩：1. 每10ml 过滤后的病毒初始液，加入 Concen Solution 3ml ，每20-30min 混合一次，共进行 3-5次。
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
最新慢病毒包装实验步骤
慢病毒包装实验的要点：1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代；2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多；3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。
尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多；实验前要准备的试剂、耗材和仪器；试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL 转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。
耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。
仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。
第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）；实验前准备：安全柜开紫外灯照30分钟；把培养基和试剂放置常温；消化细胞：从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。
细胞铺板：在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。
放置培养箱中培养48h。
插入铺板后图片刚铺板后铺板1天后第三天：上午细胞转染：细胞铺板48h后，从培养箱取出293FT细胞，倒置显微镜观察，细胞密度达90%左右；吸出原有培养基，沿皿壁缓慢加入8ml完全培养基，放置于培养箱中，待转染。
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基,培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技(上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料(一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒.1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM （含10% FBS).贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0。
25％的胰酶，消化1~2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时,去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中.3、细胞计数，将细胞全部晃下,加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出,置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10% DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共 4 大格,每大格 16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释）,即为实际 n万/mL 细胞浓度.4、细胞离心,1000rpm，5min。
慢病毒包装试剂盒说明书(5个10cm皿)-精简版
YRGene慢病毒包装试剂盒（精简版）说明书产品编号：产品规格： 个 皿产品简介：赢润生物的慢病毒包装试剂盒包括如下成分：（ ）优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物，可兼容大多数慢病毒表达载体。
（ ）高效率的慢病毒浓缩液，无需超速离心，也不需要价格昂贵的过滤柱，快速富集病毒粒子，其优势在于操作安全简单，对设备要求低，产毒效率高，能够快速、高效地收获高滴度病毒。
产品组成：慢病毒包装步骤：转染前，传代 细胞于 培养皿中（例如，接种 × 细胞于 培养皿中，使用完全培养基 培养），当细胞密度能够达到 即可进行转染。
：培养基里面不要添加抗生素。
转染前 小时，更换培养基，加入 新鲜的完全培养基（ ），注意不要添加抗生素。
准备转染。
在 离心管中，分别配制 管与 管试剂（ ）配好后，放置 ，然后将 管缓慢加入 管，混合均匀。
室温放置 ，使得脂质体 混合物形成。
：混合后可能会出现淡淡的乳白状，不会影响转染。
然后将混合液逐滴均匀加入 培养皿，轻微混匀。
置于 ， 培养箱中培养过夜。
第三天，更换培养基，加入 的完全培养基，同样注意不要加抗生素。
转染后 后收取上清，转移至 离心管。
：上清里面含有病毒，请小心操作。
在 ℃离心 ，去除沉淀。
上清液用 μ 滤器过滤后转移到新的离心管中。
慢病毒浓缩：每 过滤后的病毒初始液，加入 ，每 混合一次，共进行 次。
℃放置过夜。
℃， ，离心 。
去掉上清，静置管子 ，吸走残余液体。
加入无血清 充分溶解慢病毒沉淀。
病毒悬液分装成 μ 每份 保存在离心管中，速冻后储存在 ℃。
慢病毒滴度测定：进行慢病毒感染实验之前，我们强烈建议您进行慢病毒滴度检测。
在滴定测定的前一天取 孔板，每孔接种 × 细胞。
加 到新鲜的完全培养基中，使其终浓度为 μ 。
加含有 的完全培养基 倍稀释病毒。
具体操作如下：取一个 离心管（或 孔板），加入 μ 培养基和 μ 待测病毒原液，混合均与后吸取 μ 病毒混合液至第二个离心管（或 孔板第二个孔），混合时尽量不要产生气泡，如此稀释至第八个孔（即稀释 倍）。
Lenti-Pac HIV 慢病毒包装试剂盒 使用手册说明书
Lenti-Pac™HIV慢病毒包装试剂盒使用手册目录1产品概述2试剂盒组成3包装慢病毒颗粒所需的实验材料4慢病毒颗粒转导靶细胞所需的实验材料5实验前的准备6慢病毒颗粒的包装制备原理7制备慢病毒8慢病毒滴度检验9慢病毒感染目的细胞10使用许可与质量保证GeneCopoeia,Inc.广州易锦生物技术有限公司广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器F区8楼邮编：510663电话：4006-020-200邮箱：******************英文网址：中文网址：©2022GeneCopoeia,Inc.HIV（人类免疫缺陷病毒）骨架的慢病毒载体是目前最常用的慢病毒表达载体，它能在体外或体内实验有效介导外源基因转导多种分化或非分化哺乳动物细胞，使外源基因稳定整合靶细胞的基因组，并进行稳定的高水平表达。
GeneCopoeia Lenti-Pac™HIV慢病毒包装系统是安全性较高的第三代慢病毒包装系统，表达载体自身失活，不产生额外的慢病毒复制。
该系统包括：混合包装质粒、EndoFectin™-Lenti转染试剂、可进一步提高滴度的TiterBoost™滴度增强剂、以及eGFP阳性对照质粒。
Lenti-Pac™HIV慢病毒包装系统可将HIV载体的慢病毒表达克隆包装成为具有转导效果的慢病毒颗粒，包装所得的慢病毒颗粒可立即使用，介导目的基因在哺乳动物细胞进行高效表达。
GeneCopoeia提供40000多种人源及小鼠源的慢病毒载体ORF表达克隆，以及针对人源、小鼠源、大鼠源及其他哺乳类动物染色体组靶基因的慢病毒载体shRNA克隆。
除此以外，GeneCopoeia同时提供20000多种人源慢病毒载体miRNA前体表达克隆、miRNA抑制剂表达克隆以及启动子报告克隆，18000种小鼠的慢病毒载体启动子报告克隆。
以上所有克隆均应用HIV骨架，可随时应用于慢病毒包装。
根据疾病控制中心制定的标准，GeneCopoeia第三代HIV慢病毒包装系统满足生物安全第二级别（BSL-2）的要求。
慢病毒包装试剂盒说明书(5个10cm皿)-精简版
YRGene慢病毒包装试剂盒（精简版）说明书产品编号：产品规格： 个 皿产品简介：赢润生物的慢病毒包装试剂盒包括如下成分：（ ）优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物，可兼容大多数慢病毒表达载体。
（ ）高效率的慢病毒浓缩液，无需超速离心，也不需要价格昂贵的过滤柱，快速富集病毒粒子，其优势在于操作安全简单，对设备要求低，产毒效率高，能够快速、高效地收获高滴度病毒。
产品组成：慢病毒包装步骤：转染前，传代 细胞于 培养皿中（例如，接种 × 细胞于 培养皿中，使用完全培养基 培养），当细胞密度能够达到 即可进行转染。
：培养基里面不要添加抗生素。
转染前 小时，更换培养基，加入 新鲜的完全培养基（ ），注意不要添加抗生素。
准备转染。
在 离心管中，分别配制 管与 管试剂（ ）配好后，放置 ，然后将 管缓慢加入 管，混合均匀。
室温放置 ，使得脂质体 混合物形成。
：混合后可能会出现淡淡的乳白状，不会影响转染。
然后将混合液逐滴均匀加入 培养皿，轻微混匀。
置于 ， 培养箱中培养过夜。
第三天，更换培养基，加入 的完全培养基，同样注意不要加抗生素。
转染后 后收取上清，转移至 离心管。
：上清里面含有病毒，请小心操作。
在 ℃离心 ，去除沉淀。
上清液用 μ 滤器过滤后转移到新的离心管中。
慢病毒浓缩：每 过滤后的病毒初始液，加入 ，每 混合一次，共进行 次。
℃放置过夜。
℃， ，离心 。
去掉上清，静置管子 ，吸走残余液体。
加入无血清 充分溶解慢病毒沉淀。
病毒悬液分装成 μ 每份 保存在离心管中，速冻后储存在 ℃。
慢病毒滴度测定：进行慢病毒感染实验之前，我们强烈建议您进行慢病毒滴度检测。
在滴定测定的前一天取 孔板，每孔接种 × 细胞。
加 到新鲜的完全培养基中，使其终浓度为 μ 。
加含有 的完全培养基 倍稀释病毒。
具体操作如下：取一个 离心管（或 孔板），加入 μ 培养基和 μ 待测病毒原液，混合均与后吸取 μ 病毒混合液至第二个离心管（或 孔板第二个孔），混合时尽量不要产生气泡，如此稀释至第八个孔（即稀释 倍）。
慢病毒包装的方法、步骤详细教程分享
慢病毒包装的⽅法、步骤详细教程分享本⽂梳理了慢病毒包装的全部流程，并结合具体实例介绍了慢病毒包装的⽅法、步骤，并对包装过程中的关键点进⾏了细致的分析。
使初学者也能握毫⽆障碍地⾃主完成病毒包装、纯化、滴度测定等实验。
以293T细胞为例：慢病毒感染293T细胞 - 合肥知恩⽣物慢病毒感染293T细胞1.293T细胞分盘转染前⼀天，将已经长好的细胞以合适的⽐例传代到10cm培养⽫中，当细胞长到80%时准备转染，步骤如下：1）弃去培养液，加⼊5 mL 灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞⽣长⾯，然后弃去 PBS 溶液。
2）⽤2 mL 胰蛋⽩酶消化对数⽣长期的293T细胞。
3）以含10%⾎清的培养基调整细胞密度为5 ×106个/10 mL，重新接种于10cm细胞培养⽫中，37 ℃，5% CO2 培养箱继续培养，转染前细胞密度80%左右。
注意：293T细胞的状态⾮常重要，⼀般建议购买新的细胞株后分批多次冻存，以保证每次包装病毒时细胞的代数不会超过10代。
同时尽量不要使⽤国产⾎清。
复苏后的细胞需要传2代后才能进⾏病毒的包装，并且传达后18-24h 需要密度达到80%左右。
2.转染前换液转染前1~2h 将需要转染的细胞换新鲜的培养基，8mL/10cm⽫。
注意：293T细胞贴壁性不是很好，换液时应⼩⼼滴加尽量避免冲起细胞。
3.转染（1）以⼀个10cm平⽫为例，取2个EP管，分别加⼊500 µl⽣理盐⽔，标记为A、B；（2）A管加⼊60µg PEI，并充分涡旋混匀，B管加⼊过表达质粒和两个辅助质粒pSPAX2、pMD2.G，三质粒⽐例为4：3：1，共24µg；（3）将A管PEI加⼊到B管中,轻轻混匀，静置20min；将混合液加⼊细胞中，过夜培养。
注意：质粒提取的质量，包括浓度和纯度。
浓度⾄少要超过500ng/ul，因为浓度低，加⼊的体积就会相应增⼤，会增加细胞污染的风险。
纯度可以使⽤核酸测定仪进⾏检测，260/280在1.8-2.0之间。
吉凯基因慢病毒包装系统说明书
5．慢病毒产品优势 1）感染效率高：与传统的质粒转染相比，慢病毒感染细胞时无需转染试剂，
且转染效率高。 （参见附录：图 1. 质粒转染与慢病毒感染效率比较） 2） 感染谱更广：慢病毒可以高效的感染神经细胞、肝细胞、心肌细胞、内
皮细胞、干细胞、原代细胞等多种通常不容易转染的细胞。（参见附录：图 2. 慢 病毒可以高效感染多种细胞）
吉凯基因慢病毒包装系统使用说明书 Lenti-Easy Packaging System
Catalog Number: LPK001（10 preps）
目录
目 录.....................................................................................................................................3 1．产品组成 ............................................................................................................................. 1 2．储存条件 ............................................................................................................................. 1 3．您还需要准备的其他实验材料 ......................................................................................... 1 4．生物安全提醒 ..................................................................................................................... 2 5．慢病毒产品优势 ................................................................................................................. 2 6．慢病毒系统介绍 ................................................................................................................. 3 7．慢病毒包装流程介绍 ......................................................................................................... 4
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慢病毒包装体系使用说明本说明书适用于以下产品：名称货号慢病毒包装体系KLV3501慢病毒包装体系（含293V细胞）KLV3502慢病毒包装体系（含转染试剂）KLV3503慢病毒包装体系（含293V细胞、转染试剂）KLV3504北京英茂盛业生物科技有限公司Web site：1北京英茂盛业生物科技有限公司/产品内容KLV3501KLV3502KLV3503KLV3504慢病毒载体（过表达或RNA 干扰载体任选一种） 3333辅助载体pH1 3 3 3 3 辅助载体pH2 3 3 3 3 HEK293V 细胞 3 3 Polyfect-V 转染试剂33载体采用质粒形式发货，请在收到质粒后放-20℃冻存，也可以直接转化大肠杆菌感受态进行质粒扩增。
HEK293V 细胞采用干冰或培养瓶发货。
请在收到细胞后根据附带说明书进行复苏或传代。
慢病毒载体慢病毒载体中含有病毒整合和表达所需原件及表达外源目的基因的元件。
外源基因通过载体中的多克隆位点插入慢病毒载体中进行表达。
pLV-EGFP-C 的载体图谱见下，本公司的其它慢病毒载体结构与之基本相似。
其它载体信息见本公司网站 或本说明书后面的附表。
慢病毒包装载体慢病毒包装载体包括pH1和pH2，表达生产病毒颗粒所需的病毒蛋白。
载体图谱见下：HEK293V细胞包装细胞的状态对病毒包装效果有直接影响。
我公司保存的293V细胞为低次代293V细胞，细胞性状稳定。
在高密度下生长3天仍可保持贴壁状态，持续产生病毒颗粒，因此可多次收获病毒，降低病毒包装实验成本。
Polyfect‐V转染试剂Polyfect-V转染试剂专为293V细胞转染及慢病毒包装研制,可以在细胞铺板同时进行转染，缩短病毒包装时间；无需要求细胞处于生长对数期，细胞转染时密度可以很高；细胞毒性极低；质粒和转染试剂用量是普通转染试剂的1/3到1/2等显著优点；包装病毒时转染效率接近100%，能提高病毒产量3-5倍。
3北京英茂盛业生物科技有限公司/慢病毒包装概述：病毒包装前需制备转染级慢病毒载体及两种包装载体。
为保证转染效率，请采用Qiagen转染级试剂盒或类似质量级别试剂盒制备质粒。
以下采用我公司的Polyfect-V转染试剂（货号P2010）为例说明慢病毒包装过程。
您也可以采用其它品牌转染试剂进行慢病毒包装。
转染试剂和质粒用量请参考生产厂家的说明书，也可以通过预实验决定。
无论采用哪种转染试剂，3种载体的相对比例应保持不变。
本例中病毒包装采用10cm培养皿。
如需用其它规格细胞培养器皿进行转染和病毒包装，请根据细胞相对生长面积对培养液体积和转染试剂用量进行相应调整。
试剂293V培养基：DMEM高糖培养基+10%FBS病毒培养基：DMEM高糖培养基+10%FBS，丙酮酸1mM。
Polyfect-V转染试剂转染级慢病毒载体，包装载体pH1及pH2。
快速转染法在此方法中质粒转染和细胞铺板一次完成，传统病毒制备一次需要72至96小时，采用本方法仅需48小时。
制备病毒滴度和传统方法没有差别。
1、漩涡震荡混匀Polyfect-V转染试剂。
2、准备2个离心管，按以下顺序分别制备质粒和转染试剂稀释液。
离心管1（质粒DNA） 离心管2（转染试剂）慢病毒载体5μg Polyfect-V转染试剂 20 μlpH1载体3.75μg DMEM无血清培养基480 μlpH2载体1.25μg 总体积500μlDMEM无血清培养基 X μl总体积500μl3、充分混匀。
4、将转染试剂稀释液（离心管2）加入质粒DNA溶液（离心管1）中，立刻充分混匀。
注意加入顺序非常重要。
5、室温孵育转染混合液15分钟。
6、在孵育转染混合液时，消化HEK293V细胞，用293V培养基制备成0.6×10^6/ml细胞悬液。
根据需要制备的病毒量，将细胞悬液放入15ml或50ml离心管备用。
7、将每1ml转染混合液加入10ml细胞悬液，轻轻吹吸细胞混匀。
8、将细胞悬液加入10cm培养皿，放入37℃培养24小时。
9、去除含有转染试剂的培养基，用10ml病毒培养基换液。
10、转染后48小时收集细胞培养上清。
500g离心10min去除细胞碎片。
该上清可以直接用于慢病毒感染，也可以进行病毒滴度测定或病毒浓缩。
如需长时间保存，可-80℃冻存。
注意每次冻融将导致病毒滴度下降2-4倍。
常规转染法1、转染前24小时，将293V细胞以4-5×106/10cm平皿密度接种，加入10ml 293V培养基37℃，5%CO2培养。
细胞转染前密度应达到90%。
2、漩涡震荡混匀Polyfect-V转染试剂。
3、准备2个离心管，按以下顺序分别制备质粒和转染试剂稀释液。
离心管1（质粒DNA） 离心管2（转染试剂）慢病毒载体5μg Polyfect-V转染试剂 20 μlpH1载体3.75μg DMEM无血清培养基480 μlpH2载体1.25μg 总体积500μlDMEM无血清培养基 X μl总体积500μl4、充分混匀。
5、将转染试剂稀释液（离心管2）加入质粒DNA溶液（离心管1）中，立刻充分混匀。
注意加入顺序非常重要。
6、室温孵育转染混合液15分钟。
7、将1ml转染混合液逐滴加入步骤1准备的细胞培养皿，前后晃动培养皿，充分混匀。
8、37℃培养。
9、4-6小时后，用10ml新鲜的293V培养基换液。
转染后24小时，用10ml病毒培养基换液。
10、转染后48小时收集细胞培养上清。
500g离心10min去除细胞碎片。
该上清可以直接用于慢病毒感染，也可以进行病毒滴度测定或病毒浓缩。
如需长时间保存，可-80℃冻存。
注意每次冻融将导致病毒滴度下降2-4倍。
5北京英茂盛业生物科技有限公司/慢病毒滴度测定在需要用确定的感染复数获得稳定的感染效果时，需要对病毒滴度进行测定。
病毒滴度测定最好直接用收获和纯化的病毒液进行，也可以用冻存的病毒液。
值得注意的是采用不同的细胞系和方法测定的病毒滴度会存在很大差异。
测得的病毒滴度值和感染靶细胞所需的病毒滴度相差可能很大。
但是每次采用相同的方法测定病毒滴度还是可以对病毒包装效果进行一个较为准确的衡量标准。
病毒滴度测定可以采用Realtime-PCR、抗生素筛选细胞克隆法以及流式细胞对荧光细胞进行直接计数等。
也可以采用商业的病毒滴度测定试剂盒。
具体实验方法可以参考(R. H. Kutner, 2009)中的方法进行。
慢病毒感染靶细胞以下方法可用于感染一般贴壁细胞如293V细胞，CHO细胞等。
在病毒感染时添加polybrene可以增加病毒感染效率。
但是polybrene可能对某些细胞系产生毒性。
在使用前可以通过预实验确定合适的polybrene 浓度，一般为4-12μg/ml。
1、感染病毒前18-24小时将细胞以合适的密度接种到培养皿。
2、室温溶解病毒液，混匀。
3、将适量病毒液和polybrene用细胞培养基稀释，加入细胞培养皿中。
4、继续培养24小时，用新的完全培养基替换病毒感染液。
如果病毒液或polybrene对细胞生长有较大影响可以将病毒感染时间缩短至6-8小时。
5、病毒感染后48-72小时可以观测到外源基因表达。
这时细胞可用于荧光检测或加入抗生素筛选稳定细胞株。
慢病毒载体抗性基因 RNA干扰慢病毒载体VL3101 pLVshRNA-EGFP EGFP -VL3102 pLVshRNA-Puro - PuromycinCMV启动子基因过表达载体VL3001 pLV-Puro - Puromycin VL3002 pLV-IRES-Puro - Puromycin VL3003 pLV-IRES-Neo - Neomycin VL3211 pLV-EGFP-N EGFP Puromycin VL3212 pLV-ECFP-N ECFP Puromycin VL3213 pLV-EYFP-N EYFP Puromycin VL3214 pLV-mCherry-N mCherry Puromycin VL3215 pLV-EGFP-C EGFP Puromycin VL3216 pLV-ECFP-C ECFP Puromycin VL3217 pLV-EYFP-C EYFP Puromycin VL3218 pLV-mCherry-C mCherry Puromycin VL3219 pLV-mTomato-C mTomato Puromycin EF1α启动子基因过表达载体VL3311 pLV-EF1α-EGFP-N EGFP PuromycinVL3312 pLV- EF1α-ECFP-N ECFP PuromycinVL3313 pLV- EF1α-EYFP-N EYFP PuromycinVL3314 pLV- EF1α-mCherry-N mCherry PuromycinVL3315 pLV- EF1α-EGFP-C EGFP PuromycinVL3316 pLV- EF1α-ECFP-C ECFP PuromycinVL3317 pLV- EF1α-EYFP-C EYFP PuromycinVL3318 pLV- EF1α-mCherry-C mCherry PuromycinVL3319 pLV- EF1α-mTomato-C mTomato Puromycin查询更详细的产品信息请访问本公司网站：7北京英茂盛业生物科技有限公司/。